Summary
Ein Protokoll für die Gewinnung von periplasmatischen Übergangsmetall Chaperon im Zusammenhang mit seiner nativen Bindungspartner und biophysikalischen Charakterisierung des Inhalts Substrat durch Röntgen-Fluoreszenz und Radiometal Aufnahme dargestellt wird.
Abstract
Wir zeigen eine skalierbare Methode für die Trennung von der bakteriellen Periplasma von Zytoplasma. Diese Methode wird verwendet, periplasmatischen Protein zum Zwecke der biophysikalischen Charakterisierung und Maßnahme Substrat Transfer zwischen periplasmatischen und zytoplasmatischen Kompartimente zu reinigen. Durch die sorgfältig Begrenzung der Zeit, die das Periplasma vom Zytoplasma getrennt ist, kann der Experimentator das Protein des Interesses zu extrahieren und assay jedes Fach einzeln für Substrat ohne Verschleppung Kontamination zwischen den Abteilen. Die extrahierten Proteine aus Fraktionierung kann dann weiter für dreidimensionale Strukturaufklärung oder Substrat-verbindliche Profile analysiert werden. Alternativ kann diese Methode nach Inkubation mit ein Radiotracer bestimmen insgesamt Prozent Aufnahme sowie Verteilung des Tracers (und daher Metall Transport) durchgeführt werden, über verschiedene bakterielle Fächer. Experimente mit einem Radiotracer kann helfen, zwischen einer physiologischen Substrat und artifizielle Substrat, wie etwa durch Mismetallation zu unterscheiden.
Röntgenfluoreszenz kann verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von Metall Einbau in einer Probe zu entdecken sowie die Veränderungen, die in Metall Aufnahme als Produkt der Wachstumsbedingungen, Reinigung Geschäftsbedingungen und/oder Kristallisation Bedingungen auftreten können. Röntgenfluoreszenz bietet auch ein relatives Maß der Fülle für jedes Metall, die verwendet werden können, um festzustellen, die beste Metall Energie Absorption Spitze für anomale Röntgen Streuung Datenerfassung verwenden. Radiometal Aufnahme kann als eine Methode zu validieren die physiologische Natur eines Substrats durch Röntgen-Fluoreszenz erkannt sowie die Unterstützung der Entdeckung der neuartigen Substrate verwendet werden.
Introduction
In Gram-negativen Bakterien sind zytoplasmatischen Pools Übergang Metall-Atome erhöht und ergänzt durch die innere Membran ABC (ATP-bindende Kassette) Einführer, die Metall Translokation durch die innere Membran zu mildern. Periplasmatischen Cluster a-1 Substrat-bindende Proteine (SBPs) bilden eine Gruppe von Chaperonen, die die Metallatomen direkt binden und sie durch das Periplasma übermitteln sie an cognate ABC Importeure1Fähre. Anderen Clustern SBPs engagieren uns für den Transport von Substraten, wie Chelat Metall (Cluster a-2), Kohlenhydrate (Cluster B und d-1) und Aminosäuren (Gruppen B, C, f-2 und f-4); Dennoch folgen SBPs unabhängig vom Substrat, eine evolutionär konserviert c-Clamp Falte2. Die generalisierte vorgeschlagene Mechanismus für die SBP Substrat Transfer umfasst der c-Clamp durchläuft eine Reihe von Verrenkungen, die eine Venusfliegenfalle3ähneln. In der Regel reinigen Cluster a-1 SBPs in Holo (Metall gebunden) Form, obwohl Studie über diese SBPs durch die Schwierigkeiten bei der Erzeugung von Apo (metallfrei) Formen des Proteins für Experimente4begrenzt ist. Bis heute wurden Strategien, Apo zu studieren Cluster a-1 SBPs wurden beschränkt, Mutagenese, Dialyse und teilweisen Denaturierung mit Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. Strukturdaten aus diesen Experimenten deuten darauf hin, dass Cluster a-1 SBPs Venus Flytrap Mechanismus nicht genau folgen kann. Derzeit fehlt in der Literatur ist ein Verfahren zur Herstellung von Apo a-1 SBPs Cluster in Vivo mit physiologischen Bindungspartner.
Wir zeigen zum ersten Mal mit Zelle Fraktionierung, YfeA, eine Cluster-a-1-SBP von Yersinia Pestis, die ätiologische Agenten der Pest, die in der Apo-Form durch die Interaktion mit dem physiologischen cognate YfeBCDE ABC-Importeur umgewandelt wurde, zu reinigen in der Zelle. Wir zeigen, dass YfeA in Form von Energie-energiedispersiver Röntgenspektroskopie (Hg.), auch bekannt als Röntgenfluoreszenz Apo. Wir zeigen auch YfeBCDE Funktionalität durch die Kombination von Zelle Fraktionierung mit hochsensiblen radioaktives Metall Aufnahme Studien Metall Aufnahme durch die äußere Membran und Metall Import über die innere Membran zu unterscheiden. Die Verwendung eines radioaktiven Tracers ermöglicht die Erkennung von Pg/L Mengen von Metallen, deutlich unter der Nachweisgrenze für solche Techniken wie induktiv Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) oder Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) gekoppelt. Dies ermöglicht eine minimale Störung des untersuchten Systems. Darüber hinaus erfordern oft aufgeführten traditionellen Methoden größere Probenvolumina, zusätzliche Nachbearbeitung und längere Durchlaufzeiten, die nicht typisch für Radiotracer Assays sind. So, mit einem Radiotracer bietet eine bequeme und einfache Methode zur Überwachung Metall Verteilung und Aufnahme innerhalb einer Zelle. Es bleibt festgestellt werden, ob eine Apo, die Cluster-a-1-SBP produziert mit dieser Methode der strukturellen Beobachtungen aus den aktuellen Praktiken zur Erzeugung von Apo Protein echo würde.
Zelle Fraktionierung ist ein etabliertes Verfahren zur Trennung von zellulärer Kompartimenten für die implizite Zweck speziell sondieren ihre Inhalte in Isolierung12. Zelle Fraktionierung wird häufig verwendet, bestätigen Sie den Speicherort eines Moleküls während des Zellzyklus oder die Aktivität eines bestimmten Fach13messen. Zum Beispiel kann Metall Transportaktivität durch Sondierung zellulare Fächern für Metallsubstrat geprüft werden. Integration von Zelle Fraktionierung ermöglicht Unterscheidung und Vergleich zwischen Metall Aufnahme durch die äußere Membran und Metall Übertragung durch die innere Membran. Diese Prozesse können dann wiederum im Laufe der Zeit gemessen werden. Im Falle der Proteinreinigung, die gängigsten Methoden der Zelle Lysis und Trennung von löslichen Bestandteilen vom unlöslichen Komponenten sind mechanische Störungen (z. B. Schleifen, mischen), Hochdruck Homogenisierung (d. h. französischen Druck Cell Press, Zelle Disruptor) und Ultraschall-Frequenzen (i.e., Beschallung)14. Verwendung von Ultraschallfrequenzen zu Zellen lysiert eignet sich in der Regel am besten für kleine Volumen; Beschallung ist jedoch bekannt, um übermäßige Hitze zu generieren, der Proteine denaturieren können. Zur Vermeidung von übermäßigen Wärmeerzeugung gelten Ultraschallfrequenzen in der Regel in sequenziellen Zwischenspurts, die kann sehr zeitaufwändig sein und versehentlich degradieren DNA-Moleküle in kleinere Fragmente. Darüber hinaus möglicherweise mehrere teure Beschallung Sonden für präparative und analytische Experimente erforderlich, da jede Sonde hat einen begrenzten Bereich für das Probenvolumen, die verarbeitet werden können. Verwendung von Hochdruck an Zellen lysiert vermeidet übermäßigen Hitze während Zelle lyse bis chillen französischen Druck Presse Zellbestandteile vor Lyse oder Betrieb einer Zelle Disruptor in einer kalten Umgebung wie ein kalter Raum zu erzeugen. Wie Beschallung Sonden müssen mehrere Sätze von Zellkomponenten Press französischen Druck erworben werden, um eine Vielzahl von Probenvolumina zu verarbeiten. Französischen Druck Zelle drücken Sie die Baugruppen sind einfach anzuschließen, aber umständlich zu bedienen und zu reinigen, kann schwer zu bewegen und sind anfällig für Verstopfungen aus dichten Proben. Vorteile bei der Verwendung von Ultraschallfrequenzen und Hochdruckanlagen zur lyse der Zellen enthalten hohe Probenrückgewinnung, Fähigkeit, mehrere Proben mit minimaler Kreuzkontamination, zu verarbeiten und verstellbaren Scheren Kraft, die für Lyse Optimierung der angepasst werden kann eine Vielzahl von Probenarten. Optimierung kann auftreten, durch eine Anpassung der Ultraschallfrequenz Dauer der platzt, Kolben Druck Pfund pro Quadratzoll (Psi) und Anzahl der Durchläufe durch die Presse. Einsatz von mechanischen Störungen zur lyse der Zellen möglicherweise die technisch trivial und kostengünstigste Strategie zur Lyse der Zelle. Mechanische Störungen kann Herausforderungen in Probenrückgewinnung und eignet sich nicht für die Bearbeitung mehrerer Proben. Mechanische Störungen ist sanfter, Proben als Hochdruck- oder Ultraschallfrequenzen, aber ist nicht hohen Durchsatz und ist anfällig für ineffiziente Lyse. Eine erhebliche experimentelle Einschränkung der mechanischen Störungen, Hochdruck Homogenisierung und Ultraschallfrequenzen, ist die unkontrollierbare Störung der gesamten zellulären Architektur so, dass nach lyse, alle wässrigen Zellbestandteile gemischt werden zusammen. Darüber hinaus stören alle Zelle Fächer nicht zur gleichen Zeit; Daher können Inhalte der Fächer, die früh lösen laufenden störende Kräfte mehr als Inhalt der Fächer unterliegen, die spät lösen. Zelle Fraktionierung ermöglicht eine kostengünstige, technisch unkompliziert, effizient Fach-basierte Trennung der Zellinhalte unter Vermeidung der Notwendigkeit für teure Ausrüstung und Probe Exposition gegenüber rauen, störende Kräfte.
Im Falle der SBP importierten Substrat ist potenziell Apo Protein wieder eingeführt und regeneriert Holo-Protein während der Lyse, vor dem nachgeschalteten Chromatographie oder andere Reinigungstechniken. Einbeziehung von EDTA Chelator während Lyse stellt ein zusätzliches Hindernis, wo Metall Affinität als erster Schritt der Proteinreinigung nicht möglich ist, weil EDTA wird Metall aus dem Harz der Chromatographie Streifen und verhindern, dass Protein15verbindlich. Eine einfache und kostengünstige Lösung ist Zelle Fraktionierung von osmotischen Schock, wo differentielle Zentrifugation und gemeinsame Laborreagenzien ermöglichen die Ermittler, ausreichend Protein für Funktionsanalyse sorgfältig zu extrahieren. Osmotischen Schock Fraktionierung nutzt eine zweistufige Änderung der osmotischen Druck, zellulare Fächer zu trennen. Erstens ein hypertonen Puffer bewirkt, dass Zellen zu crenate wie Wasser jeder Zelle verlässt und zweitens ein hypotone Puffer bewirkt, Zellen Schwellen dass als Wasser wieder jede Zelle betritt. Sorgfältig kontrollieren, wie lange die Zellen anschwellen, können die äußeren Membranen selektiv (wegen der Anhäufung des osmotischen Drucks aus dem ankommenden Wasser), lysiert werden somit Entleeren ihren Inhalt in den Puffer. Erhaltung der inneren Membranen sorgt dafür, dass der zytoplasmatischen Inhalt in Spheroplasts bleibt und periplasmatischen Inhalt leicht durch Zentrifugation abgetrennt werden.
YfeA ist ein Polyspecific SBP binden, Eisen, Mangan und Zink-Atome16. Die relativen Anteile der eingearbeitete Metall nach Metall-Supplementierung während des Wachstums verändert werden kann, und untersucht wie z. B. durch Röntgen-Fluoreszenz am Argonne National Laboratory Advanced Photon Source16steht. Röntgenfluoreszenz ermöglicht die Ermittler schnell eine breite Versammlung von Metallen ohne Profil große oder Beugung Qualität Kristalle, und können sogar Daten aus Niederschlag oder proteinhaltige Proteinlösung aufzulesen.
Röntgen-Fluoreszenz kann schnell offenbaren unerwartete Ergebnisse wie in diesem Fall die primäre YfeA Substrat wird Zink und nicht die dokumentierten physiologischen Substraten Eisen oder Mangan16. Wenn vor Röntgen Streuung Datensammlung verwendet, kann Röntgenfluoreszenz die Ermittler in experimentellen Design, informieren wie die Metall Energie Kante(n) für anomale Röntgen Streuung Datenerhebung zu verwenden. Ebenso nützlich wie die Bestimmung die relativen Fülle von Metall, Röntgenfluoreszenz kann auch feststellen, ob eine Metall fehlt in einer Probe bietet eine schnelle Methode der Trennung von Kristallen, Apo Protein von Holo-Protein enthält, und die Schätzung Metall, Signalstärke ohne zeitraubende Datenverarbeitung. Bei der Ermittlung einer Probe mit einem starken Metall Signal, kann die genaue Wellenlänge für anomale Röntgen Streuung Datenerfassung verwenden durch Multiple-Wellenlänge anomalen Dispersion (MAD) Scan ermittelt werden.
Dieses ausführliche Protokoll soll helfen neue Experimentatoren erfolgreich durchzuführen Zelle Fraktionierung und effektive Nutzung von Synchrotronstrahlung Strahlrohr Hardware Profil total Metallgehalt und die Untersuchung von Metall-bindende Proteine.
Protocol
(1) bakterielle Starterkultur (Tag 1)
- In einem 200 mL abgeschrägte Kolben, 30 mL von Luria Bertani Brühe (LB) mit Escherichia coli -Stamm BL21-CodonPlus (DE3) zu impfen-RIPL Zellen enthaltenden pYFE3 Plasmid16.
- Die Küvette fügen Sie 30 µL von 50 mg/mL Ampicillin durch Absaugen mit einer Pipette und 200 µL Tipp hinzu. Schütteln Sie über Nacht zu 225 u/min bei 37 ° c.
2. ergänzt M9 Minimal Media Vorbereitung (Tag 2)
Hinweis: Dies ist aus dem Amresco Handbuch angepasst.
- 6 L von flüssigen Medien durch das folgende Verfahren vorbereiten. In einem 2 L abgeschrägte Kolben 1 L des ultra-reinen H2O. Autoklaven bei 121 ° c für 20 min. 10,5 g M9 minimal Medien hinzufügen und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Aseptisch hinzufügen die folgenden sterilen Ergänzung Lösungen: 2 mL/L 1 M MgSO4, 10 mL/L von 20 % w/V Glucose, 0,1 mL/L 1 M CaCl2und 1 mL/L von 50 mg/mL Ampicillin. Führen Sie diesen Schritt in einem biologischen Sicherheitsschrank zu eine sterile Umgebung pflegen. Die Medien auf 37 ° c warm.
3. bakterielle Subkultur
- Fügen Sie 5 mL/L über Nacht Starterkultur durch Absaugen mit einer automatisierten Pipette und 5 mL Spitze M9 minimal Medien hinzu. Schütteln Sie die Subkultur kontinuierlich zu 225 u/min bei 37 ° c für 9 h.
Hinweis: Bei diesem Schritt ist YfeABCDE durch Autoinduktion aus seiner nativen überexprimiert Y. Pestis Promotor. - Wiederherstellen Sie Zellen durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 30 min bei 4 ° c. Zellen in 50 mL eine eiskalte Phosphat-Pufferlösung (20 mM Na2HPO4 pH 7.6, 50 mM NaCl) durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze Aufschwemmen und bei-80 ° c über Nacht einfrieren.
(4) Zelle Fraktionierung (Tag 3)
- Tauen Sie die Wiederfreisetzung bei 4 ° C und Pellet Cells bei 4.000 x g für 20 min bei 4 ° c. Aufzuwirbeln Sie Zellen in 50 mL eiskaltes hohe Salz-Puffer (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl, und 2 mM EDTA) durch Absaugen mit einer automatisierten Pipette und 25 mL Spitze. Inkubieren Sie die Suspension über Eis für 20 min, mit gelegentlichen Umkehrung zum Mischen.
- Pellet-Zellen bei 4.500 x g für 20 min bei 4 ° c. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 50 mL eiskaltes niedrigen Salz-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0) durch Absaugen mit einer automatisierten Pipette und 25 mL Spitze. Inkubieren Sie die Suspension über Eis für 20 min, mit gelegentlichen Umkehrung zum Mischen.
- Pellet-Spheroplasts bei 4.500 x g für 20 min bei 4 ° c. Den Überstand enthält Periplasmazu erholen. Aufschwemmen Sie der gebeizte Spheroplasts in Phosphat gepufferte Salzlösung (Schritt 3.2) durch Absaugen mit einer automatisierten Pipette und 25 mL Spitze, und lösen Sie Zellen von drei Zyklen der französischen Druck Zelle Presse bei 1500 Psi.
Hinweis: Eine französische Druck Zelle Presse kann umständlich zu bedienen sein und nutzt eine Hydraulikpumpe Zelle Lysis zu fahren. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Hydraulikpumpe, Sicherstellung der korrekten Ausrichtung des Kolbens mit der Presse und halten die Hände frei für die Hydraulikpumpe. - Pellet-Zelltrümmer bei 50.000 x g für 20 min bei 4 ° c. Den Überstand mit Zytoplasmazu erholen. Falls erforderlich, kann die äußeren und inneren Membranen fraktionierte16weiter.
5. mit FPLC Proteinreinigung
- Unmittelbar nach der Fraktionierung filtern Sie den periplasmatischen Bruch mit einem 0,45 µm-Membran-Einheit. Verwenden Sie einen Luer Lock Spritze Filter für einfache und schnelle Filtration. Equilibrate einer 5 mL Q-Anion-Austausch-Spalte mit 20 mM Tris pH 7.6, 0,05 % w/V NaN3 Ladepuffer bei einem Durchfluss von 5 mL/min.
- Laden Sie das periplasmatischen Filtrat auf die vorab äquilibriert 5 mL Q Anion Austausch Säule mit 20 mM Tris pH 7.6, 0,05 % w/V NaN3 Ladepuffer bei einem Durchfluss von 2 mL/min weiter, um die 5 mL Q Anion Austausch Spalte mit 20 mM Tris pH 7.6 waschen , 0,05 % w/V NaN3 laden Puffer bis eine Basislinie Lesung A280 bei einem Durchfluss von 5 mL/min erreicht wird.
- Eluieren gebundenen Proteins mit 20 mM Tris pH 7.6, 0,05 % w/V NaN3, 0 - 1 M NaCl durch lineare Farbverlauf über 10 Spalte Volumen bei einem Durchfluss von 5 mL/min kombinieren Brüche mit einer280 -Spitze. APO YfeA elutes 200 mM NaCl bis 300 mM NaCl.
- Das Eluat durch zentrifugale Konzentrator zu konzentrieren, bis das Volumen ~ 5 mL erreicht.
- Equilibrate eine Superdex 200 Pg Gel Filtration Spalte mit 20 mM Bis-Tris pH 6,3, 50 mM NaCl, 0,05 % w/V NaN3 Gel Filtration Puffer bei einem Durchfluß von 2,5 mL/min.
- Belastung der konzentriertere Anion Eluat auf die vorab äquilibriert Superdex 200 Pg Gel Filtration Säule auszutauschen und zu reinigen, mit Gel Filtration Puffer von Schritt 5.5 bei einem Durchfluß von 2,5 mL/min kombinieren Brüche mit einer280 Spitze entspricht einem ~ 30 Kilodalton (kDa) Protein.
Hinweis: Die folgende Referenz ist ein Beispiel FPLC Experiment die Protokoll-17zu demonstrieren.
(6) Protein Kristallisation
- Das Gel Filtration Eluat durch zentrifugale Konzentrator zu einer endgültigen Proteinkonzentration von 22 mg/mL zu konzentrieren.
- Berechnen Sie die Proteinkonzentration dividiert die A280 1,276 mg/mL zu lesen. Dieser Koeffizient theoretische Aussterben wurde von ExPASY ProtParam18vorhergesagt.
Hinweis: Ein A280 Probe lesen von 5.104 AU entspricht einer 4,000 mg/mL Lösung; 5.104 AU ÷ 1,276 mg / mL = 4,00 mg / mL.
- Berechnen Sie die Proteinkonzentration dividiert die A280 1,276 mg/mL zu lesen. Dieser Koeffizient theoretische Aussterben wurde von ExPASY ProtParam18vorhergesagt.
- Mix 1,5 µL Protein mit 1,5 µL 30 % w/V PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH-Wert von 6,3, 0,05 % w/V NaN3 Tropfen sitzen oder hängenden Tropfen Setup durch Absaugen mit einer Pipette und 10 µL Spitze.
- 2-4 Wochen inkubieren Sie Kristallisation Tropfen bei 293 K.
- Schockfrosten Kristalle in flüssigem Stickstoff-Pool für den Versand in das Synchrotron.
7. die Röntgenfluoreszenz (mit GM/CA Strahlrohr Software)
- Navigieren Sie auf die Registerkarte " Hutch " Nutzung der Energie Unterüberschrift Energie auf 10,0 eingestellt keV.
- Navigieren Sie zum Scannen tab. Navigieren der Interactive tab. Mount Probe.
- Wählen Sie das Fluoreszenzsignal optimieren. Eingabe 4,00 s unter der Unterüberschrift Zeit . Wählen Sie Fluoreszenz-Spektrum. Anzuzeigen Sie das Spektrum über Registerkarte " Plot ".
(8) MAD Scan für Metall-Energie-Absorption-Peak (mit GM/CA Strahlrohr Software)
- Verschieben Sie die Probe aus Balken. Navigieren Sie zum Scannen tab. Navigieren Sie auf die Registerkarte " Periodensystem " wählen Sie die K-Kante des Elements von Interesse.
Hinweis: Der Brennwert in Energie Zwischenüberschrift ist in eV. - Navigieren Sie auf die Registerkarte " Hutch " Nutzung der Energie Unterüberschrift Energie in Step 8.1 im keV einstellen.
- Verschieben Sie die Probe in den Strahl. Navigieren Sie zum Scannen tab. Navigieren in die Auto -Registerkarte Eingabe 2,00 s unter der Unterüberschrift Zeit .
- Wählen Sie Start Scan. Anzeigen der MAD-Scan über die Registerkarte " Plot ".
Hinweis: Der Brennwert in der Peak Zwischenüberschrift ist in eV anstatt keV. - Wählen Sie, mit Fluoreszenz getan.
- Verschieben Sie die Probe aus dem Strahl. Navigieren Sie auf die Registerkarte " Hutch " Nutzung der Energie Unterüberschrift Energie im Schritt 8.4 einstellen auf die nächste eV aufgerundet (d. h. Peak: 9658,3 eV Energie soll 9659 eV).
- Verschieben Sie die Probe in den Strahl. Daten zu sammeln. Wiederholen Sie Schritt 8.1-8.6 für alle Metalle von Interesse.
(9) analytische Protokoll für radioaktive Metall Aufnahme-Test
- In einem 14 mL Kultur Rohr, impfen mit E. Coli -Stamm BL21-CodonPlus (DE3) 5 mL LB-RIPL Zellen enthaltenden pYFE3 Plasmid16. Fügen Sie 5 µL von 50 mg/mL Ampicillin durch Absaugen mit einer Pipette und 10 µL Tipp hinzu. Schütteln Sie zu 225 u/min bei 37 ° c für 7 h.
- Pellet-Zellen bei 15.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur mit einer Tischplatte Zentrifuge. Waschen Sie die Zellen in 1 mL ergänzt M9 minimal Medien durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze. Einmal wiederholen.
- In einem 50 mL konische Rohr ergänzt Subkultur Zellen in 30 mL M9 minimalste Medien durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze. Schütteln Sie zu 225 u/min bei 37 ° c für 9 h.
- Bestimmen Sie die Menge an Radioaktivität erforderlich, um rund 100.000 Zählungen pro Minute (cpm) zu erreichen.
Hinweis: Dies variiert je nach den Radioisotopen und Instrument zur Erkennung verwendet. Beispielsweise gibt eine Probe mit 7,4 Kilobecquerel (kBq) (0,2 Mikrocurie (µCi)) von 52Mn eine Lesung von 550.000 cpm über ein automatisiertes Gamma-Detektor (NaI). So kann die Menge an Radioaktivität benötigt, um eine Anzahl von 100.000 cpm ermittelt werden, unter Verwendung der folgenden Gleichung: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7.4 kBq (0,2 µCi) = 1,35 kBq (0.036 µCi).
Achtung: radioaktiven Zerfall führt zu die Freigabe von ionisierender Strahlung, die ist gefährlich. Beim Arbeiten mit Radioaktivität verwenden Sie stets geeignete Abschirmung und folgen Sie den Prinzipien von als niedrig wie vernünftigerweise erreichbar (ALARA) mit zunehmender Entfernung und gleichzeitiger Reduzierung Belichtungszeit Abschirmung. Nur geschultes Personal sollte Radioaktivität in speziell dafür eingerichteten Labors behandeln, die für den Umgang mit radioaktiven Stoffen zugelassen sind. - Multiplizieren Sie die erforderliche Radioaktivität in Schritt 9.4 berechnet, indem das Gesamtvolumen der Subkultur, den Gesamtbetrag der Radioaktivität notwendig zu bestimmen. Fügen Sie diesen Betrag (vorzugsweise in einem kleinen Volumen von 50-100 µL) auf das Rohr mit der Subkultur, sodass es 100.000 TKP/mL und Vortex gut für 30 gibt s.
Hinweis: Für 31 mL Subkultur ist der Gesamtbetrag der Radioaktivität benötigt 1,35 kBq (0.036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1.12 µCi). - Aliquote 1 mL der Subkultur (jetzt mit radioaktiver Tracer) in einzelnen 1,5 mL Zentrifuge Rohre durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze und Ort in einem 37˚C Thermomixer mit vortexen an 1 × g. Include genug Röhren damit gibt es drei Wiederholungen für jede gewünschte Messung sowie drei zusätzliche Wiederholungen, als Standard zu verwenden (die Maßstäbe zur Seite, führen Sie die Fraktionierung Assay nicht auf Standards).
Hinweis: Bei 1, 2 und 4 h prüfen müsste insgesamt 12 Röhren. - Nach der Inkubation Zentrifugieren der Rohre bei 15.000 × g für 30 s mit einer Benchtop-Zentrifuge (vorzugsweise auf 4 ° c gekühlt) und die Überstände zu verwerfen.
- Wieder aussetzen der Zellen in 1 mL eiskaltes, hohe Salz-Puffer (Schritt 4.1) durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze und sofort für 20 min auf Eis legen.
- Pellet-die Zellen wieder auf 15.000 × g für 30 s mit einer Benchtop-Zentrifuge (vorzugsweise auf 4 ° c gekühlt) und die Überstände zu verwerfen.
Hinweis: Der Überstand enthält ungebunden Metall. - Wieder auszusetzen, die Zellen im eiskalten, wenig Salz (Schritt 4.2) durch Absaugen mit einer Pipette und 1 mL Spitze zu puffern und inkubieren Sie für 20 min auf Eis.
Hinweis: Es ist wichtig, vorsichtig aspirieren Sie per Pipette für diesen Schritt. - Pellet-Zellen bei 15.000 × g für 30 s, und sammeln Sie jede der die Überstände in neu 1,5 mL Röhrchen zentrifugieren. Nun sollte die sechs Tuben / Zeitpunkt.
Hinweis: Der Überstand enthält periplasmatischen Bruch und das Pellet enthält die häutigen und zytoplasmatischen Bruchteil. Wir verweisen auf das Pellet zytoplasmatischen Bruch. - Messung der Radioaktivität in jede Fraktion (sechs Röhren pro Zeitpunkt) sowie in den Standards im Schritt 9,6. Verwenden Sie die Menge an Radioaktivität in den Normen, um den Gesamtbetrag der Radioaktivität ursprünglich hinzugefügt, um jede Probe zu bestimmen.
- Um den Anteil der radioaktiven Aufnahme in das Periplasma zu ermitteln, verwenden die folgende Gleichung: (durchschnittliche TKP von periplasmatischen Bruch/durchschnittliche cpm Standards) X 100.
- Um den Prozentsatz der radioaktiven Aufnahme im Zytoplasma zu ermitteln, verwenden Sie die folgende Gleichung: (durchschnittliche cpm der zytoplasmatischen Bruch/durchschnittliche cpm der Standards) X 100.
- Um % total Aufnahme zu ermitteln, verwenden Sie die folgende Gleichung: ((durchschnittliche cpm der periplasmatischen Bruchteil + durchschnittliche cpm der entsprechenden zytoplasmatischen Bruch) / (durchschnittliche cpm der Standards)) X 100.
Representative Results
SDS-PAGE Gel und Gel Filtration Chromatogramme wurden gesammelt, um die Qualität der Proteinreinigung von präparativen Periplasma Fraktionierung zu bewerten. Die Reinigung des Holo, die YfeA bisher beschriebenen16; die Reinigung der Apo YfeA wurde jedoch nicht berichtet. Die Strategie zur Apo YfeA durch diese Methode beschrieben reinigen verwendet ein rekombinantes Wildtyp-Konstrukt, das keinen Affinität Tag jeglicher Art, insbesondere ein enthält, die für Protein Immunoblot (z.B. His-Tag) und ein monoklonaler Antikörper verwendet werden könnten, erkennt, dass YfeA nicht beschrieben wurde. Daher wurde Massenspektrometrie Analyse eingesetzt, um die Reinigung des YfeA zu überprüfen. YfeA durch Fraktionierung zu reinigen, empfiehlt es sich, einen linearen Elution Gradienten für Anionen-Austausch-Chromatographie (Abbildung 1) zu verwenden. Die Steigung der linearen Elution verbessert YfeA Bereicherung aus, aus denen etwa 8 % der Periplasma Fraktion auf 49 % des Messguts Anion Austausch von Densitometrie (Abbildung 1) berechnete. Diese Komposition wird auf 61 % durch Gel Filtration verbessert, und die Elution Volumen des Apo-Proteins ist identisch mit der Elution Volumen des Holo-Proteins (Abbildung 2). Massenspektrometrie-Analyse überprüft die Reinigung des YfeA durch die Erkennung von 92,5 % der YfeA Aminosäure-Sequenz, 246 Gesamt YfeA Polypeptid Spektren, 24 einzigartigen Peptide und 50 einzigartige Polypeptid-Spektren. Alternativ wurde der lineare Farbverlauf Produkt mit dem Produkt aus einem Schritt Gradienten Elution Kontrast, zur YfeA gereinigt, indem Anion Exchange über ein waschen schrittweisees von 50 mM NaCl folgte eine Elution von 250 mM NaCl (Abbildung 1). Der Farbverlauf Schritt bereichert marginal YfeA von 17 % der Periplasma Fraktion auf 18 % des Messguts Anion Austausch von Densitometrie berechnete zu komponieren. Der Schritt Gradienten Elution bereichert auch einer Protein-Schadstoff-Band, Massenspektrometrie, enthält mehrere E. Coli SBPs ähnlichen Molekulargewicht identifiziert. Durch Auflösung Grenzen unterschrieben 26/600 Superdex 200 Pg, Ähnlichkeit in der Molekulargewichte und Strukturen der kontaminierenden SBPs verbessert Gel Filtration am Rande YfeA Anreicherung auf 20 % des Messguts Gel Filtration. Ein lineare Elution Farbverlauf für unerreichbar Anion Austausch sein sollte, empfiehlt es sich, mehrere Schritt-Wäschen in Schritten von 25-50 mM NaCl zu identifizieren, die Konzentration von NaCl benötigt, um diese Verunreinigungen zu entfernen zu erkunden.
Gereinigtem Apo und Holo YfeA kristallisieren unter den gleichen Bedingungen der Kristallisation, obwohl Bilder von Apo und Holo YfeA Kristall Morphologien zeigen Unterschiede im Kristallwachstum zwischen Apo und Holo YfeA Staaten (Abbildung 3). Neben Massenspektrometrie Nachweis bestätigt Röntgenbeugung (nicht dargestellte) gesammelte Daten aus Kristalle gewachsen aus Protein gereinigt durch diese Methode die Reinigung und Kristallisation des YfeA. Das Ausmaß der Fach Belastung (zytoplasmatischen Zink zurücksetzen Apo Holo Protein im Periplasma Bruch) kann beurteilt werden, durch die Erfassung von Röntgen-Fluoreszenz-Spektren (Abbildung 4). Angesichts der Tatsache, dass Zink die primäre Substrat an rekombinanten YfeA16gebunden ist, können Röntgen-Fluoreszenz-Spektren schnell eine YfeA Probe enthält ein starkes Zink Signal mit Holo YfeA (Abbildung 4A), bezeichnend für Kreuz unterscheiden Kontamination oder eine schwache Zink Signal suggestive APO YfeA und minimaler Kreuzkontamination (Abbildung 4 b). ICP-MS-Analyse der M9 minimalen Medien versichert, dass Übergangsmetall-Ebenen im Sub-mikromolaren Bereich (nicht abgebildet); Daher sollte nach einer erfolgreichen Fraktionierung Erkennung nur minimale Mengen von Übergangsmetallen erwartet werden. Analytische Fraktionierung (Abbildung 5) kann verwendet werden, Radiometal Frachten zu messen und funktionelle Daten erfassen. Eine 60-minütige Momentaufnahme periplasmatischen und zytoplasmatischen Bruchteile von E. Coli Zellen mit dem Ausdruck YfeA zu vergleichen, nur, die volle YfeABCDE-Transporter und keine der YfeABCDE Komponenten zeigt die Folgen der Ausdruck eines rekombinanten Proteins oder eine Protein-Komplex auf Metall Aufnahme (Abbildung 6). E. Coli Zellen mit dem Ausdruck keine rekombinanten Proteins transportiert etwa die Hälfte der 52Mn hinzugefügt, um die Medien in das Zytoplasma mit minimalen Aufbewahrung in das Periplasma. Diese negative Kontrolle stellt endogenen Mangan Transport. E. Coli Zellen mit dem Ausdruck rekombinante YfeA transportiert, etwa ein Viertel der 52Mn hinzugefügt, um die Medien in das Zytoplasma mit ein weiteres Viertel in das Periplasma beibehalten. Mangan-Aufbewahrung im Periplasma und begrenzte Transport in das Zytoplasma zeigt die metabolische Nachfrage und Engpass durch die Herstellung von YfeA in der Abwesenheit des Transporters Yfe verhängt. E. Coli Zellen mit dem Ausdruck rekombinante YfeABCDE Transporter transportiert nahezu 100 % der 52Mn hinzugefügt, um die Medien in das Zytoplasma mit minimalen Aufbewahrung in das Periplasma. Augmented Mangan Transport in das Zytoplasma illustriert den Beitrag der Yfe Transporter in Mangan-Transport.
Abbildung 1: Reinigung von YfeA durch Fraktionierung. A. hypothetisches Modell für Yfe Transporter. B. SDS-PAGE Gel der YfeA Reinigung von Periplasma Bruch, mit linearen Gradienten Elution von Anion Exchange. SDS-PAGE Gel zeigt die Anreicherung von YfeA (30 kDa) über Reinigungsschritte. Schwarzer Pfeil kennzeichnet die Position der elektrophoretische Migration für YfeA. Molekulargewicht Normen auf rechten Seite angezeigt. (1) Periplasma Bruchteil. (2) Q Anion Austausch durch Spalte fließen. (3) Q Anion Austausch Spalte Peak Elution. (4) Superdex 200 Pg Gel Filtration Spalte Spitze. C. YfeA Bereicherung – gutes Beispiel. Bildverarbeitung der SDS-PAGE-Gel von B berechnet allgemeine Anreicherung von YfeA durch Densitometrie von 8 % der periplasmatischen Fraktion auf 61 % des Messguts Gel Filtration steigen. Blauen Kästen geben YfeA/Gesamt Signal für Densitometrie Berechnungen verwendet. Massenspektrometrie-Analyse der Box Band in Bahn 4 erkannt 259/280 YfeA Aminosäuren, in grüne Markierung dargestellt. Aminosäuren in der Reife Polypeptid vorhanden sind in Fettschrift aktivierte schwarz, und vertreten Aminosäuren gespalten Signalpeptid komponieren in kursiven Kleinbuchstaben grauen Text. D. YfeA Bereicherung - schlechtes Beispiel. SDS-PAGE gel der YfeA Reinigung von Periplasma Bruchteil Schritt Gradienten Elution von Anion Exchange verwenden. SDS-PAGE Gel zeigt Anreicherung von YfeA über Reinigungsschritte. Schwarzer Pfeil kennzeichnet die Position der elektrophoretische Migration von großen Protein Verunreinigung während der Anionen-Austausch-Chromatographie. Molekulargewicht Normen auf rechten Seite angezeigt. (1) Superdex 200 Pg Gel Filtration Spalte Spitze. (2) Q Anion Austausch Spalte 250 mM NaCl Schritt Gradienten Elution. (3) Periplasma Bruchteil. Bildverarbeitung von SDS-PAGE Gel aus D berechnet marginal insgesamt Anreicherung von YfeA durch Densitometrie auf maximal 20 % des Messguts Gel Filtration. Blauen Kästen geben YfeA/Gesamt Signal für Densitometrie Berechnungen verwendet. Mass Spectrometry Analyse der die der Band gekennzeichnet durch schwarzen Pfeil in Spur 1 erkannt 26 einzigartigen Peptide von LivJ (39 kDa), 25 einzigartige Peptide der EfeO (41 kDa) und 17 einzigartige Peptide von LivK (39 kDa). Alle drei Schadstoffe sind periplasmatischen E. Coli SBPs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: APO YfeA und Holo YfeA gel Filtration Chromatogramme. Schwarzer Pfeil kennzeichnet die Position der Hohlraumvolumen. Gel Filtration peaks für Apo YfeA (schwarze Kurve) und YfeA (blaue Kurve) zeigen beide Protein Holo heißt eluieren mit der gleichen Lautstärke der Elution, anzeigend, Apo, die YfeA aus der Fraktion Periplasma gereinigt hat einen ähnlichen hydrodynamischen Radius als Holo, die YfeA von insgesamt gereinigt zelluläre Inhalt nach französische Presse.
Abbildung 3. APO YfeA und Holo YfeA Kristall Morphologien. Holo YfeA kristallisiert sich als monolithische Kristall, während Apo YfeA in der Regel twinned Kristalle in der Kristallisation Zustand produziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. APO YfeA und Holo-YfeA Röntgen-Fluoreszenz-Spektren. A. Röntgen-Fluoreszenz-Spektren von Holo YfeA, das von M9 minimal Medien mit keine zusätzliche Übergangsmetall-Supplementierung, grüne Kurve gereinigt worden. Charakteristische Gipfel sind für Mangan, Eisen und Zink gekennzeichnet. B. Röntgen-Fluoreszenz-Spektren von YfeA Probe im Kontext von YfeBCDE produziert. Charakteristische Gipfel sind für Mangan, Eisen und Zink gekennzeichnet. Blaue Kurve. Röntgen-Fluoreszenz-Spektren von YfeA von den Zusammenhang von YfeBCDE und erfolgreiche Fraktionierung der Periplasma Bruch mit minimalen Kontamination der zytoplasmatischen Übergangsmetalle und/oder Holo YfeA Protein gereinigt. Rote Kurve. Röntgen-Fluoreszenz-Spektren von YfeA aus dem Kontext des YfeBCDE mit erfolglosen Fraktionierung von übermäßigen lyse und signifikante Kontamination der zytoplasmatischen Übergangsmetalle und/oder Holo YfeA Protein gereinigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Generalisierte Workflow für die Fraktionierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. 60 min radioaktives Metall Aufnahme Fraktionierung Daten. Jeder Versuch wurde dreimal durchgeführt und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Roter Balken. E. Coli -Zellen, die nicht den Yfe Transporter enthalten transportieren etwa ~ 50 % der 52Mn in das Zytoplasma nach 60 Minuten und niedrige Konzentrationen von periplasmatischen 52Mn. blaue Balkenzu erhalten. E. Coli Zellen mit den Yfe Transporter Transport > 90 % der 52Mn in das Zytoplasma nach 60 Minuten und niedrige Konzentrationen von periplasmatischen 52Mn. grüne Balkenzu erhalten. E. Coli -Zellen, die nur YfeA enthalten etwa ~ 25 % der 52Mn ins Zytoplasma zu transportieren und ~ 25 % der 52Mn in das Periplasma nach 60 Minuten behalten.
Die Radiometal verwendet, in diesem Werk, 52Mn (t1/2 = 5,59 d), Proton Bombardement auf einem natürlichen Cr-Ziel an der UAB-Zyklotron-Anlage (Birmingham, AL) produziert wurde, und wie bereits berichtet19gereinigt. Achtung: 52Mn ist ein Positronen-Emitter (β-+Avg = 242 keV, 29,4 %), und strahlt auch mehrere hochenergetische Gammastrahlen mit hoher Intensität (Eγ = 744,2, 935.5, 1434.0 keV; Ich = 90,0 %, 94,5 %, 100 %). Aus diesen Gründen muss das Experiment durchgeführt werden nach Schutz Strahlungsgesetze von ALARA, wie oben beschrieben. Alle Elemente, die als radioaktiven Abfälle sollten entsprechend enthalten, eindeutig gekennzeichnet und nach festgelegten Verfahren verworfen.
Discussion
Zelle Fraktionierung ist ein nützliches Tool für speziell sondieren die Inhaltsstoffe des zellulären Kompartiments und kann als ein nützliches Werkzeug zum Extrahieren von kleinen Molekülen wie Metall-Atome sowie Makromoleküle wie Proteine dienen. Es ist erwähnenswert, dass Zelle Fraktionierung ist keine absolute Technik und kann ohne besondere Aufmerksamkeit zu mischen/Wiederfreisetzung, Inkubationstemperatur und Inkubationszeit fehleranfällig. Unvollständige mischen kann minimal häutigen lyse und somit vernachlässigbar Fraktionierung, Fraktionierung bei Raumtemperatur kann dazu führen, dass schnelle lyse der beiden Membranen Verunreinigung von den periplasmatischen Bruch mit zytoplasmatischen Inhalt, wodurch und längere Inkubationszeiten können auch übermäßige lyse und damit Bruchteil Kontamination führen. Ein vernünftiger Kompromiss für effiziente und relativ vollständige äußere Membran lyse (unter Beibehaltung der inneren Membran) zu erreichen ist 20 Minuten Inkubation auf Eis in der hypotone Fraktionierung Puffer. Ein weiterer Aspekt ist die Methode der Extraktion, wo harte Extraktion durch Schütteln oder Wirbel beeinträchtigen die Qualität des Extraktes wie Proteinaggregation verursacht. Es wird empfohlen, wie z. B. mit Spachtel, Inversion oder Absaugen mit Pipette weiterhin qualitativ hochwertiges Material für nachgelagerte Analyse vorsichtig mischen. Reinigung von präparativen Zelle Fraktionierung kann mit variabler Wirkungsgraden auftreten, wie Abbildung 1zeigt. In einem Experiment begann YfeA als 8 % von den extrahierten periplasmatischen Inhalt (Abbildung 1), während in einem anderen Experiment begann YfeA als 17 % der periplasmatischen Inhalte (Abbildung 1). Diese Differenzen können aus mehreren Gründen wie Variable Expressivität Bedingungen (Hinzufügen von EDTA, die Wachstumsmedien steigern Expression von Genen, die durch Hunger Mechanismen wie Fell Verordnung des Veranstalters Yfe geregelt), wiederholte Verwendung eingefroren permanente Aktien und menschliches Versagen. Anstatt die Inkubationszeiten einstellen, empfiehlt es sich, die Vorbereitung skalieren. Reinigung von Periplasma Bruchteil wird empfohlen, einen linearen Farbverlauf Elution aus dem Anion Austausch chromatographische Schritt. Ein Schritt Gradienten Elution ist eine Elution Strategie nutzt diskret und abrupte Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase (i.e., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etc..). Ein linearer Farbverlauf Elution ist eine Elution-Strategie, die allmähliche Veränderung in Mobile verwendet phase Zusammensetzung (d. h. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc.). Ein Farbverlauf Schritt eignet sich zur Trennung von Molekülen, die unterschiedliche Affinitäten für die stationäre Phase haben, und einen linearen Farbverlauf Elution eignet sich für die Trennung von Molekülen, die ähnliche Affinitäten für die stationäre Phase haben. Bei Reinigung mit keine künstliche Reinigung-Tag (Verbesserung der Affinität für die stationäre Phase) von einem Zellkompartiment, die reich an einzigartigen Protein Arten Protein, empfiehlt einen linearen Farbverlauf Elution Proteine der zinsunabhängigen zu trennen, die haben Sie ähnliche Affinitäten, die stationäre Phase als das Protein des Interesses. Im Allgemeinen dürfte eine Ausbeute von 1-2 mg gereinigte Apo YfeA aus jedem Liter Kultur mit dem Ausdruck YfeA aus seiner endogenen Y. Pestis Promotor.
Röntgenfluoreszenz ist eine Technik, die es die Ermittler schnell Metallgehalt in einer Probe zu bestimmen ermöglicht, und den Prüfer über unerwartete Metall Aufnahme, die sonst unbekannten informieren. Obwohl EDTA in der hypertonen Fraktionierung Puffer lose verbundenen oder kostenlose Metall entfernen enthalten ist, kann YfeA, abgeleitet aus der Periplasma Fraktion einige Holo-Protein enthalten. Angesichts der Tatsache, dass Metall Transport ein dynamischer Prozess ist, vielleicht stammt die Holo-Protein-Inhalt aus YfeA, die noch nicht, seine Ladung zu YfeBCDE gespendet hat. Es ist erwähnenswert, dass Röntgenfluoreszenz nur insgesamt Metallgehalt misst und zeigt nicht an, wenn Metall in einem Kristallgitter bestellt, oder spezifisch an ein Protein gebunden. Um festzustellen, ob Metall ist in einem Kristallgitter angeordnet und/oder speziell an ein Eiweißmolekül gebunden, ist x-ray Scattering Datenerhebung und-Verarbeitung erforderlich. Dennoch ermöglicht Röntgenfluoreszenz für schnelle Probe Bewertung von metallischen Verunreinigungen und/oder passives Holo Protein Integration. Synchrotronstrahlung Zeit ist begrenzt und es ist nicht immer Zeit, um eine Strategie für das Sammeln von Röntgendaten Streuung auf jede Probe zu entwickeln, so Röntgenfluoreszenz ist eine wertvolle Technik zum screening viele Kristalle und Priorisierung für die Proben Röntgen Streuung der Daten sollten erfasst werden. Darüber hinaus ermöglicht die Röntgenfluoreszenz Datenerfassung aus Proben, die Röntgenstrahlen nicht beugen kann. Beim Sammeln von Fluoreszenz Röntgendaten, zeitweise das Signal ist sehr schwach und die daraus resultierende Spektren uninformativ. Um die Signalstärke zu verbessern, entweder für Röntgen-Fluoreszenz oder MAD scannen, sollten Sie erhöhen die Belichtungszeit und/oder Verringerung der x-ray beam Dämpfung. Wenn eine Probe für die x-ray Streuung Datenerhebung erkannt wird, empfiehlt es sich, sammeln Röntgendaten Streuung an einem anderen Teil der Probe als was für Röntgenfluoreszenz und MAD Scannen zu Strahlenschäden zu minimieren, verbessern die Qualität der Daten verwendet wurde Sammlung, und minimieren mögliche Reduzierung der anomale Signal.
Erkennung von radioaktiven Tracern erfordert nanomolaren Mengen von Material oder weniger, und die Verwendung von diese Tracer als molekulare Tracking-Agenten bietet eine einfache und hochempfindliche Methode der Erforschung zellulärer Prozesse. Die oben beschriebene Radiometal-Assay kann zur total Metall Aufnahme, Verteilung über die zellulären Kompartimenten sowie Tarife der Aufnahme herangezogen werden. In der Tat erfordert jeder Datenpunkt Zeit eine 40-minütige Fraktionierung; wie jeden Zeitpunkt erreicht ist, sind Zellen jedoch sofort pelleted und in hohen Salz Puffer (Abbildung 5Schritt 1) inkubiert. Radiometal Messungen der Medien, der ausrangierte hohe Salz-Puffer (Abbildung 5Schritt 1) und der periplasmatischen und zytoplasmatischen Fraktionen nach (Abbildung 5Schritt 3) zeigen, dass die hohen Salz Puffer Inkubation alle erfolgreich entfernt verbleibenden ungebunden frei Metall, das blieb nach der ersten Zentrifugation nach erreichen des Zeit-Punkts. Die ersten Zentrifugation entfernt die meisten (bis zu 80 %) die ungebunden Metall und der Zentrifugierung nach Inkubation im hohen Salz Puffer auch noch ungebunden frei Zusatzmetall entfernt. Anhaltende ungebunden frei Metall wird voraussichtlich nicht wesentlich beeinflussen Metall Transport während der 40-minütigen Fraktionierung. Der Einfluss der 40-minütigen Fraktionierung auf intrazellulären Metall Transport ist ein weiterer Aspekt für umsichtige Dateninterpretation. Nahezu tritt das gesamte Fraktionierung Protokoll über Eis, abgesehen von den 30 zweite Zentrifugation zwischen den einzelnen Schritten. Metall-Transportzeit Kurs Experimente angegeben haben, dass Zellen bei 4 ° C Aufrechterhaltung Metall Transport20,21,22 hebt; Daher, da die Experimente erfolgt über Eis, die 40-minütige Fraktionierung voraussichtlich nicht Metall Stufen in das Periplasma Zytoplasma deutlich erweitern und Metall Ebenen sollen repräsentativ für die Zeitpunkte werden bei dem die Zellen wurden zunächst centrifugalized.
Bestimmung der relativen Aufnahme in verschiedenen zellulären Kompartimenten kann helfen XFS Daten informieren, bestätigen die physiologische Natur eines Substrats sowie die Ermittler weiter untersuchen die molekularen Details eines Mechanismus zu aktivieren. Z. B. Zugabe von genetischen Mutagenese, Radiometal Aufnahme Experimente bietet eine direkte Methode, um wichtige funktionale Rückstände zu verstärken oder Moleküle beteiligt Substrattransport. Vorteile von Radiometal Aufnahme Experimenten und Analysen sind schnelle Wende, hoher Durchsatz und hohe Reproduzierbarkeit Parallelisierung von Experimenten, die Wachstumsbedingungen und genetischen Konstrukte zu vergleichen.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Auch bei GM/CA@APS, Daten, die im ganzen oder in Teilen mit Bundesmitteln aus dem National Cancer Institute (ACB-12002) und das National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006) finanziert wurde. Diese Forschung verwendeten Ressourcen der Advanced Photon Source (APS), eine US-Department of Energy (DOE) Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage betrieben für das DOE Office of Science vom Argonne National Laboratory unter Vertragsnr. DE-AC02-06CH11357. Verwendung von Advanced Photon Source wurde unterstützt vom U. S. Department of Energy, Office of Science, Büro von Energie Grundlagenwissenschaften, unter Vertragsnr. W-31-109-DEU-38.
Wir würden gerne die UAB Comprehensive Cancer Center - Mass Spectrometry/Proteomics geteilt Facility (P30CA13148-38) anerkennen, für ihre Unterstützung bei der Analyse der Massenspektrometrie.
C.D.R wurde durch ein Stipendium der University of Alabama in Birmingham Office of Diversity, Gerechtigkeit und Integration unterstützt. L.L.R. wurde von der Radiologie-Abteilung der University of Alabama in Birmingham unterstützt. Das Department of Energy, Office of Science-Isotop-Programm unterstützt 52Mn Produktion und A.V.F.M. unter DESC0015773 zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
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