Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

امتصاص المعادن الأساسية في البكتيريا سلبية الغرام: الأشعة السينية الأسفار، النظائر المشعة، والخلية تجزئة

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/57169
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2, 4
1Graduate Biomedical Sciences Microbiology Theme, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Radiology, University of Alabama at Birmingham, 3Office of the Provost, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Summary

بروتوكول لاستخراج كوصي بيريبلاسميك انتقال المعدن في سياق شركائها الربط الأصلية، وتوصيف البيوفيزيائية محتوياته الركيزة بالاقبال على الأسفار وراديوميتال ويرد بالأشعة السينية.

Abstract

ونحن تثبت أسلوب قابلة للفصل بين بيريبلاسم البكتيرية من السيتوبلازم. يتم استخدام هذا الأسلوب لتنقية البروتين بيريبلاسميك غرض توصيف الفيزيائية، وتدبير الركازة نقل بين الأقسام بيريبلاسميك وحشوية. عن طريق الحد من الوقت الذي يفصل في بيريبلاسم من السيتوبلازم بعناية، يمكن استخراج بروتين اهتمام المجرب والاعتداء كل حجرة منفردة للركيزة دون تلوث المرحل بين الأقسام. ثم يمكن أن تحلل البروتين المستخرج من تجزئة لتصميم هيكل ثلاثي الأبعاد أو ملامح الركازة ملزمة كذلك. وبدلاً من ذلك، يمكن تنفيذ هذا الأسلوب بعد الحضانة مع راديوتراسير تحديد إجمالي نسبة الإقبال، فضلا عن التوزيع للتتبع (والمعادن ومن ثم النقل) عبر الأقسام البكتيرية المختلفة. يمكن أن يساعد التجريب مع راديوتراسير التفريق بين الركيزة الفسيولوجية والركيزة أرتيفاكتوال، مثل تلك التي تسببها ميسميتاليشن.

يمكن استخدام الأشعة الفلورية اكتشاف وجود أو غياب التأسيس معدنية في عينة، فضلا عن قياس التغيرات التي قد تحدث في إدراج معدنية كمنتج ظروف النمو وظروف تنقية، و/أو ظروف التبلور. كما يوفر fluorescence الأشعة السينية قياس نسبي لوفرة لكل معدن، التي يمكن استخدامها لتحديد أفضل ذروة امتصاص الطاقة المعدنية لاستخدامها لجمع البيانات تبعثر الأشعة السينية الشاذة. امتصاص راديوميتال يمكن استخدامها كوسيلة للتحقق من طبيعة الركازة الكشف عنها بواسطة الأشعة السينية fluorescence الفسيولوجية، فضلا عن دعم اكتشاف ركائز الرواية.

Introduction

في بكتيريا سلبية الغرام، زادت هيولى تجمعات من ذرات المعادن الانتقالية وتتجدد المستوردين (ATP ملزم كاسيت) ABC الغشاء الداخلي التي تخفف من إزفاء معدنية عبر الغشاء الداخلي. بيريبلاسميك الكتلة A-1 الركازة ملزم البروتينات (سببس) إنشاء مجموعة من مرافقين التي تربط ذرات المعدن مباشرة والعبارات لهم عن طريق بيريبلاسم تسليمها ل المستوردين ABC المشابهة1. مجموعات أخرى "من سببس" مخصصة لنقل ركائز، مثل المعادن الكلاب (الكتلة A-2) والكربوهيدرات (ب الكتل و D-1)، والأحماض الأمينية (مجموعات ب وج F-2 و F-4)؛ ومع ذلك، بغض النظر عن الركازة، اتبع سببس المحافظة تقحم إضعاف المشبك ج2. ويشمل المعمم الآلية المقترحة لنقل الركيزة الاستراتيجية والخطة الاستشرافية تمر بسلسلة من الالتواءات التي تشبه فينوس صائدة الذباب3ج-المشبك. عموما، تنقية سببس A-1 الكتلة في نموذج (معادن-منضم) هولو، على الرغم من أن دراسة هذه سببس محدود بالصعوبة في توليد من البروتين للتجريب4أشكال apo (الخالية من المعدن). وحتى الآن، استراتيجيات لدراسة الاشتقاق الكتلة سببس A-1 اقتصرت على الطفرات والغسيل الكلوي وتمسخ الجزئي مع الإيثيلين حمض (يدتا) تشيلاتور5،6،،من78 , 9 , 10 , 11-تشير البيانات الهيكلية الناشئة من هذه التجارب أن الكتلة A-1 سببس قد لا تتبع التحديد إليه فينوس صائدة الذباب. حاليا في عداد المفقودين من الأدب أسلوب إنتاج apo سببس A-1 الكتلة في فيفو استخدام الشركاء ملزمة الفسيولوجية.

نظهر للمرة الأولى باستخدام تجزئة الخلية إلى تنقية إيفا، الكتلة A-1 الاستراتيجية والخطة الاستشرافية من واليرسينيا بيستيس، وكيل المسببة للطاعون، التي تم تحويلها إلى شكل الاشتقاق من خلال التفاعل مع المستورد "يفيبكدي أي بي سي" عن فسيولوجية المشابهة في الخلية. وتبين أننا إيفا في شكل الاشتقاق بالطاقة المشتتة مطيافية الأشعة السينية (EDS)، يعرف أيضا باسم الأشعة الفلورية. كما نبدي وظيفة يفيبكدي عن طريق الجمع بين وجود خلية مع دراسات امتصاص المعادن المشعة شديدة الحساسية للتمييز بين امتصاص المعادن عبر الغشاء الخارجي واستيراد المعادن عبر الغشاء الداخلي. يسمح استخدام الراسم المشعة للكشف عن كميات المعادن، أقل بكثير من الحد الأقصى للكشف عن جزء من الغرام/لتر لتقنيات هذه مقرونة الحث البلازما الكتلي (برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد) أو مطيافية الامتصاص الذري (العاص). وهذا يسمح للحد الأدنى من اضطراب النظام قيد الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، الأساليب التقليدية المذكورة غالباً ما تتطلب زيادة حجم العينة وتجهيز إضافية وأوقات أطول في الدوران، التي ليست نموذجية لفحوصات radiotracer. وهكذا، يوفر استخدام راديوتراسير طريقة مريحة وواضحة لرصد توزيع المعادن وامتصاص داخل خلية. أنه ما زال يتعين تحديد إذا كان الاشتقاق "الاستراتيجية والخطة الاستشرافية A-1 الكتلة" المنتجة باستخدام هذا الأسلوب أن اردد ملاحظات الهيكلية من الممارسات الحالية المستخدمة لتوليد البروتين الاشتقاق.

تجزئة الخلية الطريقة المتبعة لفصل المكونات الخلوية لغرض ضمني على وجه التحديد سبر محتوياتها في معزل عن12. وجود خلية يستخدم عادة لتأكيد موقع جزيء خلال دورة الخلية أو قياس نشاط حجرة خاصة13. على سبيل المثال، يمكن جزيئي نشاط النقل معدنية بسبر مقصورات الهاتف الخلوي للركيزة المعدنية. ويتيح إدماج تجزئة الخلية التمييز والمقارنة بين امتصاص المعادن عبر الغشاء الخارجي ونقل المعادن عبر الغشاء الداخلي. ثم يمكن بدوره قياس هذه العمليات على مر الزمن. في حالة تنقية البروتين، الأساليب الأكثر شيوعاً لتحلل الخلية وفصل المكونات القابلة للذوبان من مكونات غير قابلة للذوبان تعطل الميكانيكية (أي طحن، ومزج)، تجانس عالي الضغط (أي الصحافة الفرنسية الضغط الخلية، الخلية ديسروبتير)، وترددات الموجات فوق الصوتية (أي.، سونيكيشن)14. استخدام ترددات الموجات فوق الصوتية الخلايا عموما الأنسب لكميات صغيرة؛ ومع ذلك، المعروف سونيكيشن لتوليد الحرارة المفرطة التي يمكن أن تؤذي البروتين. لتجنب توليد الحرارة المفرطة، وترددات الموجات فوق الصوتية تطبق عادة في رشقات نارية قصيرة متتابعة، التي يمكن أن تكون مضيعة للوقت ودون قصد تتحلل جزيئات الحمض النووي إلى أجزاء أصغر. بالإضافة إلى ذلك، متعددة sonication مكلفة المسابير قد يكون مطلوباً للتجارب التحضيرية والتحليلية، كما كل التحقيق على نطاق محدود لحجم العينة التي يمكن معالجتها. ويتجنب استخدام الضغط العالي خلايا توليد الحرارة المفرطة أثناء تحلل الخلية التي تقشعر لها اﻷبدان مكونات الصحافة خلية الضغط الفرنسي قبل تفسخ أو تعمل disruptor خلية في بيئة باردة مثل غرفة باردة. مثل المجسات سونيكاتيون، قد تحتاج مجموعات متعددة من الضغط الفرنسي خلية الصحافة المكونات التي سيتم شراؤها لمعالجة مجموعة واسعة من أحجام العينة. الضغط الفرنسي خلية الصحافة التجميعات سهلة للاتصال ولكن محرجا لتشغيل والنظيفة، ويمكن أن تكون ثقيلة لنقل وعرضه لانسداد من عينات كثيفة. وتشمل مزايا لاستخدام ترددات الموجات فوق الصوتية ونظم ذات الضغط العالي إلى الخلايا الانتعاش عينة عالية، والقدرة على معالجة عينات متعددة مع الحد الأدنى من التلوث المتبادل، وقابل للتعديل القص القوة، التي يمكن تكييفها لتحلل الأمثل من مجموعة واسعة من أنواع العينات. يمكن أن يحدث التحسين عن طريق ضبط تردد الموجات فوق الصوتية، مدة رشقات نارية، ومكبس الضغط جنيه لكل بوصة مربعة (psi)، وعدد من يمر من خلال الصحافة. قد يكون استخدام تعطل الميكانيكية الخلايا الاستراتيجية تافهة من الناحية التقنية الأكثر والأقل تكلفة لتحلل الخلية. يمكن أن تشكل تحديات في استعادة عينة اختلال ميكانيكية وليست مثالية لتجهيز عينات متعددة. اختلال ميكانيكية الطف لعينات من ارتفاع الضغط أو ترددات الموجات فوق الصوتية، ولكن ليست عالية الإنتاجية ومعرضة لتحلل عدم كفاءة. حد تجريبية هامة تعطل الميكانيكية وتجانس الضغط العالي وترددات الموجات فوق الصوتية، هو تعطل البنية الخلوية كامل لا يمكن السيطرة عليها مثل أن يتم خلط جميع مكونات الخلية مائي بعد تحلل، معا. وعلاوة على ذلك، عدم تعطيل كل خلية المقصورات في نفس الوقت؛ ولذلك، محتويات مقصورات التي ليس في وقت مبكر يمكن أن تخضع القوات الهدامة الجارية أطول من محتويات مقصورات التي ليس في وقت متأخر. تجزئة الخلية يسمح لغير مكلفة، من الناحية الفنية مباشرة، كفاءة المستندة إلى حجرة فصل محتويات الخلية مع تجنب الحاجة إلى معدات غالية الثمن وعينه التعرض لقوى قاسية ومدمرة.

في حالة الاستراتيجية والخطة الاستشرافية، الركيزة المستوردة مجددا إلى احتمال apo البروتين وتجدد هولو البروتين خلال تحلل، قبل المصب اللوني أو غيرها من تقنيات تنقية. إدراج chelator يدتا أثناء تحلل يعرض عقبة إضافية، حيث تقارب معدنية كخطوة أولى لتنقية البروتين غير ممكن لأن يدتا سوف قطاع المعادن من الراتنج اللوني ومنع البروتين ملزمة15. حل بسيط وغير مكلف تجزئة الخلية بصدمة ناضح، فيها الطرد المركزي التفاضلي والكواشف المختبرية المشتركة تمكين المحقق لاستخراج البروتين الكافي للتحليل الوظيفي بعناية. ويستخدم تجزئة الصدمة ناضح تغيير خطوتين في الضغط الاسموزي لفصل المكونات الخلوية. أولاً، يؤدي المخزن مؤقت مكثف الخلايا كريناتي إلى الماء يترك كل خلية، وثانيا، مخزن مؤقت ناقص التوتر يسبب الخلايا إلى تضخم كما تدخل المياه إعادة كل خلية. عن طريق التحكم بدقة متى تضخم الخلايا، الأغشية الخارجي يمكن أن يكون انتقائيا تفكيك (بسبب تراكم الضغط الاسموزي من المياه الواردة)، وبالتالي إفراغ محتوياتها في المخزن المؤقت. وتكفل الحفاظ على الأغشية الداخلية التي يتم الاحتفاظ في جدارها محتويات هيولى، ومفصولة بسهولة من محتويات بيريبلاسميك بالطرد المركزي.

يفيا بوليسبيسيفيك قادرة على ربط الحديد والمنغنيز والزنك ذرات16الاستراتيجية والخطة الاستشرافية. الارتفاع النسبي للمعادن مدمجة يمكن تعديلها وفقا لمكملات المعادن في النمو، وجزيئي بالأشعة السينية الأسفار مثل يتوفر في مختبر أرغون الوطني المصدر فوتون متقدمة16. الأسفار الأشعة السينية تمكن المحقق للشخصية بسرعة جمعية واسعة من المعادن دون الحاجة إلى كبيرة أو بلورات نوعية الحيود، وحتى يمكن استخلاص البيانات من البروتين حل متعجل أو البروتينية.

Fluorescence الأشعة السينية يمكن بسرعة تكشف عن نتائج غير متوقعة، في هذه الحالة، إيفا الركيزة الأساسية يجري الزنك وغير موثقة من ركائز الفسيولوجية الحديد أو المنجنيز16. إذا تم استخدامها قبل جمع البيانات تبعثر الأشعة السينية، الأشعة الفلورية يمكن إبلاغ المحقق في التصميم التجريبي، مثل الذي edge(s) الطاقة المعدنية لاستخدامها لجمع البيانات تبعثر الأشعة السينية الشاذة. فقط مفيدة مثل تحديد الوفرة النسبية للأسفار الأشعة السينية معدنية، يمكن أيضا تحديد ما إذا كان معدن غائبة في عينة، توفر طريقة سريعة لفصل بلورات معدنية تحتوي على بروتين الاشتقاق من البروتين هولو، وتقدير قوة الإشارة دون الحاجة إلى تجهيز البيانات وقتاً طويلاً. عند تحديد عينة مع إشارة قوية بمعادن، يمكن تحديد الطول الموجي دقيقة لاستخدامها لجمع البيانات تبعثر الأشعة السينية الشاذ بواسطة المسح الضوئي المتعددة-الطول الموجي التشتت الشاذ (جنون).

هذا البروتوكول مفصلاً يهدف إلى مساعدة المجربون جديدة بنجاح تنفيذ تجزئة الخلية والاستخدام الفعال للأجهزة بيمليني السنكروتروني الشخصية مجموع المحتوى المعدني والنهوض بدراسة البروتينات المعدنية ملزم.

Protocol

1-ثقافة كاتب البكتيرية (1 يوم)

  1. في قارورة 200 مل مشطوف الحواف، تطعيم 30 مل مرق "لوريا بيرتاني" (رطل) مع سلالة الإشريكيّة القولونية (DE3) BL21-كودونبلوس-RIPL الخلايا التي تحتوي على pYFE3 بلازميد16.
  2. إضافة 30 ميليلتر من الأمبيسلّين 50 ملغ/مل لقارورة يسفط مع ماصة و 200 ميليلتر تلميح. هزة بين عشية وضحاها 225 لفة في الدقيقة في 37 ˚C.

2-تكملة M9 إعداد الحد الأدنى من وسائل الإعلام (يوم 2)

ملاحظة: هذا مقتبس من دليل أمريسكو.

  1. إعداد 6 لتر من سائل الإعلام بالإجراء التالي. في ل 2 قارورة مشطوف الحواف، إضافة ز 10.5 M9 أدنى وسائل الإعلام إلى 1 لتر نقية فائقة ح2اﻷوتوكﻻف سين في ˚C 121 لمدة 20 دقيقة وثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. أسيبتيكالي إضافة الملحق العقيمة الحلول التالية: 2 مل/لتر 1 م MgSO4، 10 مل/لتر من 20% w/v الجلوكوز، 0.1 مل/لتر من كاكل 1 م2، و 1 مل/لتر من الأمبيسلّين 50 ملغ/مل. تنفيذ هذه الخطوة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء للحفاظ على بيئة معقمة. الحارة وسائط الإعلام إلى 37 ˚C.

3-البكتيرية ثقافة فرعية

  1. إضافة 5 مل/لتر بين عشية وضحاها كاتب الثقافة M9 أدنى وسائل الإعلام التي يسفط مع تلميح ماصة ومل 5 الآلي. اهتز ثقافة فرعية بشكل مستمر 225 لفة في الدقيقة في ˚C 37 ح 9.
    ملاحظة: أثناء هذه الخطوة يفيابكدي هو أوفيريكسبريسيد من أوتويندوكتيون من أصلي المروج بيستيس يوسف .
  2. استعادة الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 4,500 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 ˚C. ريسوسبيند الخلايا في 50 مل حلاً العازلة الفوسفات المثلج (الرقم الهيدروجيني 20 مم نا2هبو4 7.6، 50 مم كلوريد الصوديوم) قبل يسفط مع ماصة وتلميح 1 مل، وتجميد بين عشية وضحاها في ˚C-80.

4-خلية تجزئة (اليوم الثالث)

  1. ذوبان الجليد استثارة في خلايا 4 درجات مئوية وبيليه في 4,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. ريسوسبيند الخلايا في 50 مل من المثلج العازلة الملح عالية (200 ملم تريس-HCl pH 8.0، 400 ملم كلوريد الصوديوم، ويدتا 2 مم) التي يسفط مع تلميح ماصة و 25 مل الآلي. احتضان التعليق على الجليد لمدة 20 دقيقة، مع انعكاس عرضية للخلط.
  2. بيليه الخلايا في 4,500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. ريسوسبيند الخلايا في 50 مل من المثلج العازلة الملح منخفضة (10 ملم تريس-HCl pH 8.0) من يسفط مع تلميح ماصة و 25 مل الآلي. احتضان التعليق على الجليد لمدة 20 دقيقة، مع انعكاس عرضية للخلط.
  3. بيليه جدارها في 4,500 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. استعادة المادة طافية المحتوية على بيريبلاسم. ريسوسبيند جدارها الأعلاف في المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (3.2 خطوة) التي يسفط مع تلميح ماصة و 25 مل الآلي، والخلايا بثلاث دورات من الضغط الفرنسي خلية الصحافة في 1500 رطل/بوصة مربعة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون محرجا تعمل صحفي خلية ضغط فرنسي ويستخدم مضخة هيدروليكية لمحرك تحلل الخلية. كن حذراً عند إشراك المضخة الهيدروليكية، ضمان التوافق السليم للمكبس مع الصحافة، والحفاظ على أيدي خالية من المضخة الهيدروليكية.
  4. بيليه الحطام الخلوية في 50,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. استعادة المادة طافية تحتوي على السيتوبلازم. إذا لزم الأمر، الأغشية الخارجية والداخلية يمكن أن تكون زيادة هورمونات16.

5-البروتين التنقية باستخدام فبلك

  1. فورا بعد تجزئة، تصفية الكسر بيريبلاسميك استخدام وحدة غشاء 0.45 ميكرومتر. استخدام عامل تصفية حقنه قفل اللوير لسهولة وسرعة الترشيح. حجته عمود صرف شاردة 5 مل ف استخدام 20 مم تريس درجة الحموضة 7.6، 0.05% w/v نان3 تحميل المخزن المؤقت في فلووراتي من 5 مل/دقيقة.
  2. تحميل فيلتراتي بيريبلاسميك على عمود الصرف شاردة متوازن قبل 5 مل ف استخدام 20 مم تريس درجة الحموضة 7.6، 0.05% w/v نان3 تحميل المخزن المؤقت في فلووراتي من 2 مل/دقيقة متابعة ليغسل 5 مل ف شاردة تبادل العمود باستخدام 20 مم تريس درجة الحموضة 7.6 ، 0.05% w/v نان3 تحميل المخزن المؤقت حتى يتم تحقيق قراءة خط أساس A280 في فلووراتي من 5 مل/دقيقة.
  3. الوت البروتين ملزمة باستخدام 20 مم تريس درجة الحموضة 7.6، 0.05% w/v نان3، 0-1 م كلوريد الصوديوم بكميات عمود ما يزيد على 10 التدرج الخطي في فلووراتي للجمع بين الكسور التي تحتوي على ذروة280 5 مل/دقيقة. إيفا Apo التيس بين كلوريد الصوديوم 200 و 300 ملم كلوريد الصوديوم.
  4. تركز النذرة بمركَّزات الطرد المركزي حتى يصل الحجم ~ 5 مل.
  5. حجته pg 200 سوبيرديكس هلام ترشيح عمود مع مم 20 مكررا-تريس pH 6.3، 50 مم كلوريد الصوديوم، 0.05% w/v نان3 هلام الترشيح المخزن المؤقت في فلووراتي من 2.5 مل/دقيقة.
  6. تحميل شاردة يتركز تبادل النذرة على العمود pg 200 سوبيرديكس هلام متوازن قبل الترشيح وتنقية استخدام هلام الترشيح العازلة من 5.5 خطوة في فلووراتي من 2.5 مل/دقيقة تجمع بين الكسور التي تحتوي على280 ذروة الموافق ~ 30 كيلودالتون (كاتشين) البروتين.
    ملاحظة: الإشارة التالية مثال التجربة فبلك لإظهار بروتوكول17.

6-البروتين تبلور

  1. تركز النذرة الترشيح جل من مركزات الطرد المركزي لتركيز بروتين نهائي من 22 ملغ/مل.
    1. حساب تركيز البروتين بقسمة A280 قراءة بواسطة 1.276 ملغ/مل. تم توقع هذا معامل الانقراض النظرية بروتبارام اكسباسي18.
      ملاحظة: ألف280 عينة قراءة 5.104 يتوافق مع الاتحاد الأفريقي لحل 4.000 ملغ/مل؛ 5.104 الاتحاد الأفريقي ÷ 1.276 مغ/مل = 4.00 ملغ/مل.
  2. ميليلتر 1.5 مزيج من البروتين مع 1.5 ميليلتر من 30% w/v ربط 4000، كلوريد الصوديوم، 50 مم 20 مم مكررا-تريس pH 6.3، 0.05% w/v نان3 في الجلوس إسقاط أو تعليق الإعداد الإفلات من يسفط مع ماصة و 10 ميليلتر تلميح.
  3. احتضان قطرات تبلور في 293 كلفن لمدة 2-4 أسابيع.
  4. فلاش-تجميد البلورات في تجمع النتروجين السائل للشحن إلى السنكروتروني.

7-الأشعة السينية الفلورية (باستخدام البرمجيات بيمليني جنرال موتورز/كاليفورنيا)

  1. انتقل إلى علامة التبويب القفص استخدام الطاقة العنوان الفرعي مجموعة الطاقة إلى 10.0 كيلو إلكترون فولط.
  2. انتقل إلى علامة التبويب المسح الضوئي انتقل إلى التبويب التفاعلية جبل عينة.
  3. حدد إشارة أمثلية الأسفار. إدخال 4.00 s تحت العنوان الفرعي الوقت . حدد تأخذ الطيف الأسفار. عرض الطيف باستخدام التبويب الأرض .

8-جنون المسح الضوئي لذروة امتصاص الطاقة المعدنية (باستخدام البرمجيات بيامليني جنرال موتورز/كاليفورنيا)

  1. نقل العينة من شعاع. انتقل إلى علامة التبويب المسح الضوئي انتقل إلى علامة التبويب الجدول الدوري حدد K-حافة عنصر فائدة.
    ملاحظة: قيمة الطاقة في عنوان فرعي الطاقة في eV.
  2. انتقل إلى علامة التبويب القفص استخدام الطاقة العنوان الفرعي لتعيين الطاقة إلى القيمة في "الخطوة 8، 1" في كيلو إلكترون فولط.
  3. نقل العينة إلى الشعاع. انتقل إلى علامة التبويب المسح الضوئي انتقل إلى علامة التبويب السيارات s 2.00 الإدخال تحت العنوان الفرعي الوقت .
  4. حدد بدء المسح الضوئي. أعرض جنون المسح الضوئي باستخدام علامة التبويب الأرض .
    ملاحظة: تكون قيمة الطاقة في العنوان الفرعي الذروة في eV بدلاً من كيلو إلكترون فولط.
  5. حدد عمله مع الأسفار.
  6. نقل العينة من الحزم. انتقل إلى علامة التبويب القفص استخدام الطاقة العنوان الفرعي مجموعة الطاقة إلى القيمة في الخطوة 8.4 تقريبها إلى eV المقبل (أي، ذروة: ف. 9658.3، مجموعة الطاقة إلى 9659 eV).
  7. نقل العينة إلى الشعاع. جمع مجموعة من البيانات. كرر الخطوة 8، 1-8، 6 لجميع المعادن ذات الأهمية.

9-التحليل البروتوكول مقايسة الامتصاص المعادن المشعة

  1. تلقيح في أنبوب ثقافة 14 مل، 5 مل رطل مع سلالة كولاي BL21-كودونبلوس (DE3)-RIPL الخلايا التي تحتوي على pYFE3 بلازميد16. إضافة 5 ميليلتر من 50 ملغم/مل الأمبيسلّين يسفط مع ماصة و 10 ميليلتر تلميح. اهتز 225 لفة في الدقيقة في ˚C 37 ح 7.
  2. بيليه الخلايا في 15,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية. تغسل الخلايا الموجودة في 1 مل تستكمل M9 وسائط الحد الأدنى من يسفط مع تلميح ماصة و 1 مل. كرر مرة واحدة.
  3. في أنبوب 50 مل مخروطية، تستكمل خلايا فرعية إلى 30 مل M9 أدنى وسائل الإعلام يسفط مع تلميح ماصة و 1 مل. اهتز 225 لفة في الدقيقة في ˚C 37 ح 9.
  4. تحديد مقدار النشاط الإشعاعي المطلوبة لتحقيق حوالي 100,000 التهم في الدقيقة (cpm).
    ملاحظة: هذا سوف تختلف تبعاً للنظائر المشعة والأداة المستخدمة للكشف. على سبيل المثال، يعطي عينة تحتوي على كيلوبيككويريل 7.4 (بيكيريل) (0.2 ميكروكوري (µCi)) من 52دقيقة بقراءة لظهور 550,000 على كشف الآلي غاما (ناي). وهكذا، يمكن تحديد مقدار النشاط الإشعاعي اللازمة للحصول على عدد ظهور 100,000 باستخدام المعادلة التالية: (100,000 cpm/550,000 cpm) * 7.4 بيكيريل (0.2 µCi) = 1.35 بيكيريل (0.036 µCi).
    تنبيه: نتائج تسوس المشعة في الإفراج عن الإشعاعات المؤينة، وخطرة. عند العمل مع النشاط الإشعاعي دائماً استخدام التدريع المناسبة واتباع المبادئ من منخفضة كحد معقول يمكن تحقيقها (الأرا) بزيادة المسافة والدروع مع تقليل زمن التعرض للضوء. فقط من الموظفين المدربين وينبغي التعامل مع النشاط الإشعاعي في المختبرات المعينة خصيصا والتي تكون مرخصة لاستخدام المواد المشعة.
  5. مضاعفة النشاط الإشعاعي المطلوب حسابها في الخطوة 9.4 بالحجم الإجمالي لثقافة فرعية، لتحديد المبلغ الإجمالي للنشاط الإشعاعي اللازم. إضافة هذا المبلغ (يفضل أن يكون ذلك في كمية صغيرة من 50-100 ميليلتر) إلى الأنبوبة التي تحتوي على ثقافة فرعية حيث لا توجد 100,000 cpm مليلتر، ودوامه جيدا لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: لمل 31 من ثقافة فرعية، المبلغ الإجمالي للنشاط الإشعاعي المطلوب 1.35 بيكيريل (0.036 µCi) × 31 مل = 41.3 بيكيريل (1.12 µCi).
  6. أنابيب قاسمة 1 مل من ثقافة فرعية (تتضمن الآن الراسم المشعة) إلى الطرد الفردي 1.5 مل من يسفط مع تلميح ماصة و 1 مل، ويتطابق مكان في ثيرموميكسير 37˚C، مع فورتيكسينج في 1 × زاي تشمل ما يكفي من الأنابيب حيث أن هناك ثلاثة لكل المطلوب القياس، فضلا عن ثلاثة replicates إضافية لاستخدامها كمعايير (جانبا للمعايير، لا تقوم بتنفيذ الفحص وجود المعايير).
    ملاحظة: المعايرة في 1 و 2 و 4 ح سيتطلب 12 أنابيب الكلي.
  7. بعد الحضانة، الطرد المركزي هذه الأنابيب في 15,000 ز × 30 s باستخدام أجهزة الطرد مركزي benchtop (يفضل تبريد ل 4 ˚C) وتجاهل في سوبيرناتانتس.
  8. تعليق إعادة الخلايا الموجودة في 1 مل من الجليد الباردة، والملح عالية المخزن المؤقت (الخطوة 4.1) التي يسفط مع تلميح ماصة و 1 مل، ووضع فورا على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  9. بيليه الخلايا مرة أخرى في 15,000 ز × 30 s باستخدام أجهزة الطرد مركزي benchtop (يفضل تبريد ل 4 ˚C) وتجاهل في سوبيرناتانتس.
    ملاحظة: تتضمن المادة طافية المعدن الحرة غير مقترنة.
  10. تعليق إعادة الخلايا في الجليد الباردة، والملح منخفضة المخزن المؤقت (4.2 الخطوة) يسفط مع تلميح ماصة و 1 مل، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: من المهم نضح بلطف عبر ماصة لهذه الخطوة.
  11. بيليه الخلايا في ز × 15,000 لمدة 30 ثانية، وجمع كل من سوبيرناتانتس إلى جديد 1.5 مل الطرد المركزي أنابيب. ينبغي أن يكون هناك الآن ست أنابيب كل الوقت نقطة.
    ملاحظة: المادة طافية على كسر بيريبلاسميك وتحتوي على بيليه غشائي و الكسر هيولى. نشير إلى بيليه الكسر هيولى.
  12. قياس النشاط الإشعاعي في كل جزء (ست أنابيب كل نقطة الوقت)، فضلا عن المعايير التي توضع جانبا في "الخطوة 9، 6". استخدام مقدار النشاط الإشعاعي في المعايير لتحديد المبلغ الإجمالي للنشاط الإشعاعي إضافة الأصل لكل عينة.
  13. لتحديد النسبة المئوية لامتصاص المشعة في بيريبلاسم، تستخدم المعادلة التالية: (cpm متوسط لكسر بيريبلاسميك/معدل cpm المعايير) x 100.
  14. لتحديد النسبة المئوية لامتصاص المشعة في السيتوبلازم، تستخدم المعادلة التالية: (cpm متوسط من ظهور هيولى الكسر/المتوسط للمعايير) x 100.
  15. لتحديد امتصاص مجموع %، تستخدم المعادلة التالية: ((cpm متوسط من كسر بيريبلاسميك + متوسط cpm الكسر هيولى المقابلة)/(متوسط ظهور المعايير)) x 100.

Representative Results

جمعت جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وهلام الترشيح تشروماتوجرامس تقييم جودة لتنقية البروتين من تجزئة محضرة periplasm. تنقية هولو إيفا وقد سبق وصف16؛ ومع ذلك، لم تبلغ تنقية apo إيفا. استراتيجية لتنقية apo إيفا الموصوفة بهذا الأسلوب يستخدم بنية المؤتلف البرية نوع يحتوي على علامة تقارب من أي نوع، لا سيما تلك التي يمكن أن تستخدم للبروتين إيمونوبلوت (أي صاحب العلامة)، وجسم [مونوكلونل] أن تسلم إيفا لا يوصف. ولذلك، استخدم تحليل الطيف الكتلي للتحقق من تنقية إيفا. لتنقية إيفا بتجزئة، من المستحسن استخدام تدرج خطي شطف لشاردة تبادل اللوني (الشكل 1). التدرج الخطي شطف تحسن كبير في إثراء إيفا من يشكلون حوالي 8% الكسر periplasm إلى 49 في المائة المنتج تبادل شاردة محسوبة بقياس كثافة (الشكل 1). هذا التكوين هو تحسين إلى 61% هلام الترشيح، وحجم شطف من البروتين apo متطابقة إلى وحدة التخزين شطف من البروتين هولو (الشكل 2). يتحقق تحليل الطيف الكتلي من تنقية يفيا من خلال الكشف عن 92.5 في المائة من 50 ببتيد فريد الأطياف والببتيدات فريدة 24، تسلسل الأحماض الأمينية يفيا ويفيا مجموع 246 ببتيد الأطياف. بدلاً من ذلك، على النقيض من المنتج التدرج الخطي مع المنتج من شطف تدرج خطوة، تمت تنقية يفيا بتبادل شاردة باستخدام خطوة غسيل من 50 مم كلوريد الصوديوم يتبع خطوة شطف من 250 ملم (الشكل 1) كلوريد الصوديوم. التدرج خطوة هامشية يثري إيفا من تأليف 17% كسر بيريبلاسم إلى 18 في المائة المنتج تبادل شاردة محسوبة بقياس كثافة. كما يثري شطف التدرج خطوة عصابة ملوث بروتين الكتلي التي حددت كالتي تحتوي على سببس كولاي متعددة لنفس الوزن الجزيئي. بسبب حدود القرار pg 200 سوبيرديكس هيلواد 26/600، التشابه في الأوزان الجزيئية وهياكل لتلويث سببس، تحسنت هلام الترشيح هامشيا تخصيب إيفا إلى 20% من المنتج هلام الترشيح. وينبغي تدرج خطي شطف بعيد المنال لتبادل شاردة، يوصي باستكشاف متعددة الخطوة يغسل تزايدات كلوريد الصوديوم 25-50 مم لتحديد تركيز كلوريد الصوديوم اللازمة لإزالة هذه الملوثات.

يفيا apo المنقي وهولو تتبلور في نفس ظروف التبلور، على الرغم من أن الصور من الاشتقاق وهولو يفيا كريستال مورفولوجيس إظهار الاختلافات في نمو البلورات بين الاشتقاق وهولو يفيا الدول (الشكل 3). بالإضافة إلى التحقق الكتلي، وأكدت البيانات حيود الأشعة السينية (غير معروضة) التي تم جمعها من بلورات نمت من البروتين المنقي بهذا الأسلوب على تنقية وبلورة يفيا. ويمكن تقييم مدى تلوث حجرة (هيولى الزنك العودة apo للبروتين هولو في الكسر بيريبلاسم) بالتقاط الأطياف fluorescence الأشعة السينية (الشكل 4). نظراً لأن الزنك هو الركيزة الأساسية منضم إلى المؤتلف إيفا16، الأطياف fluorescence الأشعة السينية يمكن سرعة التفريق بين عينة إيفا التي تحتوي على إشارة قوية زنك تتناسب مع هولو إيفا (الشكل 4A)، يدل على الصليب التلوث، أو إشارة ضعيفة زنك موحية apo إيفا والحد الأدنى من التلوث المتبادل (الشكل 4 باء). وأكد تحليل برنامج المقارنات الدولية--مرض التصلب العصبي المتعدد الوسائط الحد الأدنى M9 مستويات المعادن الانتقالية في حدود sub-ميكرومولار (غير معروضة)؛ ولذلك، ينبغي أن يتوقع الكشف عن كميات الحد الأدنى فقط من الفلزات الانتقالية عقب تجزئة ناجحة. يمكن استخدام تجزئة تحليلية (الشكل 5) لقياس معدلات النقل راديوميتال والتقاط البيانات الفنية. الدقيقة 60 لقطة مقارنة الكسور بيريبلاسميك وهيولي الخلايا كولاي معربا عن إيفا الناقل يفيبكدي كاملة فقط، وأي من المكونات يفيبكدي يكشف عن النتائج المترتبة على التعبير عن بروتين المؤتلف واحد أو البروتين المعقدة على امتصاص المعادن (الشكل 6). الخلايا كولاي الإعراب عن لا البروتين المؤتلف تنقل قرابة النصف من 52إضافة إلى وسائل الإعلام إلى السيتوبلازم مع الاحتفاظ بالحد الأدنى في بيريبلاسم مينيسوتا. يمثل هذا التحكم السلبي النقل المنغنيز الذاتية. نقل الخلايا كولاي معربا عن إيفا المؤتلف تقريبا ربع من 52إضافة إلى وسائل الإعلام السيتوبلازم مع ربع آخر الاحتفاظ بها في بيريبلاسم مينيسوتا. الاحتفاظ بالمنغنيز في بيريبلاسم ومحدودية وسائل النقل إلى السيتوبلازم يدل على الطلب الأيضية واختناق يفرضها إنتاج إيفا في غياب الناقل يف. نقل الخلايا كولاي معربا عن المؤتلف يفيبكدي الناقل تقريبا 100 ٪ من 52إضافة إلى وسائل الإعلام إلى السيتوبلازم مع الاحتفاظ بالحد الأدنى في بيريبلاسم مينيسوتا. النقل زيادة المنغنيز في السيتوبلازم يوضح مساهمة الناقل يف في النقل المنغنيز.

Figure 1
رقم 1. تنقية يفيا بتجزئة. أ-نموذج افتراضي للناقل يف. ب-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة جل لتنقية إيفا من كسر بيريبلاسم، استخدام شطف التدرج الخطي من تبادل شاردة. هلام الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة يظهر في إثراء إيفا (كاتشين 30) عبر خطوات تنقية. السهم الأسود يشير إلى موقف هجرة الغرواني الكهربي لايفا. معايير الوزن الجزيئي على حق. (1) بيريبلاسم الكسر. (2) Q شاردة تبادل عمود التدفق من خلال. (3) Q شاردة تبادل العمود ذروة شطف. (4) سوبيرديكس 200 م س جل الترشيح العمود الذروة. ج-الإثراء إيفا – "مثال جيد". معالجة الصور من جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من ب يحسب الإثراء الشامل لايفا بقياس كثافة تزيد من نسبة 8% كسر بيريبلاسميك إلى 61% المنتج هلام الترشيح. مربعات زرقاء تشير إلى إشارة إلى مجموع إيفا المستخدمة لقياس كثافة العمليات الحسابية. تحليل الطيف الكتلي للفرقة محاصر في حارة 4 الكشف عن الأحماض الأمينية إيفا 259/280، قدم في تسليط الضوء الأخضر. يتم تمثيل الأحماض الأمينية الموجودة في ببتيد ناضجة في نص أسود غامق المرسملة، وتمثل الأحماض الأمينية يؤلف الببتيد ملصوق إشارة في النص الرمادي الصغير المائل. د-الإثراء يفيا-"مثالاً سيئاً". الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هلام لتنقية إيفا من كسر بيريبلاسم، استخدام شطف التدرج خطوة من تبادل شاردة. هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يظهر إثراء إيفا عبر خطوات تنقية. السهم الأسود يشير إلى موقف الهجرة الملوث البروتين الرئيسية تعزيز خلال شاردة تبادل اللوني الغرواني الكهربي. معايير الوزن الجزيئي على حق. (1) سوبيرديكس 200 م س جل الترشيح العمود الذروة. (2) Q شاردة تبادل العمود 250 ملم كلوريد الصوديوم خطوة التدرج شطف. (3) بيريبلاسم الكسر. تجهيز الصورة لجل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من د يحسب هامشية الإثراء الشامل لايفا بقياس كثافة بحد أقصى 20% المنتج هلام الترشيح. مربعات زرقاء تشير إلى إشارة إلى مجموع إيفا المستخدمة لقياس كثافة العمليات الحسابية. تحليل القياس الطيفي للكتلة الفرقة إلى بواسطة السهم الأسود في حارة 1 اكتشاف الببتيدات فريدة 26 من ليفي (كاتشين 39)، 25 الببتيدات فريدة من نوعها للأعمال (كاتشين 41)، و 17 من الببتيدات فريدة من نوعها من ليفك (كاتشين 39). جميع الملوثات الثلاثة هي بيريبلاسميك كولاي سببس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. هولو إيفا وايفا Apo هلام الترشيح تشروماتوجرامس. السهم الأسود يشير إلى موقف حجم الفراغ. هلام الترشيح إلى الذروة للاشتقاق إيفا (المنحنى الأسود)، والدول هولو إيفا (المنحنى الأزرق) إظهار كلا البروتين الوت في نفس وحدة التخزين شطف، مشيراً إلى أن الاشتقاق إيفا تنقيته من الكسر periplasm له قطرها هيدرودينامية مماثلة هولو إيفا تنقيته من مجموع المحتوى الخلوية بعد الصحافة الفرنسية.

Figure 3
الشكل 3. Apo إيفا وايفا هولو كريستال مورفولوجيس. إيفا هولو يبلور كريستال متجانسة، بينما apo إيفا عموما ينتج بلورات المتآخية في بلورة نفس الشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. إيفا Apo والأطياف fluorescence الأشعة السينية إيفا هولو. أ-أطياف الأشعة السينية fluorescence هولو إيفا التي قد تم تنقيته من وسائط M9 الحد الأدنى مع أي منحنى مكملات، خضراء معدنية انتقالية إضافية. تتم تسمية قمم مميزة للمنغنيز والحديد والزنك. ب-تنتج الأشعة السينية الأطياف fluorescence من عينة إيفا في سياق يفيبكدي. تتم تسمية قمم مميزة للمنغنيز والحديد والزنك. المنحنى الأزرق. أطياف الأشعة السينية fluorescence إيفا تنقيته من سياق يفيبكدي وتجزئة ناجحة في كسر بيريبلاسم مع الحد الأدنى من التلوث هيولى انتقال المعادن و/أو هولو إيفا البروتين. المنحنى الأحمر. أطياف الأشعة السينية fluorescence إيفا تنقيته من سياق يفيبكدي مع تجزئة غير ناجحة من تحلل المفرط والتلوث الكبير هيولى انتقال المعادن و/أو هولو البروتين إيفا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5. المعمم سير العمل لتجزئة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6-60 دقيقة امتصاص المعادن المشعة تجزئة البيانات. وأجرى تجربة كل ثلاث مرات، وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. شريط أحمر. كولاي الخلايا التي لا تحتوي على الناقل يف النقل ~ 50% تقريبا من 52دقيقة في السيتوبلازم بعد 60 دقيقة، والحفاظ على مستويات منخفضة من بيريبلاسميك 52Mn. الشريط الأزرق. كولاي الخلايا التي تحتوي على النقل الناقل يف > 90% من 52دقيقة في السيتوبلازم بعد 60 دقيقة، والحفاظ على مستويات منخفضة من بيريبلاسميك 52Mn. شريط أخضر. كولاي الخلايا التي تحتوي على فقط يفيا النقل ~ 25 في المائة تقريبا من 52دقيقة في السيتوبلازم وتحتفظ ~ 25% من 52دقيقة في بيريبلاسم بعد 60 دقيقة.

راديوميتال المستخدمة في هذا العمل، 52مينيسوتا (t1/2 = 5.59 د) وكان في منشأة سيكلوترون UAB (برمنغهام، AL) التي تنتجها القصف بروتون على هدف Cr طبيعية وتنقيته كما ذكر سابقا19. تنبيه: 52مينيسوتا باعث بوزيترون (β+متوسط = 242 كيلو إلكترون فولط، 29.4 في المائة)، وأيضا تنبعث أشعة جاما عالية الطاقة عدة مع كثافة عالية (ﻫγ = 744.2، 935.5، 1434.0 فولط؛ أنا = 90.0%، 94.5 في المائة، ونسبة 100%). لهذه الأسباب، التجربة يجب أن يتم وفقا لمبادئ حماية الإشعاع من الأرا، كما هو موضح أعلاه. ينبغي الواردة على نحو ملائم جميع البنود المعينة كالنفايات المشعة، والمسمى بوضوح والتخلص منها وفقا للإجراءات المعمول بها.

Discussion

وجود خلية هو أداة مفيدة لاستكشاف محتويات حجرة الخلوية على وجه التحديد، ويمكن أن تكون بمثابة أداة مفيدة لاستخراج الجزيئات الصغيرة مثل الذرات المعدنية، وكذلك الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات. تجدر الإشارة إلى أن وجود الخلية ليس أسلوب مطلق، ويمكن أن تكون دون عناية فائقة لخلط استثارة ودرجة حرارة الحضانة والحضانة وقت عرضه للخطأ. خلط غير مكتملة يمكن أن ينتج تحلل الغشائي الحد الأدنى وتجزئة ومن ثم لا يعتد بها، يمكن أن يسبب تجزئة في درجة حرارة الغرفة تحلل السريع الأغشية على حد سواء أدى إلى تلوث الكسر بيريبلاسميك مع محتويات هيولى، و يمكن أن يؤدي أوقات الاحتضان الموسعة أيضا تحلل المفرط، وبالتالي تلوث الكسر. هو حل وسط معقول لتحقيق تحلل الغشاء الخارجي الفعال والكامل نسبيا (مع الحفاظ على الغشاء الداخلي) الحضانة 20 دقيقة فوق الجليد في المخزن المؤقت لتجزئة ناقص التوتر. هناك اعتبار آخر هو طريقة الاستخراج، حيث استخراج قاسية بالهز أو دوامة يمكن أن تهدد نوعية استخراج مثل التسبب في تجميع البروتين. من المستحسن أن تخلط بلطف مثل ملعقة أو انعكاس أو يسفط ماصة للحفاظ على جودة عالية من المواد لتحليل المتلقين للمعلومات. يمكن أن يحدث تنقية من وجود خلية محضرة مع متغير الكفاءة كما يتضح من الشكل 1. في تجربة واحدة، بدأ يفيا بنسبة 8% المحتوى بيريبلاسميك المستخرج (الشكل 1)، بينما في تجربة أخرى، بدأت يفيا بنسبة 17 في المائة المحتوى بيريبلاسميك (الشكل 1). هذه الاختلافات يمكن أن تنشأ من عدة أسباب مثل شروط التعبير المتغير (إضافة أدتا إلى وسائط النمو يمكن زيادة التعبير عن الجينات وينظم آليات المجاعة مثل تنظيم الفراء المروج يف)، الاستخدام المتكرر لتجميد الأرصدة الدائمة، والأخطاء البشرية. بدلاً من تعديل أوقات الاحتضان، من المستحسن للارتقاء بالإعداد. تنقية من الكسر periplasm يوصي بأن تدرج شطف تدرج خطي من الخطوة الكروماتوغرافي تبادل شاردة. شطف تدرج خطوة هو استراتيجية شطف التغييرات الاستخدامات المنفصلة والمفاجئ في تشكيل المرحلة المتنقلة (أي., 0 ملم كلوريد الصوديوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، كلوريد الصوديوم 150 مم، إلخ.). شطف تدرج خطي هو استراتيجية شطف يستخدم تغير تدريجي في موبايل المرحلة تكوين (أي، 0 ملم كلوريد الصوديوم، كلوريد الصوديوم، 5 ملم 10 ملم كلوريد الصوديوم، إلخ.). تدرج خطوة مفيدة لفصل الجزيئات التي لها الانتماءات المختلفة للمرحلة ثابتة، وشطف تدرج خطي مفيد لفصل الجزيئات التي لها الانتماءات مماثلة للمرحلة ثابتة. في حالة تنقية البروتين مع أي علامة تنقية الاصطناعية (لتعزيز التقارب للمرحلة ثابتة) من حجرة خلية الغنية بالبروتين فريدة الأنواع، ينصح شطف تدرج خطي لفصل بروتينات نونينتيريست التي قد وقد الانتماءات مماثلة إلى مرحلة ثابتة بروتين الفائدة. عموما، من المتوقع أن عائد من 1-2 مغ الاشتقاق المنقي إيفا من كل لتر من الثقافة معربا عن إيفا من الذاتية في المروج بيستيس يوسف .

الأسفار بالأشعة السينية هي تقنية تمكن المحقق لسرعة تحديد المحتوى المعدني في عينة، وإبلاغ المحقق بإدراج معدنية غير متوقع التي يمكن لولا ذلك غير معروف. على الرغم من أن يتم تضمين يدتا في المخزن المؤقت لوجود مكثف لإزالة المعادن المرتبطة بشكل فضفاض أو مجاناً، إيفا المستمدة من الكسر بيريبلاسم يمكن أن تحتوي على بعض البروتين هولو. نظراً لأن المعادن النقل عملية دينامية، وربما محتوى البروتين هولو تنبع من إيفا التي ما زالت تبرعت لا شحنتها إلى يفيبكدي. تجدر الإشارة إلى أن الأسفار الأشعة السينية فقط يقيس إجمالي المحتوى المعدني، ولا تشير إلى إذا كان المعدن أمرت في شعرية كريستال أو ملزمة على وجه التحديد لبروتين. لتحديد إذا كان المعدن هو أمر في شعرية كريستال و/أو ملزمة على وجه التحديد لجزيء بروتين، مطلوب بالأشعة السينية ونثر جمع البيانات وتجهيزها. ومع ذلك، يسمح fluorescence الأشعة السينية لتقييم عينة سريعة من تلوث المعادن و/أو التكامل البروتين هولو المتبقية. الإشعاع السنكروتروني الوقت محدود وليس هناك دائماً الوقت لوضع استراتيجية لجمع البيانات تشتت الأشعة السينية في كل عينة، وهكذا fluorescence الأشعة السينية تقنية قيمة لفحص بلورات كثيرة، وإعطاء الأولوية لأي عينات بالأشعة السينية وينبغي جمع البيانات ونثر. وعلاوة على ذلك، تمكن fluorescence الأشعة السينية لجمع البيانات من النماذج التي قد لا ديفراكت الأشعة السينية. حين جمع البيانات fluorescence الأشعة السينية، في بعض الأحيان الإشارة يمكن أن تكون ضعيفة جداً والأطياف الناتجة مبهمة. لزيادة قوة الإشارة، أما للأسفار الأشعة السينية أو المسح الضوئي جنون، النظر في زيادة وقت التعرض و/أو تقليل توهين شعاع الأشعة السينية. وعندما يتم تحديد نموذج لجمع البيانات تبعثر الأشعة السينية، من المستحسن لجمع البيانات تشتت الأشعة السينية في جزء مختلف من العينة من ما استخدمت للأسفار بالأشعة السينية وجنون المسح الضوئي لتقليل الضرر الإشعاعي، وتحسين نوعية البيانات جمع، والتقليل إلى أدنى حد من أي إمكانية للحد إشارات الشاذة.

يتطلب الكشف عن مواد مشعة استشفاف nanomolar كميات المواد أو أقل، واستخدام هذه تتبع كوكلاء تتبع الجزيئية يوفر طريقة بسيطة وحساسة للغاية للتحقيق في العمليات الخلوية. يمكن استخدام الإنزيم راديوميتال المبين أعلاه لتحديد مجموع امتصاص المعادن، التوزيع عبر مقصورات الهاتف الخلوي، فضلا عن معدلات الإقبال. وفي الواقع، يتطلب كل نقطة بيانات الوقت وجود 40 دقيقة؛ ومع ذلك، يتم التوصل إلى كل نقطة من الزمن، لهي القريبون الخلايا فورا والمحتضنة في المخزن المؤقت الملح عالية (الشكل 5، الخطوة 1). تبين القياسات راديوميتال وسائل الإعلام وتجاهل المخزن الملح عالية (الشكل 5، 1 خطوة)، والكسور بيريبلاسميك وهيولي بعد (الشكل 5، 3 خطوة) الحضانة العازلة الملح عالية بنجاح إزالة كافة المتبقية غير مقترنة المعدن الحرة التي بقيت بعد الطرد المركزي الأولى بعد بلوغ نقطة الوقت. الطرد المركزي الأولى يزيل معظم (ما يصل إلى 80 في المائة) من المعدن الحر غير مقترنة، والطرد المركزي بعد حضانة في المخزن المؤقت للملح عالية كما يزيل الإضافية المتبقية المعادن الحرة غير مقترنة. لا يتوقع أي معدن الحرة غير مقترنة العالقة تؤثر تأثيراً كبيرا على النقل معدنية أثناء وجود 40 دقيقة. تأثير وجود 40 دقيقة في نقل المعادن داخل الخلية اعتبار آخر لتفسير البيانات الحكيمة. تقريبا يحدث بروتوكول وجود أسرة فوق الجليد، وبصرف النظر عن الطرد المركزي 30 ثانية بين الخطوات. المعادن وقت النقل بينت التجارب بالطبع الحفاظ على الخلايا في 4 درجات مئوية وأن يلغي النقل معدنية20،،من2122؛ ولذلك، لأن التجارب التي تحدث فوق الجليد، تجزئة 40 دقيقة لا يتوقع إلى حد كبير زيادة مستويات المعادن في بيريبلاسم السيتوبلازم ومستويات المعادن يتوقع أن تكون ممثلة النقاط الزمنية التي كانت الخلايا في البداية سينتريفوجاليزيد.

تحديد امتصاص نسبي في مقصورات خلوية مختلفة يمكن المساعدة في إبلاغ البيانات XFS، وتثبت طبيعة الفسيولوجية من الركازة، فضلا عن تمكين المحقق لمزيد التحقيق تفاصيل الآلية الجزيئية. على سبيل المثال، إضافة للطفرات الوراثية لتجارب امتصاص راديوميتال يوفر طريقة مباشرة لتدعيم بقايا الوظيفية الرئيسية أو جزيئات تشارك في نقل الركازة. وتشمل المزايا راديوميتال استيعاب التجارب والتحليلات التداول السريع وإنتاجية عالية وإمكانية تكرار نتائج عالية والموازاة لتجارب مقارنة ظروف النمو والبنيات الوراثية.

Disclosures

ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

كما تم جمع البيانات في GM/CA@APS، التي تم تمويلها كلياً أو جزئيا مع الأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للسرطان (ACB-12002)، وفي المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (AGM-12006). هذا البحث استخدام الموارد من مصدر فوتون متقدمة (الجزائرية)، إدارة الولايات المتحدة للطاقة (DOE) مكتب للعلم المستخدم تشغيل مرفق لمكتب وزارة الطاقة "بالعلم" "مختبر أرغون الوطني" تحت "رقم العقد" دي-AC02-06CH11357. استخدام مصدر فوتون متقدمة بتأييد من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة، ومكتب العلوم، مكتب علوم الطاقة الأساسية، تحت "رقم العقد" ث-31-109-إنكلترا-38.

نود أن نعترف مركز السرطان الشامل لاتحاد المصارف العربية-وسائل قياس الطيف الكتلي/البروتيوميات "المشتركة مرفق" (P30CA13148-38) لمساعدتها في تحليل الطيف الكتلي.

وأيد C.D.R. بمنحه من جامعة ألاباما في مكتب برمنغهام للتنوع، والإنصاف، وإدراج. وأيد L.L.R. قسم الأشعة من جامعة ألاباما في برمنغهام. وأيد "البرنامج النظائر" وزارة الطاقة، "مكتب العلم"، 52إنتاج المنغنيز ومنح A.V.F.M. تحت DESC0015773.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore Fisher M1097270100
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) Fisher BP1760-5
AMRESCO M9 Medium Broth Fisher NC9688886
Bis-Tris, Fisher BioReagents Fisher BP301-100
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) Fisher C79-500
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) Fisher D16-500
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) Fisher S311-100
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller Fisher BP1426-500
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) Fisher M63-500
Sodium Azide, White Powder Fisher BP922I-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher S271-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) Fisher S374-500
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) Fisher BP153-500
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cryschem Plate Hampton HR3-158
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Fisher UFC903024
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane Fisher SLHV013SL
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg Fisher 28-9893-36
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns Fisher 17-1154-01
Name Company Catalog Number Comments
Cells
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS Fisher 230280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
  2. Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
  3. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  4. Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
  5. Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
  6. Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
  7. Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
  8. McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
  9. Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
  10. Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
  11. Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
  12. Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
  13. Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
  14. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
  15. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  16. Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
  17. Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
  18. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
  19. Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
  20. Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
  21. Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
  22. Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).

Tags

الكيمياء، 132 قضية، تجزئة، Periplasm، Fluorescence الأشعة السينية، المعادن الانتقالية، الركيزة ملزمة البروتين (SBP)، إيفا، واليرسينيا بيستيس، الطاعون، Radiotracer، والنشاط الإشعاعي
امتصاص المعادن الأساسية في البكتيريا سلبية الغرام: الأشعة السينية الأسفار، النظائر المشعة، والخلية تجزئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radka, C. D., Radford, L. L.,… More

Radka, C. D., Radford, L. L., Massicano, A. V. F., DeLucas, L. J., Lapi, S. E., Aller, S. G. Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation. J. Vis. Exp. (132), e57169, doi:10.3791/57169 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter