Summary
Un protocole pour l’extraction d’un chaperon périplasmique métaux de transition dans le cadre de ses partenaires de liaison autochtone et caractérisation biophysique de son contenu de substrat par x-ray fluorescence et radiometal l’absorption est présentée.
Abstract
Nous démontrons une méthode évolutive pour la séparation du périplasme bactérienne du cytoplasme. Cette méthode est utilisée pour purifier une protéine périplasmique aux fins de la caractérisation biophysique et le transfert de substrat de mesure entre les compartiments périplasmiques et cytoplasmiques. Par soigneusement limiter le temps que le périplasme est séparé du cytoplasme, l’expérimentateur peut extraire la protéine d’intérêt et doser chaque compartiment individuel pour substrat sans contamination entraînée entre compartiments. Puis, la protéine extraite du fractionnement peut être davantage analysée pour déterminer la structure tridimensionnelle ou profils de liaison du substrat. Sinon, cette méthode peut être réalisée après incubation avec un radiotraceur pour déterminer l’absorption totale de pourcentage, en plus de la distribution du traceur (et donc en métal transport) à travers différents compartiments bactériennes. Expérimentation d’un radiotraceur peut aider à faire la différence entre un substrat physiologique et le substrat artéfactuelles, telles que celles causées par les mismetallation.
Fluorescence des rayons x permet de découvrir la présence ou l’absence de métal incorporation dans un échantillon, mais aussi de mesurer les changements qui peuvent survenir en métal incorporation en tant que produit des conditions de croissance, des conditions de purification, et/ou des conditions de cristallisation. X-ray fluorescence fournit également une mesure relative de l’abondance pour chaque métal, qui peut être utilisé pour déterminer le meilleur pic d’absorption d’énergie métal utilisation anormale collecte de données de diffusion des rayons x. Radiometal absorption peut servir en tant que méthode pour valider le caractère physiologique d’un substrat détecté par fluorescence de rayons x, mais aussi de soutenir la découverte de nouveaux substrats.
Introduction
Chez les bactéries Gram-négatives, piscines cytoplasmiques des atomes de métaux de transition sont augmentés et reconstitués par membrane interne ABC (cassette ATP binding) les importateurs qui atténuent métal translocation à travers la membrane interne. Protéines a-1-fixation des substrats périplasmiques Cluster (SSPE) composent un groupe de chaperons qui lient les atomes métalliques directement et ferry pour leur passer le périplasme de les livrer aux apparentés ABC importateurs1. Autres Clusters de SSPE sont dédiés au transport de substrats comme métalliques chélatés (groupe A-2), glucides (groupes B et D-1) et acides aminés (groupes B, C, F-2 et F-4) ; Néanmoins, indépendamment de substrat, SSPE suivre un évolutivement conservée pince en c pli2. Le mécanisme proposé généralisé pour le transfert de substrat SBP comprend la c-clamp, subissant une série de contorsions qui ressemblent à une dionée attrape-mouche3. En règle générale, Cluster SSPE a-1 purifier sous forme holo (liés à des métaux), bien que l’étude de ces SSPE est limitée par la difficulté de générer apo (sans métal) formes de protéine pour expérimentation4. À ce jour, les stratégies visant à étudier l’apo Cluster SSPE a-1 ont été limitées à la mutagenèse, dialyse et une dénaturation partielle avec tétraacétique (EDTA) acide chélateur5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. données structurelles issues de ces expériences suggèrent que Cluster SSPE a-1 ne suit pas précisément le mécanisme de la dionée attrape-mouche. Actuellement absent de la littérature est une méthode de production apo SSPE a-1 Cluster in vivo à l’aide de partenaires de liaison physiologique.
Nous montrons pour la première fois à l’aide de fractionnement cellulaire pour purifier YfeA, une péritonite bactérienne spontanée a-1 grappe de Yersinia pestis, l’agent étiologique de la peste, qui a été convertie en forme apo par interaction avec son importateur physiologique de YfeBCDE ABC apparenté dans la cellule. Nous montrons Qu'yfea se présente sous la forme apo par spectroscopie de rayons x dispersive en énergie (EDS), également connu sous le nom de x-ray fluorescence. Nous démontrons également des fonctionnalités de YfeBCDE en combinant le fractionnement de cellules avec des études d’absorption de métaux radioactifs hautement sensible faire la distinction entre l’absorption des métaux à travers la membrane externe et importation de métal à travers la membrane interne. L’utilisation d’un traceur radioactif permet une détection de quantités de pg/L de métaux, nettement inférieurs à la limite de détection pour des techniques telles qu’inductif spectrométrie de masse de plasma (ICP-MS) ou spectroscopie d’absorption atomique (AAS). Cela permet une perturbation minimale du système à l’étude. En outre, les méthodes traditionnelles, souvent nécessitent de plus grands volumes d’échantillon, post-traitement supplémentaire et retournement plus longs, qui ne sont pas typiques pour des dosages de traceurs radioactifs. Ainsi, à l’aide d’un radiotraceur fournit une méthode pratique et simple pour surveiller la distribution métallique et absorption dans une cellule. Il reste à déterminer si une apo que cluster SBP a-1 a produit à l’aide de cette méthode retentissaient les observations structurales des pratiques actuelles utilisées pour générer la protéine apo.
Fractionnement de cellules est une méthode établie pour séparer les compartiments cellulaires dans le but implicit de sonder précisément leur contenu en isolement12. Fractionnement de cellules est couramment utilisé pour confirmer l’emplacement d’une molécule au cours du cycle cellulaire ou de mesurer l’activité d’un compartiment particulier13. Par exemple, l’activité de transport métalliques peut être dosée par sondage des compartiments cellulaires pour substrat métallique. Intégrant le fractionnement cellulaire permet la distinction et la comparaison entre l’absorption des métaux à travers la membrane externe et de transfert de métal à travers la membrane interne. Ces processus peuvent ensuite à son tour être mesurés au fil du temps. Dans le cas de purification des protéines, les méthodes les plus courantes de la lyse cellulaire et de la séparation des composants solubles de composants insolubles sont rupture mécanique (broyage, mélange), homogénéisation à haute pression (c.-à-d. pression Français cell press, cellule perturbateurs) et les fréquences ultrasoniques (i.e., sonication)14. Utilisation des fréquences ultrasoniques pour lyser les cellules est généralement mieux adaptée pour les petits volumes ; Cependant, sonication est connue pour produire une chaleur excessive qui peut dénaturer les protéines. Pour éviter de générer une chaleur excessive, les fréquences ultrasonores sont généralement appliqués dans des éclats courts séquentiels, qui peuvent prendre beaucoup de temps et par inadvertance de dégrader des molécules d’ADN en fragments plus petits. En outre, plusieurs sondes de sonication cher peuvent être nécessaires pour les expériences analytiques et préparatives, comme chaque sonde a une portée limitée pour le volume de l’échantillon qui peut être traitée. Utilisation de haute pression à lyser les cellules évite générant une chaleur excessive lors de la lyse cellulaire par refroidissement des composants de presse de cellules de pression Français avant la lyse et de faire fonctionner un perturbateur de la cellule dans un milieu froid comme une chambre froide. Comme sondes de sonication, plusieurs ensembles de composants de presse Français pression cellulaires doive être acheté pour traiter un large éventail de volumes d’échantillon. Presse de cellule de pression Français assemblées sont facile à connecter, mais difficiles à utiliser et à nettoyer, peut être lourd à bouger et ont tendance à partir d’échantillons denses. Avantages à utiliser les fréquences ultrasonores et anticyclones à lyser les cellules comprennent la récupération de l’échantillon élevé, capable de traiter des échantillons multiples avec un minimum de contamination croisée, et réglable, force de cisaillement, qui peut être adapté pour l’optimisation de la lyse de une large gamme de types d’échantillons. Optimisation peut se produire en réglant la fréquence ultrasonique, durée des rafales, livres de pression du piston par pouce carré (lb/po2) et le nombre de passes par voie de presse. Utilisation de rupture mécanique à lyser les cellules pourrait être la stratégie plus techniquement triviale et moins coûteuse pour la lyse cellulaire. Rupture mécanique peut présenter des défis dans la récupération de l’échantillon et n’est pas idéal pour le traitement des échantillons multiples. Rupture mécanique est plus douce aux échantillons à haute pression ou des fréquences ultrasoniques, mais n’est pas un débit élevé et est sujette à la lyse inefficace. Inconvénient expérimentale de rupture mécanique, homogénéisation à haute pression et fréquences ultrasonores, est la perturbation incontrôlable de l’architecture cellulaire entière telle qu’après lyse, tous les composants de cellules aqueuses sont mélangés ensemble. En outre, tous les compartiments de la cellule ne perturbent pas en même temps ; contenu des compartiments qui lysent au début peut donc s’avérer soumis à des forces perturbatrices en cours plus de contenu de compartiments qui lysent tardif. Fractionnement de cellules permet techniquement simple, peu coûteuse et efficace axée sur le compartiment de séparation du contenu des cellules tout en évitant la nécessité d’équipements coûteux et exposition d’échantillon aux forces dures, perturbateurs.
Dans le cas de la SBP, substrat importé est réintroduite à potentiellement la protéine apo et régénère holo protéines lors de la lyse, avant chromatographie en aval ou d’autres techniques de purification. Inclusion de chélateur EDTA lors de la lyse présente un obstacle supplémentaire, où affinité métallique dans un premier temps de purification des protéines n’est pas possible car EDTA sera bande métallique de la résine de chromatographie et empêcher la protéine liant le15. Une solution simple et peu coûteuse est fractionnement cellulaire par choc osmotique, où centrifugation différentielle et réactifs de laboratoire courants permettent au chercheur de soigneusement extrait protéique suffisante pour l’analyse fonctionnelle. Fractionnement d’un choc osmotique utilise une évolution en deux étapes la pression osmotique pour séparer les compartiments cellulaires. Tout d’abord, un tampon hypertonique provoque des cellules à crénelées comme l’eau quitte chaque cellule et Deuxièmement, un tampon hypotonique entraîne des cellules à gonfler comme l’eau rentre dans chaque cellule. En contrôlant soigneusement pendant combien de temps les cellules gonflent, les membranes externes peuvent être sélectivement lysées (due à une accumulation de pression osmotique de l’arrivée d’eau), donc de vider leur contenu dans la mémoire tampon. Préservation des membranes internes s’assure que le contenu cytoplasmique est conservé en sphéroplastes et est facilement séparé du contenu périplasmique par centrifugation.
YfeA est un polyspécifiques SBP capable de lier le fer, manganèse et zinc atomes16. Les proportions relatives de métal constituée peut être modifiée selon métal supplémentation durant la croissance et dosés par fluorescence des rayons x comme est disponibles à l’Advanced Photon Source16 de Argonne National Laboratory. Fluorescence des rayons x permet au chercheur de profil rapidement une large Assemblée de métaux sans besoin de grandes ou cristaux de diffraction de qualité et peut même glaner des données d’une solution protéique précipitée ou protéiques.
Fluorescence des rayons x peut rapidement révéler des résultats inattendus tels que, dans ce cas, le substrat de YfeA primaire en zinc et non pas les substrats physiologiques documentée fer ou manganèse16. Si utilisé avant de recueillir des données de diffusion des rayons x, fluorescence x peut aviser le chercheur dans une conception expérimentale, par exemple, lesquelles énergie métal arête pour utiliser anormale collecte de données de diffusion des rayons x. Tout aussi utiles comme déterminant l’abondance relative d’une métal, x-ray fluorescence peut également déterminer si un métal est absent dans un échantillon, fournissant une méthode rapide pour séparer les cristaux contenant la protéine apo de protéine holo et estimation des métaux force du signal sans nécessiter beaucoup de temps de traitement des données. En identifiant un échantillon avec un signal fort de métal, la longueur d’onde précise à utiliser pour la collecte de données anormale aux rayons x diffusion peut être déterminé par l’analyse de la dispersion anomale de multiples longueurs d’onde (MAD).
Ce protocole détaillé est destiné à aider les nouveaux expérimentateurs avec succès accomplir fractionnement cellulaire et faire une utilisation efficace du matériel source de rayonnement synchrotron pour profil teneur totale en métal et faire progresser l’étude des protéines liant les métaux.
Protocol
1. Culture de départ bactérienne (jour 1)
- Dans un ballon jaugé de 200 mL de biseauté, ensemencer 30 mL de bouillon de Luria Bertani (LB) avec la souche d’Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL cellules de plasmide contenant pYFE316.
- Ajouter 30 µL d’ampicilline 50 mg/mL dans le ballon en aspirant avec une pipette et 200 µL astuce. Agiter pendant la nuit à 225 tr/min à 37 ° c.
2. compléter le M9 Minimal médias préparation (jour 2)
NOTE : Ceci est adapté à partir du manuel Amresco.
- Préparer 6 litres de fluides en procédant comme suit. Dans une fiole biseauté 2 L, ajouter 10,5 g de M9 milieu minimal dans 1 L d’ultra purs H2O. Autoclave à 121 ° c pendant 20 min et puis laisser refroidir à température ambiante.
- Les solutions suivantes de supplément stériles de façon aseptique : 2 mL/L de 1 M MgSO4, 10 mL/L de glucose de 20 % p/v, 0,1 mL/L de 1 M CaCl2et 1 mL/L d’ampicilline 50 mg/mL. Effectuez cette étape sous une hotte pour maintenir un environnement stérile de sécurité biologique. Réchauffer les médias à 37 ° c.
3. bactérienne sous-culture
- Ajouter 5 mL/L de culture starter d’une nuit ou plus aux médias un minimum le M9 en aspirant avec une pointe de pipette et 5 mL automatisée. Agiter la sous-culture continuellement à 225 tr/min à 37 ° c pendant 9 h.
Remarque : Au cours de cette étape YfeABCDE est surexprimé par autoinduction de son natif promoteur d’y. pestis . - Récupérer des cellules par centrifugation à 4 500 g pendant 30 min à 4 ° c. Remettre en suspension les cellules dans 50 mL d’un tampon phosphate glacé (20 mM Na2HPO4 pH 7,6, 50 mM NaCl) par aspiration avec une pipette et embout de 1 mL et geler pendant la nuit à-80 ° c.
4. cellule fractionnement (jour 3)
- Dégelez la remise en suspension à 4 ° C et pellet cellules à 4 000 x g pendant 20 min à 4 ° c. Remettre en suspension les cellules dans 50 mL de glacé haut tampon salin (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM NaCl et 2 mM EDTA) en aspirant avec une pointe de pipette et 25 mL automatisée. Incuber la suspension sur la glace pendant 20 min, avec inversion occasionnelle pour le mélange.
- Pellet les cellules à 4 500 x g pendant 20 min à 4 ° c. Remettre en suspension les cellules dans 50 mL de tampon salin faible glacé (10 mM Tris-HCl pH 8.0) en aspirant avec une pointe de pipette et 25 mL automatisée. Incuber la suspension sur la glace pendant 20 min, avec inversion occasionnelle pour le mélange.
- Pellet les sphéroplastes à 4 500 x g pendant 20 min à 4 ° c. Récupérer le surnageant contenant du périplasme. Remettre en suspension les sphéroplastes granulés dans la solution saline tamponnée au phosphate (étape 3.2) en aspirant avec une pointe de pipette et 25 mL automatisée et lyser les cellules de trois cycles de pression Français cellule presse à 1500 psi.
NOTE : Une presse de cellule de pression Français peut être difficile à exploiter et utilise une pompe hydraulique pour piloter la lyse cellulaire. Soyez prudent lorsque vous engageant la pompe hydraulique, assurer un alignement correct du piston avec la presse et en gardant les mains libres de la pompe hydraulique. - Pellet les débris cellulaires à 50 000 x g pendant 20 min à 4 ° c. Récupérer le surnageant contenant du cytoplasme. Si nécessaire, les membranes externes et internes peuvent être plus fractionné16.
5. protein Purification en utilisant FPLC
- Immédiatement après fractionnement, filtrer la fraction périplasmique en utilisant une unité de membrane de 0,45 µm. Utilisez un filtre de seringue Luer lock pour la facilité et la filtration rapide. Equilibrer une colonne d’échange d’anions 5 mL Q en utilisant 20 mM Tris pH 7,6, 0,05 % p/v NaN3 chargement tampon à un débit de 5 mL/min.
- Charger le filtrat périplasmique sur la colonne d’échangeurs d’anions préalablement équilibré 5 mL Q à l’aide de 20 mM Tris pH 7,6, 0,05 % p/v NaN3 chargement tampon à un débit de 2 mL/min. continuer à laver la colonne d’échangeurs anionique mL 5 Q à l’aide de 20 mM Tris pH 7,6 , tampon de 0,05 % p/v NaN3 charge jusqu'à l’obtention d’une lecture de base de A280 à un débit de 5 mL/min.
- Éluer la protéine liée à l’aide de 20 mM Tris pH 7,6, 0,05 % p/v NaN3, 0 - 1 M NaCl par des volumes de colonne de plus de 10 dégradé linéaire à un débit de 5 mL/min. combiner fractions contenant un pic de280 . YfeA APO élue entre NaCl de 200 mM et 300 mM NaCl.
- Concentrer l’éluat par concentrateur centrifuge jusqu'à ce que le volume atteint environ 5 mL.
- Equilibrer une colonne de filtration du gel Superdex 200 pg avec 20 mM Bis-Tris pH 6,3, 50 mM NaCl, de tampon 0,05 % p/v NaN3 gel filtration à un débit de 2,5 mL/min.
- Charge l’anion concentrée échanger éluat sur la colonne de filtration du gel Superdex 200 pg avance équilibré et purifier à l’aide de tampon de gel filtration d’étape 5.5 à un débit de 2,5 mL/min. combiner les fractions contenant un pic de280 correspondant à un ~ 30 protéine de kilodaltons (kDa).
NOTE : La référence suivante est un exemple FPLC expérience visant à démontrer le protocole17.
6. la cristallisation de protéines
- Concentrer l’éluat gel de filtration par concentrateur centrifuge à une concentration de la protéine finale de 22 mg/mL.
- Calculer la concentration de protéine en divisant l’A280 lecture de 1,276 mg/mL. Ce coefficient d’extinction théorique a été prédite par ExPASY ProtParam18.
Remarque : Une A280 échantillon lecture de 5.104 AU correspond à une solution de 4,000 mg/mL ; 5.104 UA ÷ 1,276 mg / mL = 4,00 mg / mL.
- Calculer la concentration de protéine en divisant l’A280 lecture de 1,276 mg/mL. Ce coefficient d’extinction théorique a été prédite par ExPASY ProtParam18.
- Mix 1,5 µL de protéine avec 1,5 µL de 30 % w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6,3, 0,05 % p/v NaN3 assis goutte ou suspendus installation goutte en aspirant avec une pipette et 10 µL astuce.
- Incuber les gouttes de cristallisation à 293 K pendant 2 à 4 semaines.
- Flash-gel des cristaux dans la piscine de l’azote liquide pour livraison du synchrotron.
7. x-Ray Fluorescence (en utilisant le logiciel Beamline GM/CA)
- Accédez à l’onglet de Hutch le sous-titre de l’énergie s’utilisent pour programmer les énergie à 10.0 keV.
- Accédez à l’onglet Scan naviguer à l’échantillon de Mont tab. Interactive .
- Sélectionnez le signal de fluorescence Optimize. Entrée 4,00 s sous le sous-titre de l’époque . Sélectionnez prendre le spectre de fluorescence. Découvre le spectre en utilisant l’onglet tracer .
8. MAD Scan pour métal pic d’Absorption de l’énergie (à l’aide du logiciel Beamline GM/CA)
- Déplacer l’échantillon de faisceau. Accédez à l’onglet Scan accédez à l’onglet tableau périodique sélectionnez le K-arête d’élément d’intérêt.
Remarque : La valeur de l’énergie dans la sous-position énergétique est en eV. - Accédez à l’onglet de Hutch le sous-titre de l’énergie s’utilisent pour programmer l’énergie valeur dans étape 8.1 en keV.
- Déplacer l’échantillon dans le faisceau. Accédez à l’onglet Scan accédez à l’onglet Auto entrée 2,00 s sous le sous-titre de l’époque .
- Sélectionnez Start Scan. Découvre le MAD Scan à l’aide de l’onglet Plot .
Remarque : La valeur de l’énergie dans la sous-position Peak est en eV plutôt que keV. - Sélectionnez fait avec fluorescence.
- Placez l’échantillon sur la poutre. Accédez à l’onglet Hutch utilisation le sous-titre de l’énergie pour affecter l’énergie valeur étape 8.4 arrondi jusqu'à la prochaine eV (c.-à-d., PIC: 9658,3 eV, la valeur énergétique 9659 eV).
- Déplacer l’échantillon dans le faisceau. Recueillir l’ensemble des données. Répétez l’étape 8.1-8,6 pour tous les métaux d’intérêt.
9. analyse protocole pour l’analyse de l’absorption des métaux radioactifs
- Dans un tube à culture 14 mL, inoculer 5 mL de LB avec la souche e. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL cellules de plasmide contenant pYFE316. Ajouter 5 µL d’ampicilline 50 mg/mL en aspirant avec une pipette et 10 µL astuce. Agiter à 225 tr/min à 37 ° c pendant 7 h.
- Les cellules à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse de table a granulé. Laver les cellules dans 1 mL de supplémenté M9 minimal médias en aspirant avec une pointe de pipette et 1 mL. Répéter une fois.
- Dans un tube conique de 50 mL, cellules de sous-culture dans 30 mL complétée M9 milieu minimal en aspirant avec une pointe de pipette et 1 mL. Agiter à 225 tr/min à 37 ° c pendant 9 h.
- Déterminer la quantité de radioactivité requise pour atteindre environ 100 000 coups par minute (cpm).
Remarque : Cela varie selon l’instrument utilisé pour la détection et le radio-isotope. Par exemple, un échantillon contenant 7,4 kilobecquerel (kBq) (0,2 microcurie (µCi)) de 52Mn donne une lecture de 550 000 cpm sur un détecteur de gamma automatisé (NaI). Ainsi, la quantité de radioactivité nécessaire pour obtenir un nombre de 100 000 cpm peut être déterminée selon l’équation suivante : (100 000 cpm/550 000 cpm) * 7.4 kBq (0,2 µCi) = 1,35 kBq (0,036 µCi).
ATTENTION : radioactivité entraîne la libération de rayonnements ionisants, qui est dangereux. Lorsque vous travaillez avec la radioactivité toujours utiliser le blindage approprié et conformes aux principes de comme faible possible (ALARA) en augmentant la distance et de blindage tout en réduisant les temps d’exposition. Seul le personnel qualifié doit gérer la radioactivité dans des laboratoires spécialement désignés, qui sont homologués pour l’utilisation de matières radioactives. - Multipliez la radioactivité requise calculée à l’étape 9.4 par le volume total de la sous-culture, pour déterminer la quantité totale de radioactivité nécessaire. Ajouter ce montant (de préférence dans un petit volume de 50-100 µL) dans le tube contenant la sous-culture afin qu’il y a 100 000 cpm/mL et vortexer bien pendant 30 s.
Remarque : Pour 31 mL de sous-culture, la quantité totale de radioactivité requise est 1.35 kBq (0,036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1,12 µCi). - Aliquote 1 mL de la sous-culture (maintenant contenant du traceur radioactif) dans centrifugeuse individuels 1,5 mL tubes en aspirant avec une pointe de pipette et 1 mL, et place dans un thermomixer 37˚C, avec agitation à 1 × g. Include assez tubes afin qu’il y a trois répétitions pour chacun désiré de mesure ainsi que trois répétitions supplémentaires à utiliser en tant que normes (mettre de côté les normes, ne faites ne pas l’essai de fractionnement sur les normes).
NOTE : Dosage à 1, 2 et 4 h exigerait totales 12 tubes. - Après incubation, centrifuger les tubes à 15 000 × g pendant 30 s à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse (préférence refroidie à 4 ° c) et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de glace froide, sel élevé en aspirant avec une pointe de pipette et 1 mL de tampon (étape 4.1) et placer immédiatement sur la glace pendant 20 min.
- Pellet les cellules à nouveau à 15 000 × g pendant 30 s à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse (préférence refroidie à 4 ° c) et jeter le surnageant.
Remarque : Le surnageant contient un métal libre non associé. - Remettre en suspension les cellules dans la glace froide, hyposodé en aspirant avec une pointe de pipette et 1 mL de tampon (point 4.2) et incuber sur glace pendant 20 min.
Remarque : Il est important d’aspirer doucement via la pipette pour cette étape. - Pellet les cellules à 15 000 × g pendant 30 s et percevoir chaque des surnageants dans nouveau 1,5 mL centrifuger les tubes. Maintenant, il devrait y avoir six tubes par point dans le temps.
Remarque : Le surnageant contient la fraction périplasmique et culot le membraneuse et fraction cytoplasmique. Nous nous référons au culot la fraction cytoplasmique. - Mesurer la radioactivité dans chacune des fractions (six tubes par point dans le temps), ainsi que dans les normes mis de côté en étape 9,6. Utilisez la quantité de radioactivité dans les normes pour déterminer la quantité totale de radioactivité introduite à l’origine de tous les échantillons.
- Pour déterminer le pourcentage d’absorption radioactif dans le périplasme, utilisez l’équation suivante : (cpm moyen de cpm périplasmique fraction/moyenne des normes) x 100.
- Pour déterminer le pourcentage d’absorption radioactif dans le cytoplasme, utilisez l’équation suivante : (cpm moyenne de la cpm cytoplasmique fraction/moyenne des normes) x 100.
- Pour déterminer le % total absorption, utilisez l’équation suivante : ((cpm moyen de la fraction périplasmique + cpm moyen de la fraction correspondante cytoplasmique) / (moyenne cpm des normes)) x 100.
Representative Results
Gel SDS-PAGE et gel de chromatogrammes de filtration ont été prélevés afin d’évaluer la qualité de purification des protéines par fractionnement du périplasme préparative. La purification de holo Qu'yfea a été précédemment décrit16; Toutefois, la purification de l’apo YfeA n’a été signalée. La stratégie visant à purifier apo YfeA décrite par cette méthode utilise une construction recombinant de type sauvage qui ne contient-elle pas une balise d’affinité d’aucune sorte, particulièrement celle qui pourrait être utilisé pour la protéine immunoblot (c.-à-d., His-tag) et un anticorps monoclonal qui reconnaît Qu'yfea n’a pas été décrite. Donc, analyse par spectrométrie de masse a été utilisé pour vérifier la purification de YfeA. Pour purifier les YfeA par fractionnement, il est recommandé d’utiliser un gradient d’élution linéaire pour la chromatographie par échange d’anions (Figure 1). Le gradient d’élution linéaire améliore sensiblement l’enrichissement YfeA du constituant environ 8 % de la fraction du périplasme à 49 % du produit échange anionique calculée par densitométrie (Figure 1). Cette composition est améliorée à 61 % par filtration sur gel, et le volume d’élution de la protéine apo est identique au volume d’élution de la protéine holo (Figure 2). Analyse par spectrométrie de masse vérifie la purification de YfeA grâce à la détection de 92,5 % des 50 unique polypeptide spectres, les spectres du polypeptide YfeA totales de 246, 24 peptides uniques et la séquence d’acides aminés YfeA. Sinon, pour contraster le produit dégradé linéaire avec le produit d’une élution gradient d’étape, YfeA a été purifiée par échange d’anions à l’aide d’un pas de lavage de 50 mM NaCl, suivi par une étape d’élution de 250 mM NaCl (Figure 1). Le gradient d’étape enrichit légèrement YfeA de composer les 17 % de la fraction du périplasme à 18 % du produit échange anionique calculée par densitométrie. L’élution gradient étape enrichit également un groupe de protéines contaminant que la spectrométrie de masse identifiée comme contenant plusieurs SSPE d’e. coli de poids moléculaire semblable. En raison des limites de la résolution de la HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, similitude dans les poids moléculaires et les structures des SSPE contaminantes, filtration sur gel améliorée marginalement YfeA enrichissement à 20 % du produit gel filtration. Un gradient d’élution linéaire serait inaccessible pour échange d’anions, il est recommandé d’explorer plusieurs étape lavages NaCl incréments de 25 à 50 mM pour déterminer la concentration de NaCl pour supprimer ces contaminants.
Holo et purifiée apo YfeA cristallisent dans les mêmes conditions de cristallisation, bien que les images des morphologies de crystal YfeA apo et holo montrent des différences dans la croissance des cristaux entre apo et holo YfeA États (Figure 3). En plus de la vérification de la spectrométrie de masse, données de diffraction des rayons x (non illustrées) prélevées dans des cristaux de protéine purifiée par cette méthode ont confirmé la purification et la cristallisation de la YfeA. L’étendue de la contamination de compartiment (zinc cytoplasmique revenant apo à la protéine holo dans la fraction du périplasme) peut être évaluée en capturant les spectres de fluorescence de rayons x (Figure 4). Étant donné que le zinc est le substrat primaire lié à recombinant YfeA16, spectres de fluorescence de rayons x peuvent différencier rapidement un échantillon de YfeA contenant un signal fort de zinc proportionné à holo YfeA (Figure 4 a), indicatif de croix contamination, ou un signal de faible zinc évocateur d’apo YfeA et la contamination croisée minimale (Figure 4 b). ICP-MS analyse des médias minimales M9 a confirmé des niveaux de métaux de transition sont dans la gamme sub-micromolaires (non représentée) ; par conséquent, détection de seulement de petites quantités de métaux de transition devrait avoir suite à un fractionnement avec succès. Le fractionnement analytique (Figure 5) peut être utilisé pour mesurer les taux de transport radiometal et capturer des données fonctionnelles. Un instantané en comparant les fractions périplasmiques et cytoplasmiques des cellules d’Escherichia coli exprimant YfeA seulement, le transporteur YfeABCDE complet et aucun des composants YfeABCDE révèle les conséquences d’exprimer d’une seule protéine recombinante de 60 minutes ou d’une protéine complexe sur l’absorption des métaux (Figure 6). Cellules d’Escherichia coli n’exprimant aucune protéine recombinante a transporté environ la moitié des 52Mn ajouté aux médias vers le cytoplasme avec un minimum de rétention dans le périplasme. Ce contrôle négatif représente le transport du manganèse endogène. Cellules d’Escherichia coli exprimant YfeA recombinante a transporté environ un quart des 52Mn ajouté aux médias vers le cytoplasme avec un autre quart conservé dans le périplasme. Rétention de manganèse dans le périplasme et transport limité dans le cytoplasme illustre la demande métabolique et le goulot d’étranglement imposée par la production de YfeA en l’absence d’un transporteur Yfe. Cellules d’Escherichia coli exprimant recombinant YfeABCDE transporteur transporté près de 100 % des 52Mn ajouté aux médias vers le cytoplasme avec un minimum de rétention dans le périplasme. Transport de manganèse augmentée dans le cytoplasme illustre la contribution du transporteur Yfe dans le transport du manganèse.
Figure 1. Purification de YfeA par fractionnement. A. modèle hypothétique Yfe transporteur. B. gel SDS-PAGE de YfeA purification de la fraction du périplasme, à l’aide de l’élution gradient linéaire d’échangeuse d’anions. Gel SDS-PAGE montre l’enrichissement de YfeA (30 kDa) à travers des étapes de purification. Flèche noire indique la position de migration électrophorétique pour YfeA. Normes de poids moléculaire illustrés à droite. (1) fraction du périplasme. (2) Q anion exchange colonne accréditives. (3) Q anion exchange colonne pic élution. (4) superdex 200 pg gel filtration colonne pic. C. l’enrichissement YfeA – bon exemple. Traitement de l’image du gel SDS-PAGE de B calcule l’enrichissement global de YfeA par densitométrie d’augmenter de 8 % de la fraction périplasmique à 61 % du produit gel filtration. Boîtes bleues indiquent YfeA/total signal utilisé pour les calculs de densitométrie. Analyse de spectrométrie de masse de la bande en boîte en piste 4 détecté 259/280 YfeA acides aminés, présentés en surbrillance verte. Les acides aminés présents dans le polypeptide mature sont représentés en gras noir capitalisés, et acides aminés composant le peptide signal clivées sont représentées en gris en minuscules italique. D. YfeA enrichissement - mauvais exemple. SDS-PAGE gel de YfeA purification de la fraction du périplasme, à l’aide d’étape gradient d’élution d’échange anionique. Gel SDS-PAGE montre enrichissement de YfeA à travers des étapes de purification. Flèche noire indique la position de migration électrophorétique des contaminants de protéine majeure pendant la chromatographie échangeuse d’anion. Normes de poids moléculaire illustrés à droite. (1) superdex 200 pg gel filtration colonne pic. (2) Q anion exchange colonne 250 mM NaCl étape gradient élution. (3) fraction du périplasme. Traitement de l’image de gel SDS-PAGE de D calcule marginal enrichissement global de YfeA par densitométrie jusqu'à concurrence de 20 % du produit gel filtration. Boîtes bleues indiquent YfeA/total signal utilisé pour les calculs de densitométrie. Masse d’analyse par spectrométrie de la de la bande indiquée par la flèche noire sur la voie 1 détecté 26 peptides uniques de LivJ (39 kDa), 25 peptides uniques de l’EfeO (41 kDa) et 17 peptides uniques de LivK (39 kDa). Tous les trois contaminants sont périplasmique e. coli SSPE. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. YfeA APO et holo YfeA gel chromatogrammes filtration. Flèche noire indique la position du volume vide. Filtration sur gel pics pour apo YfeA (courbe noire) et holo YfeA (courbe bleue) montrent les deux protéines déclare éluer au même volume d’élution, indiquant que l’apo Qu'yfea purifié à partir de la fraction du périplasme possède un rayon hydrodynamique similaire comme holo Qu'yfea purifié à partir de total contenu cellulaire après Français Appuyez sur.
Figure 3. YfeA APO et holo morphologies de crystal YfeA. Holo YfeA cristallise sous un cristal monolithique, tandis qu’apo YfeA produit généralement jumelées de cristaux dans les mêmes conditions de cristallisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. YfeA APO et holo spectres de fluorescence des rayons x YfeA. A. spectres de fluorescence de rayons x de holo YfeA qui a été purifiée de milieu minimal M9 avec aucune courbe de supplémentation, vert métal de transition supplémentaire. Pics caractéristiques sont étiquetés pour le manganèse, le fer et zinc. B. spectres de fluorescence de rayons x de l’échantillon YfeA produites dans le cadre de YfeBCDE. Pics caractéristiques sont étiquetés pour le manganèse, le fer et zinc. Courbe bleue. Spectres de fluorescence de rayons x de YfeA purifié à partir du contexte de YfeBCDE et réussi fractionnement de la fraction du périplasme avec contamination minime de métaux de transition cytoplasmiques et/ou holo YfeA protéine. La courbe rouge. Spectres de fluorescence de rayons x de YfeA purifié du contexte de YfeBCDE avec fractionnement infructueux de lyse excessive et une contamination importante des métaux de transition cytoplasmiques et/ou holo YfeA protéines. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Généralisé de "workflow" pour fractionnement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6. données de fractionnement absorption de métaux radioactifs 60 min. Chaque expérience a été réalisée trois fois et les barres d’erreur indiquent écart-type. Barre rouge. Cellules d’Escherichia coli qui ne contiennent pas le transporteur Yfe transportent environ environ 50 % des 52Mn dans le cytoplasme après 60 minutes et maintiennent un niveau faible de périplasmique 52Mn. barre bleue. Cellules d’Escherichia coli contenant le transport du transporteur Yfe > 90 % des 52Mn dans le cytoplasme après 60 minutes et maintenir un niveau faible de périplasmique 52Mn. barre verte. Cellules d’Escherichia coli qui contiennent seulement YfeA transportent environ environ 25 % des 52Mn dans le cytoplasme et conservent environ 25 % des 52Mn dans le périplasme après 60 minutes.
Le radiometal utilisée dans ce travail, 52Mn (t1/2 = 5,59 d), a été dressée à l’UAB Cyclotron Centre (Birmingham, Alabama) par bombardement protonique sur une cible naturelle de Cr et purifié que celui indiqué précédemment19. ATTENTION : 52Mn est un émetteur de positrons (β+avg = 242 keV, 29,4 %) et aussi émet plusieurs rayons gamma de haute énergie avec une forte intensité (Eγ = 744,2, 935,5, 1434.0 keV ; J’ai = 90,0 %, 94,5 %, 100 %). Pour ces raisons, l’expérience doit être effectuée conformément aux principes de protection de rayonnement d’ALARA, tel que décrit ci-dessus. Tous les éléments désignés comme des déchets radioactifs doivent être convenablement contenues, clairement étiquetés et mis au rebut conformément aux procédures établies.
Discussion
Fractionnement de cellules est un outil utile pour sonder précisément le contenu d’un compartiment cellulaire et peut servir comme un outil utile pour l’extraction de petites molécules telles que les atomes métalliques, ainsi que des macromolécules comme les protéines. Il est à noter que le fractionnement cellulaire n’est pas une technique absolue et peut être sujette sans une attention particulière aux mélange/remise en suspension, la température d’incubation et temps d’incubation. Mélange incomplet peut entraîner la lyse membraneuse minime et donc négligeable fractionnement, fractionnement à la température ambiante peut provoquer la lyse rapide des deux membranes entraînant la contamination de la fraction périplasmique avec contenu cytoplasmique, et temps d’incubation prolongée peuvent également entraîner la lyse excessive et donc de contamination de la fraction. Un compromis raisonnable pour parvenir à la lyse de la membrane externe efficace et relativement complet (tout en préservant la membrane interne) est de 20 minutes d’incubation sur la glace dans le tampon de fractionnement hypotonique. Une autre considération est la méthode d’extraction, où extraction dure en secouant ou en vortex susceptibles de compromettre la qualité de l’extrait comme causant l’agrégation des protéines. Il est recommandé de mélanger doucement comme par spatule, inversion ou une aspiration de matériaux de haute qualité pour l’analyse en aval de maintenir à l’aide d’une pipette. Purification de fractionnement cellulaire préparative peut se produire avec une efficacité variable, comme en témoigne la Figure 1. Dans une expérience, YfeA a commencé à 8 % de la teneur en extraite périplasmique (Figure 1), tandis que dans une autre expérience, YfeA a commencé comme 17 % de la teneur périplasmique (Figure 1). Ces différences peuvent émaner de plusieurs raisons telles que les conditions d’expression variable (ajout d’EDTA pour les milieux de culture peut augmenter l’expression de gènes régulés par des mécanismes tels que la régulation de la fourrure du promoteur Yfe famine), l’utilisation répétée du surgelé stock permanent et l’erreur humaine. Plutôt que de régler les temps d’incubation, il est recommandé d’intensifier la préparation. Purification de la fraction du périplasme est recommandée d’inclure une élution gradient linéaire de l’étape chromatographique d’anion exchange. Une élution gradient étape est une stratégie d’élution les utilisations discrète et brusques changements dans la composition de la phase mobile (i.e., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, NaCl 150 mM, etc..). Une élution dégradée linéaire est une stratégie d’élution qui utilise un changement graduel dans mobile phase de composition (c.-à-d., 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc..). Un gradient d’étape est utile pour séparer les molécules qui ont des affinités différentes pour la phase stationnaire et une élution dégradée linéaire est utile pour séparer les molécules qui ont des affinités similaires pour la phase stationnaire. Dans le cas de purification de protéine avec aucune balise de purification artificiel (pour améliorer l’affinité pour la phase stationnaire) d’un compartiment cellulaire qui est riche en espèces de protéines uniques, une élution dégradée linéaire est recommandée de séparer des protéines de ne pas intérêt qui peut ont des affinités similaires à la phase stationnaire comme la protéine d’intérêt. Généralement, un rendement de 1 à 2 mg d’apo purifiée YfeA est attendu de chaque litre de culture exprimant le YfeA de ses endogène promoteur d’y. pestis .
Fluorescence x est une technique qui permet au chercheur de rapidement déterminer la teneur en métal dans un échantillon et informer l’enquêteur inattendue incorporation de métal qui serait par ailleurs inconnue. Bien que l’EDTA est inclus dans le tampon de fractionnement hypertonique pour enlever le métal libre ou faiblement associées à, YfeA dérivé de la fraction du périplasme peut contenir des protéines holo. Étant donné que le transport métallique est un processus dynamique, peut-être la teneur en protéines holo provient de YfeA qui n’a toujours pas donné sa cargaison à YfeBCDE. Il est à noter que la fluorescence x seulement mesure la teneur totale en métal et n’indique pas si métal est ordonnée dans un réseau cristallin, ou plus précisément liée à une protéine. Pour déterminer si le métal est ordonnée dans un réseau cristallin et/ou spécifiquement lié à une molécule de protéine, traitement et collecte de données de diffusion des rayons x est requise. Fluorescence des rayons x permet néanmoins, pour l’évaluation d’exemple rapide de la contamination par les métaux et/ou intégration de protéines résiduelles holo. Temps de rayonnement synchrotron est limité et il n’y a pas toujours le temps d’élaborer une stratégie de collecte de données de diffusion des rayons x sur chaque échantillon, fluorescence x est donc une technique précieuse pour nombreux cristaux de dépistage et de hiérarchiser pour lesquels des échantillons aux rayons x données de diffusion doivent être recueillies. En outre, fluorescence des rayons x permet la collecte de données provenant d’échantillons qui peuvent diffracter pas de rayons x. Tout en collectant des données de fluorescence de rayons x, tantôt le signal peut être très faible et les spectres résultants imprécis. Pour améliorer la puissance du signal, soit pour fluorescence x ou balayage MAD, envisagez d’augmenter la durée d’exposition et/ou diminuant le rayon x de faisceau atténuation. Lorsqu’un échantillon est identifié pour la collecte des données de diffusion des rayons x, il est recommandé de collecter des données de diffusion des rayons x sur une autre partie de l’échantillon à ce qui était auparavant de fluorescence des rayons x et MAD balayage pour minimiser les dommages de rayonnement, améliorer la qualité des données collection et minimiser le potentiel de réduction du signal anormal.
Détection des traceurs radioactifs requiert une quantité de nanomolaires de matériel ou moins, et l’utilisation de ces traceurs en tant qu’agents de suivi moléculaire fournit une méthode simple et très sensible des processus cellulaires de palpage. Le test de radiometal décrit ci-dessus peut être utilisé pour déterminer l’absorption totale des métaux, répartition entre les compartiments cellulaires, ainsi que les taux d’absorption. En effet, chaque instant de données nécessite un fractionnement de 40 minutes ; Cependant, que chaque instant est atteinte, cellules sont immédiatement granulées et incubés dans haute tampon salin (Figure 5étape 1). Des mesures de radiometal des médias, mis au rebut haute tampon salin (Figure 5étape 1) et les fractions périplasmiques et cytoplasmiques après (Figure 5étape 3) indiquent que l’incubation haute tampon salin élimine avec succès tous restant un métal libre associé qui persistait après la centrifugation initiale après avoir atteint le point de temps. La centrifugation initiale supprime la plupart (jusqu'à 80 %) du métal libre non associé et la centrifugation après que incubation dans le tampon de sel élevée supprime également supplémentaire restant métal libre non associé. N’importe quel métal libre identifiant persistant ne devrait pas influencer considérablement le transport métallique pendant le fractionnement de 40 minutes. L’influence de la fractionnement de 40 minutes sur transport intracellulaire du métal est une autre considération pour l’interprétation des données prudentes. Pratiquement le protocole entier de fractionnement se produit sur la glace, en dehors de la centrifugation 30 seconde entre les étapes. Temps de transport, des expériences de cours ont indiqué que maintenir les cellules à 4 ° C abroge transport métal20,21,22; en métal par conséquent, parce que les expériences se produit sur la glace, le fractionnement de 40 minutes ne devrait pas augmenter significativement les concentrations de métaux dans le périplasme du cytoplasme et les concentrations de métaux sont censées être représentant des points de temps au cours de laquelle les cellules ont été initialement centrifugalized.
Détermination de l’absorption relative dans les différents compartiments cellulaires peut aider à informer les données XFS, confirment le caractère physiologique d’un substrat ainsi que permettre au chercheur de sonder plus loin les détails moléculaires d’un mécanisme. Par exemple, ajout de mutagenèse génétique pour des expériences d’absorption radiometal fournit une méthode directe pour renforcer les résidus fonctionnels clés ou molécules impliquées dans transport de substrat. Avantages des analyses et des expériences d’absorption radiometal sont rapide, haut débit, haute reproductibilité et parallélisation des expériences comparant les conditions de croissance et de constructions génétiques.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Données ont également été prélevées à GM/CA@APS, qui a été financé en totalité ou en partie avec des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer (ACB-12002) et le National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Cette recherche a utilisé des ressources de l’Advanced Photon Source (APS), fonctionnant sur un bureau des installations de la Science utilisateurs US Department of Energy (DOE) pour l’Office of Science DOE par Argonne National Laboratory sous le contrat no. DE-AC02-06CH11357. Utilisation de l’Advanced Photon Source a été appuyée par l’u. s. Department of Energy Office of Science, de bureau de base Sciences de l’Energie, sous le contrat no. W-31-109-Eng-38.
Nous tenons à reconnaître l’UAB Comprehensive Cancer Center - Centre de Shared Mass Spectrometry/protéomique (P30CA13148-38) pour leur aide dans l’analyse par spectrométrie de masse.
C.D.R. a été financée par une subvention de l’Université d’Alabama à Birmingham Bureau de la diversité, l’équité et l’Inclusion. L.L.R. a été pris en charge par le service de radiologie de l’Université d’Alabama à Birmingham. Le ministère de l’énergie, Office of Science, Isotope programme appuyé 52production Mn et accorder des A.V.F.M. sous DESC0015773.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
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