Summary
Протокол для извлечения сопровождающий периплазматическое переходных металлов в контексте своих партнеров родной привязки и биофизические характеристики его содержимое подложки путем рентгеновской флуоресценции и radiometal поглощение представлен.
Abstract
Мы демонстрируем масштабируемый метод для разделения бактериальный periplasm от цитоплазмы. Этот метод используется для очистки периплазматическое белка для целей биофизические характеристики и мера субстрата передачи между периплазматическое и цитоплазматических отсеков. Тщательно ограничивая время periplasm отделяется от цитоплазмы, экспериментатора может извлечь протеина интереса и пробирного каждого отсека индивидуально для подложки без переноса загрязнения между отсеками. Экстракт белка от фракционирование могут быть далее проанализированы для определения трехмерной структуры или профили субстрата привязки. Кроме того этот метод может выполняться после инкубации с радиоиндикаторных определить общий процент поглощения, а также распределение трассировщик (и следовательно металла транспорт) на различных бактериальных средах. Эксперименты с радиоиндикаторных может помочь продифференцировать между физиологическим субстратом и артефакта субстрата, например тех, которые вызваны mismetallation.
Рентгенофлуоресцентный может использоваться, чтобы обнаружить наличие или отсутствие металлических включения в образец, а также оценки изменений, которые могут возникнуть в металлические включения условий роста, очистка условий или условий кристаллизации как продукт. Рентгенофлуоресцентный также обеспечивает относительный показатель изобилия для каждого металла, который может использоваться для определения лучших пик поглощения металла энергии использовать аномальных сбора данных рентгеновского рассеяния. Radiometal поглощение может использоваться как метод для проверки физиологический характер субстрата, обнаруженных рентгенофлуоресцентный, а так же поддерживает обнаружение Роман субстратов.
Introduction
В грамотрицательных бактерий цитоплазматических бассейны атомов переходных металлов увеличилась и пополняется внутренняя мембрана ABC (АТФ привязки кассета) импортеров, которые смягчить металла транслокации через внутреннюю мембрану. Периплазматическое кластера A-1 субстрата связывающих белков (СБП) составляют группу сопровождающих, которые напрямую связать Атомы металла и паром их через periplasm, чтобы доставить их родственных ABC импортеров1. Другие кластеры СБП предназначены для перевозки субстратов, например хелатные металла (Кластер A-2), углеводы (кластеры B и D-1) и аминокислоты (групп B, C, F-2 и F-4); Тем не менее независимо от субстрата, СБП следовать эволюционно сохраняется c-образный зажим раза2. Обобщенные предлагаемый механизм для передачи субстрата SBP включает проходят серию искажения, которые напоминают Дионея3c-образный зажим. Как правило кластер A-1 СБП очищают в Холо (металл прыгните) форме, хотя изучение этих СБП ограничивается трудность в создании формы белка для экспериментов4АПО (металл бесплатно). На сегодняшний день стратегии для изучения АПО кластера A-1 СБП были ограничены мутагенеза, диализа и частичное денатурации с Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) хелатором5,6,,78 , 9 , 10 , 11. структурных данных, поступающих от этих экспериментов показывают, что кластер A-1 СБП не может точно следуют Дионея механизм. В настоящее время отсутствует из литературы является метод производства АПО A-1 СБП кластера в естественных условиях с помощью партнеров физиологических привязки.
Мы демонстрируем в первый раз, используя фракционировки клетки для того чтобы очистить YfeA, кластер A-1 SBP от Yersinia pestis, этиологический агент чумы, который был преобразован в Апо форму путем взаимодействия с его физиологических родственных импортер YfeBCDE ABC в ячейке. Мы покажем, что YfeA в форме энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (ЭЦП), также известный как рентгенофлуоресцентный Апо. Мы также продемонстрировать YfeBCDE функциональность путем объединения фракционировки клетки с высокочувствительным радиоактивных металлических поглощение исследования различать металлические поглощения всей внешней мембраны и металлических импорта через внутреннюю мембрану. Использование радиоактивных трассирующими позволяет для обнаружения ПГ/Л количество металлов, намного ниже, чем предел обнаружения техники такие как индуктивно сочетании плазменной масс-спектрометрии (ИСП-МС) или атомной абсорбционной спектроскопии (ААС). Это позволяет для минимальной возмущений изучаемой системы. Кроме того традиционные методы, перечисленные часто требуют больших объемов выборки, дополнительные постобработки и поворот вокруг времени, которые не являются типичными для радиоиндикаторных анализов. Таким образом используя радиоиндикаторных предоставляет удобный и простой метод для контроля металла и поглощения в ячейке. Это еще предстоит определить, если Апо, произведенных A-1 SBP кластера, с помощью этого метода будет повторить структурных замечаний от текущей практики, используемой для создания апо протеина.
Фракционирование клеток является установленным метод для отделять сотовой отсеков для неявные цели специально зондирующего их содержания в изоляции12. Фракционировки клетки обычно используется для подтверждения местоположения молекулы во время цикла клетки или измерения активности конкретного отсека13. Например можно assayed металла транспортной деятельности путем прощупывания сотовой отсеков для металлической подложки. Встраивание фракционировки клетки позволяет различия и сравнение металла поглощения всей внешней мембраны и металлических передачи через внутреннюю мембрану. Затем эти процессы в свою очередь может быть измерена с течением времени. В случае очищение протеина, наиболее распространенные методы лизис клеток и разделение растворимых компонентов из нерастворимых компонентов являются механические нарушения (то есть, измельчения, смешивания), высокого давления гомогенизации (т.е., Пресс французского давления клеток, клеток аннулятор) и ультразвуковой частоты (т.е., sonication)14. Использование ультразвуковых частот для Лизируйте клетки обычно лучше всего подходит для небольших объемов; Однако sonication известно для создания чрезмерного тепла, которое может денатурировать протеина. Чтобы избежать возникновения избыточного тепла, ультразвуковой частоты обычно применяются в последовательных коротких очередей, которые могут занять много времени и непреднамеренно снижают молекул ДНК на более мелкие фрагменты. Кроме того несколько дорогих sonication зонды могут потребоваться для препаративных и аналитических экспериментов, как каждый датчик имеет ограниченный диапазон для объема образца, который может быть обработан. Использование высокого давления, чтобы лизировать клетки избегает генерации чрезмерного тепла во время лизис клеток, охлаждение компонентов Пресс французского давления клеток до лизис или эксплуатации disruptor ячейки в холодной среде например холодной комнате. Как sonication зонды несколько наборов компонентов Пресс французского давления клеток может потребоваться приобрести обрабатывать широкий спектр образцов томов. Пресс французского давления клеток сборки легко подключиться, но неудобно работать и чистой, может быть тяжелым для перемещения и подвержены засорению из плотной образцов. Преимущества использования ультразвуковой частоты и высоконапорных систем для Лизируйте клетки включают высокий пример восстановления, способность обрабатывать несколько образцов с минимальными перекрестного загрязнения, и регулируемый наклон силы, которая может быть адаптирована для оптимизации лизис широкий спектр типов образцов. Оптимизация может произойти путем корректировки ультразвуковой частоты, длительности очередей, поршневые давления паундов на квадратный дюйм (psi) и количество проходов через прессу. Использование механического нарушения Лизируйте клетки могут быть наиболее технически тривиальным и наименее дорогой стратегия лизис клеток. Механическое разрушение может создавать проблемы в пример восстановления и не является идеальным для обработки нескольких образцов. Механические нарушения мягче образцы чем высокого давления или ультразвуковой частоты, но не высокую пропускную способность и подвержены неэффективных лизис. Существенное ограничение экспериментального механического нарушения, высокого давления гомогенизации и ультразвуковой частоты, является неконтролируемой нарушения всей сотовой архитектуры таким образом, что после лизиса, смешиваются все водные клеточных компонентов вместе. Кроме того все клеточных компартментов не нарушить в то же время; Таким образом содержимое отсеков, которые лизируют рано может быть предметом постоянной подрывной силы больше, чем содержимое отсеков, которые лизируют поздно. Фракционировки клетки позволяет для недорогой, технически простой, эффективной на основе отсек разделение содержимого ячейки избегая необходимости дорогостоящего оборудования и пример воздействия суровых, разрушительные силы.
В случае СПР импортированные субстрат вновь к потенциально апо протеина и восстанавливает holo белка во время лизиса, до течению хроматографии или другие методы очистки. Включение ЭДТА хелатором во время лизис представляет собой дополнительное препятствие, где метал близость в качестве первого шага очистки белков не возможно потому, что ЭДТА полосы металла из смолы хроматографии и предотвратить белка привязки15. Простое и недорогое решение является фракционировки клетки по осмотическим шоком, где дифференциального центрифугирования и общие лабораторные реагенты позволяют следователь тщательно извлечь достаточно белка для функционального анализа. Фракционирование осмотическим шоком использует двухэтапный изменения осмотического давления для отдельных клеточных отсека. Во-первых, гипертонический буфера заставляет клетки на зубчатые, как вода уходит каждой ячейки и во-вторых, гипотонические буфер вызывает клетки к набуханию как вода повторно входит в каждую ячейку. Тщательно контролируя, как долго клетки набухают, наружной мембраны можно выборочно лизированы (из-за накопления осмотического давления от входящей воды), таким образом опорожнения их содержимое в буфер. Сохранение внутренней мембраны гарантирует, что цитоплазматических содержимое сохраняются в spheroplasts и легко отделяются от периплазматическое содержимое центрифугированием.
YfeA является polyspecific SBP способны связывания железа, марганца и цинка атомов16. Относительные пропорции включены металла могут быть изменены согласно металлических добавок во время роста и assayed, рентгенофлуоресцентный такие как доступен в Аргоннской национальной лаборатории Advanced исходного фотона16. Рентгенофлуоресцентный позволяет следователю для быстро профиль широкий Ассамблея металлов без необходимости для больших или дифракционного качества кристаллов и даже может получить данные от поспешного или белковых раствор белка.
Рентгенофлуоресцентный может быстро выявить неожиданные результаты таких, как, в этом случае, основной субстрат YfeA, будучи цинка и не документированы физиологических субстратов железа или марганца16. Если используется перед сбором данных рентгеновского рассеяния, рентгенофлуоресцентный может сообщить следователю в экспериментальный дизайн, например, какие кромки металлической энергии использовать аномальных сбора данных рентгеновского рассеяния. Просто так полезно, как определить относительное обилие металла, рентгенофлуоресцентный можно также определить, если металл отсутствует в образце, обеспечивая быстрый метод разделения кристаллы, содержащие апо протеина от holo белка и оценки металла сигнала без необходимости для времени обработки данных. После выявления образец с сильным сигналом металла, точные длины волны для аномального рентгеновского рассеяния сбора данных может определяться несколькими волны аномальных дисперсии (MAD) сканирования.
Этот подробный протокол призван помочь новым экспериментаторы успешно выполняют клетки фракционирования и эффективное использование оборудования Синхротронное излучение профиль общее содержание металлов и продвигать исследования металла связывающих белков.
Protocol
1. Бактериальные закваски (1 день)
- В колбе скошенный 200 мл, 30 мл бульона (LB) Лурия Бертани штаммом Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3) прививок-RIPL клеток содержащих плазмида pYFE316.
- Добавьте 30 мкл ампициллина 50 мг/мл флакон, аспирационных с пипеткой и кончик 200 мкл. На ночь погрозит 225 rpm в 37 градусов.
2. дополнить подготовку минимальной СМИ M9 (день 2)
Примечание: Это адаптировано из руководства Amresco.
- Подготовка 6 Л жидких сред в следующем порядке. В колбе скошенный 2 Л добавить 10,5 г M9 минимальных средств массовой информации в 1 Л Ультрачистые H2O. автоклава на 121 градусов 20 минут и затем охладить до комнатной температуры.
- Асептически добавить следующие решения стерильные дополнение: 2 мл/Л 1 М MgSO4, 10 мл/Л 20% w/v глюкозы, 0,1 мл/Л 1 М CaCl2и 1 мл/Л ампициллина 50 мг/мл. Выполните этот шаг в биологической безопасности кабинета для поддержания стерильную среду. Теплый СМИ до 37 градусов.
3. бактериальные субкультуры
- Добавьте 5 мл/Л ночь закваски M9 минимальной СМИ, аспирационных с автоматизированной кончиком пипетки и 5 мл. Встряхните субкультура непрерывно в 225 об/мин при 37 ° c для 9 h.
Примечание: Во время этого шага является оверэкспрессировали YfeABCDE, аутоиндукции от своей родной Y. pestis промоутер. - Восстановите клетки центрифугированием на 4500 x г за 30 мин на 4 градусов. Ресуспензируйте клетки в 50 мл ледяной фосфатного буферного раствора (20 мм Na2HPO4 рН 7,6, 50 мм NaCl), аспирационных с пипеткой и кончик 1 мл и заморозить на ночь на-80 градусов.
4. клетки фракционирование (день 3)
- Оттепель ресуспендирования на 4 ° C и Пелле клетки на 4000 x g для 20 минут, 4 градусов. Ресуспензируйте клетки в 50 мл ледяной высокой соли буфера (200 мм трис-HCl рН 8,0, 400 мм NaCl и 2 мм ЭДТА), аспирационных с автоматизированной кончиком пипетки и 25 мл. Инкубируйте подвеска со льдом для 20 минут, с случайные инверсии для смешивания.
- Пелле клетки на 4500 x g для 20 минут, 4 градусов. Ресуспензируйте клетки в 50 мл ледяной низкой соли буфера (10 мм трис-HCl рН 8,0), аспирационных с автоматизированной кончиком пипетки и 25 мл. Инкубируйте подвеска со льдом для 20 минут, с случайные инверсии для смешивания.
- Пелле spheroplasts на 4500 x g для 20 минут, 4 градусов. Восстановите супернатанта, содержащие periplasm. Ресуспензируйте гранулированных spheroplasts в фосфат буфер солевой раствор (шаг 3.2), аспирационных с автоматизированной кончиком пипетки и 25 мл и лизировать клетки на три цикла клетки Пресс французского давления на 1500 psi.
Примечание: Ячейки нажмите французского давления может быть неудобно работать и использует гидравлический насос для привода лизис клеток. Соблюдайте осторожность при привлечении гидравлического насоса, обеспечивая надлежащее выравнивание поршня с прессой и держать руки свободными гидравлического насоса. - Пелле сотовой мусора на 50 000 x g для 20 минут, 4 градусов. Восстановите супернатанта, содержащих цитоплазму. При необходимости, наружная и внутренняя оболочки может быть далее фракционированный16.
5. белка очистки с помощью ПСОК
- Сразу же после фракционирования фильтр периплазматическое дроби с помощью мембраны 0,45 мкм. Используйте фильтр шприц замком Luer легкость и Быстрая фильтрация. Сбалансировать 5 мл Q анион обменной колонны с помощью 20 мм трис рН 7,6, 0,05% w/v НАН3 Загрузка buffer расхода 5 мл/мин.
- Загрузить периплазматическое фильтрата на предварительно уравновешенной 5 мл Q анион обменной колонны с помощью 20 мм трис рН 7,6, 0,05% w/v НАН3 Загрузка buffer расхода 2 мл/мин продолжать мыть 5 мл Q анион обменной колонны с помощью 20 мм трис рН 7,6 , 0,05% w/v НАН3 загрузки буфера до тех пор, пока базовые чтение A280 достигается при расхода 5 мл/мин.
- Элюировать связанные белком, с использованием 20 мм трис рН 7,6, 0,05% w/v НАН3, 0 - 1 М NaCl линейного градиента столбец более 10 томов на расхода 5 мл/мин комбинат фракций, содержащих280 пик. АПО YfeA elutes между 200 мм NaCl и 300 мм NaCl.
- До тех пор, пока объем достигает ~ 5 мл концентрата элюата путем центробежные концентратор.
- Сбалансировать Superdex 200 pg гель фильтрации столбца с 20 мм бис-трис pH 6,3, 50 мм NaCl, 0,05% w/v НАН3 гель фильтрации buffer расхода 2,5 мл/мин.
- Нагрузки концентрации анионов обмена элюата на столбце предварительно уравновешенной фильтрации геля Superdex 200 pg и очистить с помощью геля фильтрации буфера от 5.5 шаг на расхода 2,5 мл/мин объединить фракций, содержащих280 пика, соответствующего ~ 30 белок kilodalton (кДа).
Примечание: Следующая ссылка является примером эксперимента ПСОК для демонстрации протокол17.
6. белка кристаллизации
- Концентрат элюата фильтрации геля, центробежные концентратор к концентрации окончательный белок 22 мг/мл.
- Рассчитайте концентрацию протеина путем деления A280 чтении 1.276 мг/мл. Этот коэффициент теоретические исчезновения было предсказано ExPASY ProtParam18.
Примечание: A280 образец чтения 5.104 AU соответствует 4.000 мг/мл раствора; 5.104 AU ÷ 1.276 мг / мл = 4.00 мг / мл.
- Рассчитайте концентрацию протеина путем деления A280 чтении 1.276 мг/мл. Этот коэффициент теоретические исчезновения было предсказано ExPASY ProtParam18.
- Mix 1.5 мкл белка с 1,5 мкл 30% w/v PEG 4000, 50 мм NaCl, 20 мм бис-трис рН 6,3, 0,05% w/v НАН3 в сидя падение или висит падение установки аспирационных с пипеткой и кончик 10 мкл.
- Инкубируйте кристаллизации капли на 293 K для 2-4 недель.
- Флэш замораживание кристаллы в бассейне жидкого азота для отправки синхротрона.
7. рентгенофлуоресцентный (с помощью программного обеспечения излучение GM/CA)
- Перейдите на вкладку Хатч использования энергии подзаголовок для задания энергии 10.0 кэВ.
- Перейдите на вкладку сканирования перейдите в Интерактивный tab. горе пример.
- Выберите оптимизировать флуоресценции сигнала. Ввод 4.00 s под время подзаголовок. Выберите принять спектр флуоресценции. Просмотр с помощью вкладки участка спектра.
8. MAD сканирования для пик поглощения энергии металла (с помощью программного обеспечения излучение GM/CA)
- Перемещение образцов из пучка. Перейдите к закладке Сканировать перейдите на вкладку периодической таблицы выберите K-край элемента.
Примечание: Значение энергии в энергию подзаголовок находится в eV. - Перейдите на вкладку Хатч использования энергии подзаголовок присвоено значение шага 8.1 в кэВ энергии.
- Переместите образец в луч. Перейдите к закладке Сканировать перейдите на вкладку Auto Input 2.00 s время подраздела.
- Выберите начать сканирование. Просмотр MAD сканирования, используя вкладку Печать .
Примечание: Энергетическая ценность в подсубпозиции пик находится в eV, вместо того, чтобы кэВ. - Выберите сделано с флуоресценцией.
- Перемещение образцов из пучка. Перейдите на вкладку Хатч использования энергии подзаголовок присвоено значение шага 8.4 энергии округляется до следующей eV (то есть, пик: 9658.3 eV, установите энергии 9659 eV).
- Переместите образец в луч. Соберите набор данных. Повторите шаг 8.1-8,6 для всех металлов, представляющих интерес.
9. Аналитическая протокол Assay радиоактивных металлических поглощения
- В 14 мл культуры, прививать 5 мл фунтов с штамм E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL клеток содержащих плазмида pYFE316. Добавьте 5 мкл ампициллина 50 мг/мл, аспирационных с пипеткой и кончик 10 мкл. Погрозит 225 об/мин при 37 ° c в течение 7 ч.
- Пелле клетки на 15000 x g 1 мин при комнатной температуре с помощью настольной центрифуги. Вымойте клеток в 1 мл дополнениями M9 минимальной СМИ, аспирационных с кончиком пипетки и 1 мл. Повторите один раз.
- В 50 мл Конические трубки субкультура клетки в 30 мл дополнена M9 минимальной СМИ аспирационных с кончиком пипетки и 1 мл. Погрозит 225 об/мин при 37 ° c для 9 h.
- Определите количество радиоактивности, необходимых для достижения примерно 100 000 пунктов в минуту (cpm).
Примечание: Это будет отличаться в зависимости от радиоизотопов и инструментов, используемых для обнаружения. Например образец, содержащий 7,4 килобеккерель (КБК) (0.2 микрокюри (Μки)) 52Mn дает чтение 550000 cpm на автоматизированной гамма детектор (NaI). Таким образом, количество радиоактивности, необходимо получить количество cpm в 100,000 может определяться по следующей формуле: (100,000 cpm/550000 cpm) * 7,4 КБК (0,2 Μки) = 1,35 КБК (0,036 Μки).
Предупреждение: радиоактивного распада приводит освобождение ионизирующего излучения, который является опасным. При работе с радиоактивностью всегда используйте соответствующие экранирование и следовать принципам о как низких как разумно достижимые (ALARA), увеличивая расстояние и экранирование при одновременном сокращении времени экспозиции. Только обученный персонал должен обрабатывать радиоактивности в специально назначенных лабораторий, которые лицензированы для использования радиоактивных материалов. - Умножьте необходимые радиоактивности, определяется общий объем субкультуры, чтобы определить общее количество необходимых радиоактивности в шаге 9.4. Добавить эту сумму (предпочтительно в небольшой объем 50-100 мкл) в пробирку, содержащую субкультуры, так что есть 100000 cpm/мл и вихрь хорошо для 30 s.
Примечание: Для 31 мл субкультуры, общее количество радиоактивности требуется — 1,35 КБК (0,036 Μки) x 31 мл = 41,3 КБК (1.12 Μки). - Алиготе 1 мл субкультуры (теперь содержащие радиоактивные трассирующими) в центрифугу отдельные 1,5 мл пробирок, аспирационных с кончиком пипетки и 1 мл, и место в 37˚с thermomixer, с vortexing на 1 × g. включить достаточно трубы так, что есть три реплицирует для каждого желаемого измерения, а также три дополнительных реплицирует для использования в качестве стандартов (отложите стандарты, не выполняют assay фракционирование по стандартам).
Примечание: Опробование на 1, 2 и 4 h потребует всего 12 тюбиков. - После инкубации, центрифуга трубы на 15000 × g за 30 сек с использованием настольная центрифуга (предпочтительно с охлаждением до 4 градусов) и отбросить supernatants.
- Вновь приостановить клеток в 1 мл ледяной, высокой соли буфера (шаг 4.1), аспирационных с кончиком пипетки и 1 мл и немедленно разместить на льду за 20 мин.
- Пелле клетки снова на 15000 × g за 30 сек с использованием настольная центрифуга (предпочтительно с охлаждением до 4 градусов) и отбросить supernatants.
Примечание: Супернатант содержит несвязанные бесплатно металла. - Вновь приостановить клетки в ледяной, низкой концентрацией соли буфера (шаг 4.2), аспирационных с кончиком пипетки и 1 мл и инкубировать на льду за 20 мин.
Примечание: Важно осторожно аспирационная через пипетку для этого шага. - Пелле клетки на 15000 × g 30 s и собирать каждый из supernatants в новый 1,5 мл центрифуга трубы. Теперь должно быть шесть трубы на момент времени.
Примечание: Супернатант содержит периплазматическое дроби и гранулы содержит мембранных и цитоплазматических дроби. Мы называем гранул цитоплазмы дроби. - Измерения радиоактивности в каждой фракции (шесть трубки на момент времени), а также в стандартах, отложите в 9,6 шаг. Используйте количество радиоактивности в стандартах, чтобы определить общее количество радиоактивности, первоначально добавляется каждый образец.
- Для определения доли поглощения радиоактивного излучения в periplasm, используйте следующее уравнение: (средний cpm периплазматическое дроби/средний cpm стандартов) x 100.
- Для определения доли поглощения радиоактивного излучения в цитоплазме, используйте следующее уравнение: (средний cpm цитоплазматических дроби/средний cpm стандартов) x 100.
- Чтобы определить общее поглощение %, используйте следующее уравнение: ((средний cpm периплазматическое фракция + средний cpm соответствующей фракции цитоплазматических) / (средний cpm стандартов)) x 100.
Representative Results
Геля SDS-PAGE и гель фильтрации хроматограммы были собраны для оценки качества очистки белков от препаративной periplasm фракционирования. Очистки holo YfeA был ранее описанные16; Однако очистки АПО YfeA не сообщалось. Стратегия для того чтобы очистить АПО YfeA описал этот метод использует рекомбинантных дикого типа конструкции, которая не содержит тег соответствие любого рода, особенно один, который может использоваться для белка immunoblot (то есть, его тегов) и моноклональных антител, признает, что YfeA не были описаны. Таким образом масс-спектрометрия анализ был использован для проверки очистки YfeA. Чтобы очистить YfeA путем фракционирования, рекомендуется использовать градиент линейной элюции анион обмен хроматографии (рис. 1). Градиент линейной элюции значительно улучшает YfeA обогащения от составляющих примерно 8% periplasm фракции до 49% анион обмен продукта, рассчитанные денситометрия (рис. 1 c). Эта композиция улучшается до 61% путем фильтрации геля, и объем элюции апо протеина идентичен элюции объем белка Холо (рис. 2). Масс-спектрометрия анализ проверяет очистки YfeA путем обнаружения 92,5% аминокислотной последовательности YfeA, 246 всего YfeA полипептидных спектрах, 24 уникальных пептидов и 50 уникальных полипептидных спектрах. Кроме того для контраста линейного градиента продукт с продуктом от шаг градиента элюции, YfeA был очищен, анион exchange с помощью мыть поэтапно 50 мм, затем NaCl элюции 250 мм NaCl (рис. 1 d). Шаг градиента незначительно обогащает YfeA от сочинения 17% periplasm фракции до 18% анион обмен продукта, рассчитанные денситометрия. Шаг градиента элюции также обогащает группа загрязнителем белка, масс-спектрометрия, определены как содержащий несколько E. coli СБП аналогичные молекулярной массы. Из-за пределы резолюции HiLoad 26/600 Superdex 200 ПГ, сходство в молекулярным весом и структур загрязняющих СБП, гель фильтрации незначительно улучшилось YfeA обогащение до 20% гель фильтрации продукта. Следует ли градиент линейной элюции недостижимой для обмена анион, рекомендуется изучить несколько моек шаг 25-50 мм с шагом NaCl для определения концентрации NaCl, необходимых для удаления таких загрязнений.
Очищенная АПО и Холо YfeA кристаллизоваться в тех же условиях кристаллизации, хотя изображения АПО и Холо морфологии кристаллов YfeA показывают различия в рост кристалла АПО и Холо YfeA государств (рис. 3). В дополнение к проверке масс-спектрометрии рентгеновской дифракции (не показан) собранные данные из кристаллов, выращенных из белка, очищенная методом подтвердил очищения и кристаллизации YfeA. Степень загрязнения (возврат АПО holo белка в periplasm фракции цитоплазматических цинка) отсек можно оценить путем захвата рентгеновских спектров флуоресценции (рис. 4). Учитывая, что цинк является основной субстрат, привязан к рекомбинантным YfeA16, рентгеновские спектры флуоресценции можно быстро различать YfeA образцы, содержащие сигнал сильный цинка соразмерно holo YfeA (Рисунок 4A), свидетельствует о крест загрязнения, или сигнал слабый цинка наводящий АПО YfeA и минимальным перекрестного загрязнения (рис. 4В). ICP-MS анализ M9 минимальной СМИ подтвердил, что уровни переходных металлов в суб обработку диапазона (не показано); Таким образом следует ожидать обнаружения только минимальное количество переходных металлов после успешного фракционирования. Аналитический фракционирование (рис. 5) может использоваться для измерения radiometal транспортные тарифы и захватить функциональных данных. 60-минутный снимков, сравнивая периплазматическое и цитоплазматических фракций клеток кишечной палочки , выражая YfeA только, полный YfeABCDE транспортер и ни один из компонентов YfeABCDE показывает последствия выражения одного рекомбинантных белков или в белкового комплекса на поглощение металла (рис. 6). E. coli клетки, выражая не рекомбинантных белков транспортируется приблизительно половина из 52Mn, добавлен к средствам массовой информации в цитоплазму с минимальным задержке в periplasm. Этот отрицательный контроль представляет транспорт эндогенных марганца. E. coli клетки, выражая рекомбинантных YfeA перевезено около четверти 52Mn, добавлены к средствам массовой информации в цитоплазму с другого квартала, сохранена в periplasm. Марганец удержания в periplasm и ограниченной сети транспорта в цитоплазму демонстрирует метаболических спроса и узким, введенных по производству YfeA в отсутствие Yfe транспортер. E. coli клетки, выражая рекомбинантных YfeABCDE транспортер перевезено почти 100% 52Mn, добавлен к средствам массовой информации в цитоплазму с минимальным задержке в periplasm. Дополненной марганца транспорта в цитоплазму иллюстрирует вклад Yfe транспортер в транспорте марганца.
Рисунок 1. Очистка YfeA путем фракционирования. А. Гипотетическая модель для Yfe транспортер. Б. геля SDS-PAGE YfeA очистки от periplasm фракция, используя линейный градиент элюции от анион обмена. Геля SDS-PAGE показывает обогащения YfeA (30 кДа) очистки шагов. Черная стрелка обозначает положение электрофоретической миграции для YfeA. Молекулярный вес стандарты показано справа. (1) periplasm фракция. (2) Q анион обмен столбец потока через. (3) Q анион обмен столбец пик элюции. (4) superdex 200 pg гель фильтрации столбца пик. C. YfeA обогащения – хороший пример. Обработка изображений геля SDS-PAGE от B вычисляет общее обогащение YfeA, денситометрия увеличится с 8% периплазматическое фракции до 61% гель фильтрации продукта. Синие указывают YfeA/общий сигнал, используемый для вычисления денситометрия. Масс-спектрометрия анализ упакованного группы в переулок 4 обнаружен 259/280 YfeA аминокислоты, представленные в зеленые выделения. Аминокислоты в зрелых полипептид представлены черным полужирным шрифтом прописными, а аминокислоты, составляющих пептид рассеченного сигнала представлены в строчные курсивом серого. Д. YfeA обогащения - плохой пример. YfeA очистки от periplasm фракция, геля SDS-страницы с помощью градиента элюции шаг от обмена анион. Геля SDS-PAGE показывает обогащения YfeA очистки шагов. Черная стрелка обозначает положение электрофоретической миграции крупных белковых загрязнений, улучшено во время анион обмен хроматографии. Молекулярный вес стандарты показано справа. (1) superdex 200 pg гель фильтрации столбца пик. (2) Q анион обмен столбец 250 мм NaCl шаг градиента элюции. (3) periplasm фракция. Обработка изображений геля SDS-PAGE от D вычисляет маргинальных общее обогащение YfeA, денситометрия максимум 20% гель фильтрации продукта. Синие указывают YfeA/общий сигнал, используемый для вычисления денситометрия. Массового спектрометрирования анализ группы, которая обозначена черной стрелкой в полосе 1 обнаружено 26 уникальных пептиды LivJ (39 кДа), 25 уникальных пептиды ФШДВ (41 kDa) и 17 уникальных пептиды LivK (39 кДа). Все три загрязнители являются периплазматическое E. coli СБП. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. АПО YfeA и Холо YfeA гель фильтрации хроматограммы. Черная стрелка обозначает положение недействительным тома. Пики геля фильтрации для АПО YfeA (черная кривая) и Холо, YfeA (синяя кривая) показывают, как белка государства элюировать на того же объема элюции, о том, что что Апо, которую YfeA очищенного от periplasm фракция имеет аналогичные гидродинамических радиус как Холо, которую YfeA очищенного от всего Сотовый содержание после того, как Французская пресса.
Рисунок 3. АПО YfeA и морфологии кристалл holo YfeA. Holo YfeA кристаллизуется в виде монолитной кристаллов, в то время как apo YfeA обычно производит сдвоенный кристаллы в том же состоянии кристаллизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Holo YfeA рентгеновской флуоресценции спектров и АПО YfeA. А. рентгеновских спектров флуоресценции holo YfeA, который был очищен от минимальной СМИ M9 с кривой добавок, зеленый без дополнительных переходных металлов. Характеристика пики помечены для марганца, железа и цинка. Б. рентгеновских спектров флуоресценции от YfeA образца производится в контексте YfeBCDE. Характеристика пики помечены для марганца, железа и цинка. Синяя кривая. Рентгеновские спектры флуоресценции YfeA, очищенного от контекста YfeBCDE и успешных фракционирование с минимальным загрязнением цитоплазматических переходных металлов и/или holo YfeA белка periplasm фракции. Красная кривая. Рентгеновские спектры флуоресценции YfeA, очищенного от контекста YfeBCDE с неудачной фракционирование от чрезмерного лизис и значительное загрязнение цитоплазматических переходных металлов и/или holo YfeA белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Обобщенный рабочий процесс для фракционирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. 60 мин радиоактивных металлических поглощение фракционирование данных. Каждый эксперимент был проведен в три раза, и погрешностей указать стандартное отклонение. Красный бар. E. coli клетки, которые не содержат транспортер Yfe транспорт примерно ~ 50% 52Mn в цитоплазму после 60 минут и поддерживать низкий уровень периплазматическое 52Mn. синяя полоса. E. coli клетки, содержащие Yfe транспортер транспорт > 90% 52Mn в цитоплазму после 60 минут и поддерживать низкий уровень периплазматическое 52Mn. зеленый бар. E. coli ячейки, которые содержат только YfeA транспорт примерно ~ 25% 52Mn в цитоплазму и сохранять ~ 25% 52млн в periplasm после 60 минут.
Radiometal, используемый в этой работе, 52Mn (t1/2 = 5.59 d), был подготовлен на объекте циклотрон UAB (Бирмингем, Алабама) бомбардировкой протонов на естественный Cr целевой и очищенный как сообщалось ранее,19. Предупреждение: 52Mn является позитронно-излучатель (β+avg = 242 кэВ, 29,4%), а также выдает несколько высоких энергий гамма-излучения с высокой интенсивностью (Eγ = 744,2, 935.5, 1434.0 кэВ; Я = 90,0%, 94,5%, 100%). По этим причинам эксперимент должны выполняться следующие принципы радиационной защиты Алары, как описано выше. Все отмеченные как радиоактивные отходы должны надлежащим образом содержащиеся, четко обозначены и удаляются в соответствии с установленными процедурами.
Discussion
Фракционирование клеток является полезным инструментом для специально зондировать содержимое клеточной отсека и может служить полезным инструментом для извлечения мелких молекул, таких как атомы металла, а также макромолекул таких белков. Стоит отметить, что фракционирование ячейки не является абсолютным методом и может быть подвержен ошибкам без тщательного внимания к смешивания/взмучивания, температуры инкубации и время инкубации. Неполные смешивания может привести к минимальным мембранное лизис и таким образом незначительным фракционирования, фракционирование при комнатной температуре может вызвать быстрый лизис обоих мембраны, что приводит к загрязнению периплазматическое фракции цитоплазматических содержимым, и Расширенные инкубации раз может также привести к чрезмерной лизис и, таким образом, доля загрязнения. Разумный компромисс для достижения эффективной и относительно законченным внешней мембраны лизис (при сохранении внутренней мембраны) — 20 минут инкубации над льдом в буфере гипотонический фракционирования. Еще одно соображение является метод извлечения, где суровые экстракции путем встряхивания или вихря может поставить под угрозу качество экстракт например вызывая агрегации белков. Рекомендуется осторожно перемешать такие как шпателем, инверсия или аспирационных пипетку для поддержания высокого качества материала для анализа ниже по течению. Очистка от препаративной клеток фракционирование может произойти с переменной эффективность как видно на рисунке 1. В одном эксперименте, YfeA начал как 8% от извлеченного периплазматическое содержания (рис. 1 c), в то время как в другом эксперименте, YfeA начал в 17% периплазматическое содержания (рис. 1 d). Эти различия могут возникать от нескольких причин, таких как выражение переменной условия (Добавление, ЭДТА в СМИ роста может увеличить экспрессии генов, регулируется голода таких механизмов, как мех регулирование Yfe промоутер), неоднократное использование замороженных Постоянные акции и человеческой ошибки. Вместо того, чтобы корректировать время инкубации, рекомендуется для наращивания масштабов подготовки. Очистка от periplasm фракция рекомендуется включать линейного градиента элюции от анион обмен хроматографического шаг. Шаг градиента элюции является стратегией элюции использует дискретные и резкие изменения в мобильных фазового состава (т.е., 0 мм NaCl, 50 мм NaCl, 150 мм NaCl и т.д.). Линейный градиент элюции является элюции стратегия, которая использует постепенного изменения в мобильных фаза состава (т.е. 0 мм NaCl, 5 NaCl, 10 мм NaCl, и т.д.). Градиент шаг полезным для разделения молекул, которые имеют различные сродства для стационарной фазы, и линейного градиента элюции полезен для разделения молекул, которые имеют аналогичные узы для стационарной фазы. В случае очистки белков с тегом не искусственной очистки (для усиления сродство для стационарной фазы) из клеток отсека, который богат видов уникальных белков, линейного градиента элюции рекомендуется отделить белки беспроцентное, который может Есть аналогичные сродства к стационарной фазы как протеина интереса. Как правило, доход по 1-2 мг очищенного АПО YfeA ожидается от каждого литра культуры, выражая YfeA от его эндогенного Y. pestis промоутер.
Рентгенофлуоресцентный — это метод, который позволяет детектива, чтобы быстро определить содержание металла в образце и информировать следователя о неожиданных металла включения, которые в противном случае было бы неизвестно. Хотя ЭДТА включен в буфере гипертонический фракционирование удалить слабо связанные или бесплатно металл, YfeA, производного от periplasm фракция может содержать некоторые holo белка. Учитывая, что металлические транспорт представляет собой динамичный процесс, возможно содержание белка holo происходит от YfeA, который до сих пор не предоставил его груз YfeBCDE. Стоит отметить что рентгенофлуоресцентный только измеряет общее содержание металлов и не указывать, если приказал в кристаллической решетке металла, или конкретно связан с белком. Чтобы определить, если металл приказал в кристаллической решетке и/или конкретно привязаны к белковой молекулы, требуется рентгеновского рассеяния сбора и обработки данных. Тем не менее рентгенофлуоресцентный позволяет для быстрый пример оценки металлических загрязнения и/или остаточные holo белка интеграции. Синхротронного излучения время ограничено и не всегда время разработать стратегию сбора данных рентгеновского рассеяния на каждый образец, таким образом рентгенофлуоресцентный — это ценный метод скрининга много кристаллов и их приоритетности для которых образцы рентгеновского рассеяние данные должны собираться. Кроме того рентгенофлуоресцентный включает сбор данных от образцов, которые могут не преломлять рентгеновские лучи. Во время сбора данных рентгеновской флуоресценции, порой сигнал может быть очень слабыми и результате спектры малоинформативным. Чтобы улучшить силу сигнала, либо рентгенофлуоресцентный или БЕЗУМНЫЙ сканирование, рассмотреть вопрос об увеличении времени экспозиции или уменьшения рентгеновского пучка затухания. Когда образец определяется для сбора данных рентгеновского рассеяния, рекомендуется собирать данные рентгеновского рассеяния на другой части образца, чем то, что был использован для рентгеновской флуоресценции и MAD, сканирование, чтобы свести к минимуму радиационного повреждения, улучшить качество данных коллекции и свести к минимуму любые возможности для сокращения аномальных сигнала.
Обнаружение радиоактивных трассеров требует наномолярных количеств материала или меньше, и использование этих Трейсеры как молекулярные отслеживания агентов предоставляет простой и чувствительный метод зондирующего клеточных процессов. Radiometal assay изложенные выше может использоваться для определения всего металлические поглощения, распределение по сотовой отсеков, а также темпы поглощения. Действительно каждая точка данных время требует фракционирование 40 минут; Однако как каждый момент времени будет достигнуто, клетки немедленно гранулированных и инкубировали в высокой соли буфера (рис. 5Шаг 1). Radiometal измерения СМИ, отбрасываются высокой соли буфера (рис. 5Шаг 1) и периплазматическое и цитоплазматических фракции после (рис. 5Шаг 3), свидетельствуют о высокой соли буфера инкубации успешно удаляет все оставшиеся несвязанные бесплатно металл, который задержался после первоначального центрифугирования после достижения момента времени. Первоначальный центрифугирования удаляет большинство (до 80%) несвязанные бесплатно металла и центрифугирования после инкубации в буфере высокой соли также удаляет дополнительные оставшиеся несвязанные бесплатно металла. Не ожидается, что любой затяжной несвязанные бесплатно металл значительно влияние металла транспорта в течение 40 минут фракционирования. Влияние фракционирования 40 минут на внутриклеточный транспорт металла является еще одним соображением для интерпретации данных разумно. Практически весь фракционирование протокола происходит над льдом, помимо 30 второй центрифугирования между шагами. Металлический транспорт время курс эксперименты показали, что поддержание клеток при температуре 4 ° C аннулирует металла транспорта20,,2122; Таким образом потому что экспериментов происходит над льдом, фракционирование 40 минут, как ожидается, не значительно увеличить металла уровней в periplasm цитоплазмы и металла уровни, как ожидается, будет представитель моменты времени, в которые были клетки Первоначально centrifugalized.
Определение относительного поглощения в разных отсеках сотовой может помочь информировать XFS данные, подтверждающие физиологический характер субстрата, а также включить следователю для дальнейшего зонд молекулярных детали механизма. Например, добавление генетических мутагенеза radiometal поглощение экспериментов обеспечивает прямой метод для укрепления ключевых функциональных остатков или молекулы участвует в субстрат транспорта. Преимущества radiometal поглощение экспериментов и анализа включают быстрый поворот, высокая пропускная способность, высокая воспроизводимость и распараллеливание экспериментов, сравнивая условия роста и генетической конструкции.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.
Acknowledgments
Данные были также собраны в GM/CA@APS, которая финансировалась целиком или частично с федеральных средств от национального института рака (ACB-12002) и национального института Генеральной медицинских наук (AGM-12006). Это исследование используется ресурсы расширенный источник Фотон (APS), Департамента энергетики США (DOE) управление науки пользователя объекта действуют для Доу отделение науки Аргоннской национальной лаборатории по контракту № ДЕ AC02-06CH11357. Использование передовых источника Фотон было поддержано США Министерство энергетики, управление науки, Управление основных энергетических наук, под контракт № W-31-109-Рус-38.
Мы хотели бы отметить ЗАО всеобъемлющем онкологический центр - масс спектрометрии/протеомики Общий фонд (P30CA13148-38) за их помощь в анализе масс-спектрометрии.
C.D.R. была поддержана грантом от университета штата Алабама в Бирмингем управлением многообразия, равенства и включение. L.L.R. была поддержана рентгенологического отделения университета штата Алабама в Бирмингеме. Министерство энергетики, управление науки, изотоп программа поддерживает 52Mn производства и Грант A.V.F.M. под DESC0015773.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
- ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
- Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
- Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
- Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
- Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
- Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
- Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
- McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
- Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
- Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
- Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
- Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
- Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
- Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
- Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
- Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
- Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).
