Summary
פרוטוקול על החילוץ של מלווה מתכות מעבר periplasmic בהקשר של שותפיה כריכה מקורית, אפיון ביופיזיקלי של התוכן המצע שלה על ידי צילום רנטגן ספיגת קרינה פלואורסצנטית ו radiometal מוצג.
Abstract
נדגים שיטה מדרגי הפרדת periplasm חיידקי של הציטופלסמה. שיטה זו משמשת לטהר את החלבון periplasmic לצורך אפיון biophysical, מידה העברת סובסטרט בין תאים periplasmic, cytoplasmic. על ידי הגבלת בזהירות הפעם שבה מופרד periplasm הציטופלסמה, הנסיין ניתן לחלץ את החלבון עניין, assay כל תא בנפרד עבור המצע ללא זיהום carry-over בין התאים. החלבון שחולצו מן fractionation ניתן אז עוד יותר לנתח עבור קביעת המבנה התלת-ממדי או פרופילים של המצע מחייב. לחלופין, ניתן לבצע בשיטה זו לאחר דגירה עם radiotracer כדי לקבוע ספיגת אחוז הכולל, וכן חלוקת רכיב המעקב (ואת ומכאן מתכת תחבורה) על פני תאי חיידקים שונים. ניסויים radiotracer יכול לעזור להבדיל בין המצע פיזיולוגיים לבין המצע artefactual, כגון אלה נגרם על-ידי mismetallation.
פלואורסצנציה רנטגן יכול לשמש כדי לגלות נוכחות או היעדרות של התאגדות מתכת במדגם, וכן למדוד שינויים שעלולות להתרחש תוך שילוב מתכת כמוצר של תנאי הגידול, טיהור תנאים, ו/או תנאים התגבשות. פלואורסצנציה רנטגן מספק גם מדד יחסי של שפע של כל מתכת, אשר יכול לשמש כדי לקבוע הפסגה ספיגת אנרגיה מתכת הכי טוב להשתמש עבור אוסף נתוני הפיזור רנטגן חריגה. ספיגת Radiometal יכול לשמש כשיטה לאמת מהות מצע זוהה על ידי פלואורסצנציה רנטגן פיזיולוגיים, כמו גם תמיכה הגילוי של סובסטרטים הרומן.
Introduction
בחיידקים גראם שליליים, בריכות cytoplasmic של מתכות מעבר אטומי גדל, מחדש באמצעות ממברנה פנימית ABC (ATP מחייב קלטת) מייבאים להמתיק רוברטסונית מתכת על פני קרום פנימי. Periplasmic אשכול a-1 המצע מחייב חלבונים (SBPs) להלחין קבוצת מלווים לאגד את אטומי מתכת ישירות, המעבורת להם לעבור periplasm כדי לספק אותם ABC cognate יבואנים1. אחרים אשכולות SBPs מוקדשות להעברה של מצעים, כגון מתכת chelated (אשכול A-2), פחמימות (אשכולות B ו- D-1) חומצות אמינו (אשכולות ב, ג, F-2, F-4); למרות זאת, ללא קשר המצע, SBPs בצע של קיפול c-קלאמפ והתפאורה אבולוציונית2. המנגנון המוצע מוכללת SBP המצע העברה כוללת את c-הצבת שעברו סדרת מנסה להתקבל לקרקס הדומות דיונאה3. באופן כללי, SBPs a-1 אשכול לטהר בטופס (מאוגד-מתכת) ההולוגרפי, על פי מחקר של SBPs אלה הוא מוגבל על ידי הקושי ביצירת טפסים (ללא מתכת) אפו של חלבון עבור ניסויים4. עד כה, אסטרטגיות ללמוד apo אשכול SBPs a-1 היה מוגבל מוטגנזה מכוונת, דיאליזה, דנטורציה חלקית עם ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. מבני נתונים שמקורם ניסויים אלה מראים כי אשכול SBPs a-1 אולי לא בדיוק פעל מנגנון דיונאה. חסרים כיום בספרות היא שיטה לייצר אפו SBPs a-1 אשכול ויוו באמצעות שותפים איגוד פיזיולוגיים.
נדגים בפעם הראשונה באמצעות תא fractionation לטהר YfeA, SBP a-1 של האשכול מן Yersinia pestis, הסוכן etiological של המגפה, אשר הוסב לטופס apo תוך אינטראקציה עם היבואן YfeBCDE ABC cognate הפיזיולוגיים שלו בתא. אנו מראים ש-yfea היא בצורה אפו על ידי אנרגיה-ואנליזת הספקטרומטריה (עורכים), הידוע גם בשם פלואורסצנציה רנטגן. נדגים גם פונקציונליות YfeBCDE על-ידי שילוב תא fractionation עם רגישות גבוהה ספיגת מתכת רדיואקטיבי מחקרים כדי להבחין בין ספיגת מתכת על פני הממברנה החיצונית וייבוא מתכת על פני קרום פנימי. השימוש של מכשיר מעקב רדיואקטיבי מאפשר איתור pg/L כמויות של מתכות, נמוך בהרבה מאשר המגבלה של זיהוי טכניקות כזה מצמידים כמו inductively פלזמה ספקטרומטר מסה (ICP-MS) או ספקטרוסקופיית בליעה אטומית (AAS). דבר זה מאפשר ההפרעות מינימלי של מערכת נחקר. בנוסף, שיטות המפורטות לעיתים קרובות דורשים אחסון מדגם גדולים יותר, שלאחר עיבוד נוסף ושעות עוד סיבוב, אשר אינם אופייניים עבור מבחני radiotracer. לכן, באמצעות radiotracer מספק שיטה נוחה וישירה לניטור הפצה מתכת, ספיגת בתוך תא. זה נשאר שיקבע אם אפו ש-SBP a-1 אשכול המיוצר בשיטה זו הד התצפיות מבנית מ נוהלי הנוכחי המשמש ליצירת חלבון אפו.
תא fractionation היא שיטה הוקמה עבור הפרדת תאים סלולריים למטרה המפורשת של חיטוט במיוחד את התוכן שלהם בידוד12. תא fractionation משמש בדרך כלל כדי לאשר את המיקום של מולקולה במהלך מחזור התא או למדוד את הפעילות של תא מסוים13. לדוגמה, פעילות תחבורה מתכת יכול להיות לבדיקה ע י חקירת תאים סלולריים המצע מתכת. שילוב תא fractionation מאפשר הבחנה, השוואה בין ספיגת מתכת על פני הממברנה החיצונית והעברת מתכת על פני קרום פנימי. תהליכים אלה אז בתורו ניתן למדוד לאורך זמן. במקרה של חלבון-טיהור, השיטות הנפוצות ביותר של תא פירוק והפרדה של מרכיבים מסיסים מרכיבים לא מסיסים הם הפרעה מכנית (קרי, שחיקה, מיזוג), המגון בלחץ גבוה (קרי, הלחץ הצרפתי תא לחץ, תא disrupter), והתדרים אולטראסאונד (כלומר., sonication)14. השימוש התדרים אולטראסוניות lyse תאים בדרך כלל המתאימה ביותר עבור אמצעי אחסון קטן; עם זאת, sonication ידוע לייצר חום מוגזם זה יכול denature חלבון. כדי למנוע יצירת חום עודף, תדרים אולטרה סאונד מיושמים כלל בפרצים קצרים רציפים, אשר ניתן זמן רב בשוגג לבזות במולקולות דנ א לחלקים קטנים יותר. בנוסף, הגששים sonication יקר מרובות עשוי להידרש לניסויים מפוח אנליטיים, כמו כל בדיקה יש טווח מוגבל עבור אמצעי האחסון מדגם ניתן לעבד. השימוש בלחץ גבוה כדי lyse תאים מונע יצירת חום עודף במהלך פירוק התא על-ידי מצמרר רכיבי העיתונות תא הלחץ הצרפתי לפני פירוק או הפעלה של מפצל תא בסביבת קר כגון חדר קר. כמו sonication הגששים, ערכות מרובות של רכיבים לתקשורת תא הלחץ הצרפתי ייתכן שיהיה עליך לרכוש לעבד מגוון רחב של אמצעי אחסון מדגם. הלחץ הצרפתי תא לחץ הרכבות הם להתחבר בקלות אך מביך פועלים ולנקות, יכול להיות כבד להזיז, נוטים סתימת מדגימות צפופה. יתרונות לשימוש תדרים אולטרה סאונד ומערכות בלחץ גבוה כדי lyse תאים כוללים לדוגמה גבוהה התאוששות, היכולת לעבד דגימות מרובים עם זיהום לחצות מינימלי, מתכוונן הטיית הכוח, אשר ניתן להתאים למיטוב פירוק של מגוון רחב של סוגי מדגם. אופטימיזציה יכול להתרחש על-ידי התאמת התדר אולטרה סאונד, משך הזמן של התפרצויות, בוכנה לחץ ק ג לכל סנטימטר מרובע (psi) ומספר עוברת דרך התקשורת. השימוש הפרעה מכנית lyse תאים עשויים להיות האסטרטגיה הכי טכנית טריוויאלי והזולה עבור פירוק התא. הפרעה מכנית יכול להציג אתגרים בהתאוששות מדגם ואינו אידיאלי עבור עיבוד הדגימות מרובים. הפרעה מכנית עדינה כדי דגימות יותר בלחץ גבוה או תדרים אולטרה סאונד, אבל אינה תפוקה גבוהה והוא נוטה פירוק לא יעיל. מגבלה משמעותית ניסיוני של הפרעה מכנית, בלחץ גבוה המגון תדרים אולטרה סאונד, הוא שיבוש הארכיטקטורה הסלולר כולו נשלט כזה לאחר פירוק, מעורבבים כל הרכיבים תא מימית . יחד. יתר על כן, כל התאים תא לשבש לא באותו הזמן; לפיכך, התוכן של תאים זה lyse מוקדם יכול להיות כפופים כוחות משובש מתמשך זמן רב יותר מאשר התוכן של תאים זה lyse מאוחר. תא fractionation מאפשר זולה, טכנית פשוטה, יעילה מבוססת-תא הפרדה בין תוכן התא תוך הימנעות את הצורך ציוד יקר וחשיפה מדגם כוחות קשים, משובש.
במקרה SBP, המצע מיובאים מופיעה שוב פוטנציאל apo לחלבון ויוצרת ההולוגרפי חלבון במהלך פירוק, לפני כרומטוגרפיה במורד הזרם או טכניקות טיהור אחרות. ההכללה של EDTA chelator במהלך פירוק מציג מכשול נוסף, שבהם זיקה מתכת כצעד ראשון של חלבון טיהור אינה אפשרית כי EDTA רצועת מתכת מן השרף כרומטוגרפיה ולמנוע חלבון מחייב15. פתרון פשוט וזול הוא תא fractionation על-ידי הלם אוסמוטי, איפה צנטריפוגה דיפרנציאלית ו ריאגנטים המעבדה הנפוצות מאפשרים החוקר בקפידה לחלץ חלבון מספקת עבור אנליזה פונקציונלית. Fractionation הלם אוסמוטי מנצל בשינוי לחץ אוסמוטי כדי להפריד בין תאים סלולריים בשני שלבים. ראשית, מאגר hypertonic גורם תאים ל crenate מים משאיר כל תא, שנית, מאגר היפוטוניק גורם תאים להתנפח כמו מים מתמזגת מחדש בכל תא. על ידי בקפידה השליטה? כמה זמן התאים להתנפח, בקרום החיצוני יכול להיות סלקטיבי lysed (עקב הצטברות של לחץ אוסמוטי מן המים הנכנסים), ובכך לרוקן את התוכן שלהם לתוך המאגר. שימור בקרום הפנימי מבטיח כי התכנים cytoplasmic נשמרים ב- spheroplasts, מופרדים בקלות תוכן periplasmic על ידי צנטריפוגה.
YfeA הוא polyspecific SBP מסוגל מחייב ברזל, מנגן, אבץ אטומים16. כמויות יחסיות של מתכת מואגד יכול להשתנות על פי תוספת מתכת במהלך צמיחה, וזמינה לבדיקה על ידי פלואורסצנציה רנטגן כגון בגיל מתקדם הפוטון מקור Argonne National Laboratory של16. פלואורסצנציה רנטגן מאפשר לחוקר במהירות פרופיל של מכלול רחב של מתכות ללא הצורך גדול או עקיפה איכות קריסטלים, והוא אפילו יכול ללקט נתונים חלבון precipitate או proteinaceous פתרון.
פלואורסצנציה רנטגן יכולים לחשוף במהירות תוצאות בלתי צפויות כגון, במקרה זה, המצע YfeA הראשי להיות אבץ לא של סובסטרטים פיזיולוגיים מתועדים ברזל או מנגן16. אם נעשה שימוש לפני איסוף נתונים פיזור קרני רנטגן, פלואורסצנציה רנטגן יכול להודיע החוקר בעיצוב ניסיוני, כגון אילו אנרגיה מתכת edge(s) להשתמש עבור אוסף נתוני הפיזור רנטגן חריגה. רק שימושי כמו קביעת שפע יחסי פלואורסצנציה רנטגן מתכת, באפשרותך גם לקבוע אם מתכת נעדר במדגם, מתן שיטה מהירה של הפרדת גבישים המכילים חלבון apo מחלבון ההולוגרפי ולאחר הערכת מתכת הלעפה/םויס שקמ ללא צורך גוזלת זמן עיבוד נתונים. עם זיהוי מדגם עם קליטה מתכת חזקה, אורך הגל מדויק כדי להשתמש עבור אוסף נתוני הפיזור רנטגן חריג יכול להיקבע על ידי פיזור חריגות מרובות באורך הגל (MAD) סריקה.
פרוטוקול מפורט זה נועד לעזור ניסויים חדשים בהצלחה לבצע תא fractionation ולעשות שימוש יעיל בחומרת הפרעות לקרן החלקיקים סינכרוטרון פרופיל הכולל תוכן מתכת ולקדם את המחקר של המתכת מחייב חלבונים.
Protocol
1. חיידקי Starter תרבות (יום 1)
- בבקבוקון משופע 200 מ ל, לחסן 30 מ ל מרק לוריא Bertani (ליברות) עם זן Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL תאים pYFE3 המכיל פלסמיד16.
- להוסיף 30 µL של 50 מ"ג/מ"ל אמפיצילין הבקבוק על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה ו- 200 µL עצה. לנער בן לילה ב rpm 225-הלעפה תרוטרפמט 37.
2. מצורפים M9 תקשורתי מזערי הכנה (יום 2)
הערה: זהו ממאמרו של המדריך Amresco.
- הכן 6 L של נוזל מדיית באמצעות ההליך הבא. בקבוקון 2 ל' משופע, להוסיף 10.5 גרם תקשורתי מזערי M9 1 ליטר של אולטרה טהור H2או אוטוקלב-121 הלעפה תרוטרפמט במשך 20 דקות, ואז להתקרר לטמפרטורת החדר.
- גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף את הפתרונות תוספת סטרילי הבאים: 2 מ"ל/L של 1 מ' MgSO4, 10 מ ל/L של 20% w/v גלוקוז, 0.1 מ"ל/L של 1 מ' CaCl2, 1 מ"ל/L של 50 מ"ג/מ"ל אמפיצילין. לבצע שלב זה בטיחות ביולוגית בארון כדי לשמור על סביבה נקייה. חממו את המדיה הלעפה תרוטרפמט 37.
3. חיידקי תת-תרבות
- להוסיף 5 מ"ל/L של תרבות starter לילה תקשורתי מזערי M9 על-ידי כ רפה בעברית עם קצה אוטומטיות פיפטה ו מ. לנער את תת-תרבות ברציפות ב rpm 225-37 הלעפה תרוטרפמט עבור 9 h.
הערה: במהלך שלב זה YfeABCDE הוא overexpressed מאת autoinduction מ מקורי שלו יזם י' pestis . - שחזור תאים על ידי צנטריפוגה ב g x 4,500 למשך 30 דקות-הלעפה תרוטרפמט 4. Resuspend התאים ב- 50 מ של פתרון המאגר הקר פוספט (20 מ מ נה2HPO4 pH 7.6, 50 מ מ NaCl) על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה, עצה 1 מ"ל, להקפיא ללילה ב-80 הלעפה תרוטרפמט.
4. תא Fractionation (יום 3)
- להפשיר את resuspension-תאים 4 ° C וגלולה-g x 4,000 עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. Resuspend התאים ב- 50 מ של קרח מאגר מלח גבוהה (200 מ"מ טריס-HCl pH 8.0, 400 מ NaCl, ו- 2 מ מ EDTA) על ידי כ רפה בעברית עם קצה אוטומטיות פיפטה ו 25 מ. דגירה התליה על קרח למשך 20 דקות, עם היפוך ומדי פעם לערבוב.
- גלולה התאים ב- 4,500 g x עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. Resuspend התאים 50 מ של מאגר מלח נמוכה כקרח (טריס-HCl 10 מ מ pH 8.0) על ידי כ רפה בעברית עם קצה אוטומטיות פיפטה ו 25 מ. דגירה התליה על קרח למשך 20 דקות, עם היפוך ומדי פעם לערבוב.
- גלולה של spheroplasts-4,500 g x עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. לשחזר את תגובת שיקוע המכיל periplasm. Resuspend את spheroplasts pelleted של פוספט buffered תמיסת מלח (שלב 3.2) על ידי כ רפה בעברית עם קצה אוטומטיות פיפטה ו 25 מ ל, ואת lyse תאים על-ידי שלושה מחזורים של הלחץ הצרפתי תא לחץ בבית 1500 psi.
הערה: מכבש תא הלחץ הצרפתי יכול להיות לא נוח לתפעול ומשתמש משאבה הידראולית לנהוג פירוק התא. שימוש באזהרה בעת עיסוק של משאבה הידראולית, הבטחת יישור תקין של הבוכנה עם העיתונות, ושמירה על ידיים חופשיות של המשאבה הידראולי. - גלולה ההריסות הסלולר ב g x 50,000 עבור 20 דקות ב 4 הלעפה תרוטרפמט. לשחזר את תגובת שיקוע המכיל הציטופלסמה. במידת הצורך, בקרום החיצוני והפנימי יכול להיות עוד יותר fractionated16.
5. חלבון טיהור באמצעות FPLC
- מיד לאחר fractionation, לסנן את השבר periplasmic באמצעות יחידת ממברנה 0.45 מיקרומטר. השתמש במסנן מזרק סכינים סטריליים נעל נוחות, סינון מהיר. Equilibrate מ ל Q אניון exchange עמודה תוך שימוש 20 מ מ טריס pH 7.6, 0.05% w/v נאן3 טעינת מאגר ב flowrate של 5 mL/min.
- טען את פילטרט של periplasmic אל העמודה אניון מראש equilibrated מ ל Q exchange באמצעות 20 מ מ טריס pH 7.6, 0.05% w/v נאן3 טעינת מאגר ב flowrate של 2 מ ל לדקה המשך לרחוץ מ ל Q אניון exchange העמודה באמצעות 20 מ מ טריס pH 7.6 , מאגר 0.05% w/v נאן3 העמסה עד קריאה בסיסית של A280 מושגת על flowrate של 5 mL/min.
- Elute החלבון מאוגד באמצעות 20 מ מ טריס pH 7.6, 0.05% w/v נאן3, 0 - 1 M NaCl אמצעי אחסון ליניארי הדרגתיות העמודה מעל 10 ב flowrate של 5 מ"ל לדקה שברים לשלב המכיל280 לשיא. אפו YfeA elutes בין 200 מ"מ NaCl 300 מ"מ NaCl.
- לרכז את eluate על ידי רכז צנטריפוגלי עד האחסון מגיע ~ 5 מ.
- Equilibrate Superdex 200 pg ג'ל עמודה סינון עם 20 מ מ Bis-טריס pH 6.3, 50 מ מ NaCl, 0.05% w/v נאן3 ג'ל סינון מאגר ב flowrate של 2.5 mL/min.
- עומס אניון מרוכז להחליף eluate אל העמודה סינון מראש equilibrated Superdex 200 pg ג'ל ולטהר באמצעות ג'ל מאגר סינון מ 5.5 שלב ב flowrate של 2.5 מ ל לדקה לשלב שברים המכיל לשיא280 המתאים ~ 30 חלבון kilodalton (kDa).
הערה: ההתייחסות הבאה היא דוגמה FPLC ניסוי כדי להדגים את פרוטוקול ה-17.
6. חלבון התגבשות
- לרכז את eluate סינון ג'ל על ידי רכז צנטריפוגלי אל ריכוז החלבון הסופי של 22 מ"ג/מ"ל.
- חשב את ריכוז חלבון על-ידי חלוקת א280 קריאה על-ידי 1.276 מ"ג/מ"ל. מקדם הכחדה התיאורטי הזה היה חזה על-ידי ExPASY ProtParam18.
הערה:280 קריאת A מדגם של 5.104 AU מקביל פתרון 4.000 מ"ג/מ"ל; 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4.00 מ"ג / מ"ל.
- חשב את ריכוז חלבון על-ידי חלוקת א280 קריאה על-ידי 1.276 מ"ג/מ"ל. מקדם הכחדה התיאורטי הזה היה חזה על-ידי ExPASY ProtParam18.
- לערבב 1.5 µL של חלבון עם 1.5 µL של 30% w/v. פג 4000, 50 מ מ NaCl, 20 מ מ Bis-טריס pH 6.3, 0.05% w/v נאן3 יושב טיפה או תלויים ההתקנה טיפה על רפה בעברית ועם פיפטה של 10 µL עצה.
- תקופת דגירה התגבשות טיפות-293 K של 2-4 שבועות.
- קריסטלים בבריכה חנקן נוזלי למשלוח סינכרוטרון הקפאה.
7. רנטגן קרינה פלואורסצנטית (באמצעות תוכנה הפרעות לקרן החלקיקים GM/CA)
- נווט אל הכרטיסיה האץ שימוש כותרת המשנה אנרגיה כדי להגדיר אנרגיה עד 10.0 קוו.
- נווט אל סרוק הכרטיסיה ניווט לדגימת הר בכרטיסיית אינטראקטיבי .
- בחר את האות פלורסצנטיות מטב. S קלט 4.00 תחת כותרת המשנה זמן . בחר לקחת את ספקטרום קרינה פלואורסצנטית. להציג את הספקטרום באמצעות הכרטיסיה מגרש .
8. MAD סרוק שיא ספיגת אנרגיה מתכת (באמצעות תוכנה הפרעות לקרן החלקיקים GM/CA)
- להעביר את הדגימה מתוך קרן. נווט אל סרוק הכרטיסיה ניווט אל הכרטיסיה הטבלה המחזורית לבחור K-קצה אלמנט של עניין.
הערה: הערך אנרגיה אנרגיה כותרת היא ב- eV. - נווט אל הכרטיסיה האץ שימוש כותרת המשנה אנרגיה כדי להגדיר אנרגיה לערך, שלב בעוצמת קוו.
- להעביר את הדגימה אל הקרן. נווט אל סרוק הכרטיסיה ניווט אל הכרטיסיה אוטומטי קלט 2.00 s תחת כותרת המשנה זמן .
- בחר להתחיל לסרוק. להציג את הסריקה MAD באמצעות הכרטיסיה עלילה .
הערה: הערך אנרגיה כותרת המשנה שיא היא eV במקום קוו. - בחר עם זריחה.
- להעביר את הדגימה מתוך הקרן. נווט אל הכרטיסיה האץ שימוש כותרת המשנה אנרגיה כדי להגדיר אנרגיה לערך, שלב 8.4 מעוגל עד eV הבא (קרי, שיא: 9658.3 eV, הגדר אנרגיה 9659 eV).
- להעביר את הדגימה אל הקרן. לאסוף את ערכת הנתונים. חזור על צעד 8.1-8.6 מתכות כל עניין.
9. אנליטי פרוטוקול Assay ספיגת מתכת רדיואקטיבי
- בשפופרת תרבות 14 מ"ל, לחסן 5 מיליליטר ליברות עם זן e. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL תאים pYFE3 המכיל פלסמיד16. להוסיף 5 µL של 50 מ"ג/מ"ל אמפיצילין כ רפה בעברית ועם פיפטה של 10 µL עצה. לנער-225 סל ד ב 37 הלעפה תרוטרפמט במשך 7 שעות.
- גלולה התאים ב 15,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה שולחן. רחץ תאי 1 מ"ל של שהושלם M9 תקשורתי מזערי על ידי כ רפה בעברית עם טיפ פיפטה ו 1 מ"ל. חזור על פעם אחת.
- צינור חרוטי 50 מ ל, תת-תרבות תאים לתוך 30 מ ל בתוספת תקשורתי מזערי M9 כ רפה בעברית עם טיפ פיפטה ו 1 מ"ל. לנער-225 סל ד ב 37 הלעפה תרוטרפמט עבור 9 h.
- לקבוע את כמות הרדיואקטיביות נדרש להשיג כ 100,000 ספירות לדקה (cpm).
הערה: זה משתנה בהתאם radioisotope ואת כלי המשמש לזיהוי. לדוגמה, מדגם המכיל 7.4 קילו בקרל (kBq) (0.2 microcurie (µCi)) של 52Mn נותן קריאה של 550,000 cpm גלאי גמא אוטומטיות (NaI). לפיכך, כמות הרדיואקטיביות צריך להגיע ספירה של 100,000 cpm ניתן לקבוע באמצעות המשוואה הבאה: (100,000 cpm של 550,000 cpm) * 7.4 kBq (0.2 µCi) = kBq 1.35 (0.036 µCi).
התראה: דעיכה רדיואקטיבית תוצאות במהדורה של קרינה מייננת, וזה מסוכן. כאשר עובדים עם רדיואקטיביות השתמש תמיד את המגן מתאים ובצע את העקרונות של נמוך כמו סביר השגה (מיקי ברקל) על ידי הגדלת המרחק ו מיגון תוך צמצום זמן החשיפה. רק צוות מיומן צריך להתמודד עם קרינה רדיואקטיבית במעבדות המיועד במיוחד, אשר מורשים לשימוש של חומרים רדיואקטיביים. - הכפל רדיואקטיביות נדרש ב- 9.4 שלב שמחשבת הנפח הכולל של תת-תרבות, כדי לקבוע את הסכום הכולל של רדיואקטיביות הכרחי. להוסיף סכום זה (רצוי בתוך נפח קטן של 50-100 µL) הצינור שמכילה את תת-תרבות כך ישנם 100,000 cpm/mL, מערבולת היטב עבור 30 s.
הערה: עבור 31 מ של תת-תרבות, הסכום הכולל של רדיואקטיביות הנדרש הוא 1.35 kBq (0.036 µCi) x kBq מ ל 31 = 41.3 (1.12 µCi). - Aliquot 1 מ"ל של תת-תרבות (מכיל כעת מעקב רדיואקטיבי) לתוך צנטריפוגה mL 1.5 בודדים צינורות מאת כ רפה בעברית עם טיפ פיפטה ו 1 מ"ל, ומשוכפלת במקום thermomixer 37˚C, עם vortexing-ג' × 1 כלול מספיק מנורות כך ישנם שלושה לכל אחד רצוי מדידה, כמו גם שלושה נוספים משכפל להשתמש באמות מידה (להפריש את הסטנדרטים, אל תבצע את הבדיקה fractionation על הסטנדרטים).
הערה: Assaying-1, 2 ו- 4 שעות ידרוש הכולל 12 צינורות. - לאחר דגירה, centrifuge הצינורות ב g × 15,000 ב-30 s באמצעות צנטריפוגה benchtop (עדיף מקורר הלעפה תרוטרפמט 4) ולמחוק את supernatants.
- להשעות מחדש תאי 1 מ"ל של קרים כקרח, מלח גבוהה מאגר (שלב 4.1) על ידי כ רפה בעברית עם טיפ פיפטה ו 1 מ"ל, ומניחים מיד על קרח למשך 20 דקות.
- גלולה התאים שוב ב 15,000 g × ב-30 s באמצעות צנטריפוגה benchtop (עדיף מקורר הלעפה תרוטרפמט 4) ולמחוק את supernatants.
הערה: תגובת שיקוע מכילה מתכת חינם לא משויכת. - מחדש להשעות את התאים קרים כקרח, מלח נמוכה מאגר (שלב 4.2) על ידי כ רפה בעברית עם טיפ פיפטה ו 1 מ"ל, דגירה על קרח למשך 20 דקות.
הערה: חשוב לרוקן בעדינות באמצעות פיפטה בשלב זה. - גלולה התאים ב g × 15,000 ב-30 s, ולאסוף כל של supernatants לתוך חדש 1.5 mL צנטריפוגה צינורות. עכשיו צריך להיות 6 צינורות לכל נקודת זמן.
הערה: תגובת שיקוע מכילה את השבר periplasmic , בגדר מכילה את עלי הלוואי קרומיים, cytoplasmic שבר. אנו מכנים צניפה השבר cytoplasmic. - למדוד רדיואקטיביות כל שבר (6 צינורות לכל נקודת זמן), וכן את הסטנדרטים להפריש ב- 9.6 שלב. להשתמש את כמות הרדיואקטיביות בתקנים כדי לקבוע את הסכום הכולל של רדיואקטיביות במקור נוספו כל דגימה.
- כדי לקבוע את אחוז ספיגת רדיואקטיבי ב periplasm, השתמש במשוואה הבאה: (cpm ממוצע של cpm שבר periplasmic/ממוצע של תקנים) x 100.
- כדי לקבוע את אחוז ספיגת רדיואקטיבי בציטופלסמה, השתמש במשוואה הבאה: (cpm ממוצע של cpm שבר cytoplasmic/ממוצע תקנים) x 100.
- כדי לקבוע את ספיגת סה כ %, השתמש במשוואה הבאה: ((ממוצע cpm שבר periplasmic + cpm הממוצע של השבר cytoplasmic המתאימים) / (ממוצע של cpm תקנים)) x 100.
Representative Results
ג'ל מרחביות-דף, ג'ל סינון chromatograms נאספו כדי להעריך את איכות החלבון טיהור מן fractionation periplasm מפוח. הטיהור של ההולוגרפי ש-yfea היה בעבר תיאר16; עם זאת, הטיהור של אפו YfeA לא דווחה. האסטרטגיה לטהר את אפו YfeA מתוארת על ידי שיטה זו משתמשת בונה רקומביננטי פראי סוג שאינו מכיל תג קירבה מסוג כלשהו, ובמיוחד כזה יכול לשמש לייצור חלבון immunoblot (קרי, שלו-תג) ולאחר נוגדן חד שבטי זה מזהה ש-yfea לא תואר. לפיכך, ניתוח ספקטרומטר מסה היה מנוצל כדי לוודא הטיהור של YfeA. לטהר YfeA מאת fractionation, מומלץ להשתמש הדרגתי • תנאי ליניארי עבור אניון exchange כרומטוגרפיה (איור 1). מעבר הצבע לינארית • תנאי משפר באופן משמעותי YfeA העשרה של ממציא כ- 8% של השבר periplasm ל-49% של המוצר exchange אניון כפי שמחשבת densitometry (איור 1C). היצירה משופרת ל- 61% על-ידי סינון ג'ל, הנפח • תנאי של החלבון אפו הוא זהה לנפח • תנאי של החלבון ההולוגרפי (איור 2). ניתוח ספקטרומטר מסה מאמת הטיהור של YfeA באמצעות איתור של 92.5% של הרצף חומצת אמינו YfeA, 246 ספקטרה מפוליפפטיד סך של YfeA, פפטידים ייחודי 24 50 ספקטרה מפוליפפטיד ייחודי. לחלופין, כדי לעומת זאת המוצר מעבר צבע ליניארי עם המוצר • הדרגתי תנאי שלב, YfeA היתה מטוהרת על-ידי אניון exchange באמצעות צעד שטיפה של 50 מ מ NaCl עקב מאת צעד • תנאי של 250 מ מ NaCl (איור 1D). מעבר הצבע שלב מעשיר שולית YfeA החל להלחין 17% של השבר periplasm ל- 18% של המוצר exchange אניון כפי שמחשבת densitometry. • מעבר צבע תנאי שלב גם מעשיר להקה מזהם חלבון זה ספקטרומטר מסה שזוהו כמכילים SBPs e. coli מרובים של משקל מולקולרי דומה. בשל רזולוציה גבולות עמוד Superdex 200 HiLoad 26/600, דמיון מולקולרית משקולות, מבנים של SBPs משחיתה, ג'ל סינון משופרים שולית העשרה YfeA ל-20% של המוצר סינון ג'ל. צריך להיות הדרגתי לינארית • תנאי להשגה לחילופי אניון, מומלץ לבחון מספר שוטף שלב בדרגות NaCl של 25-50 מ מ, כדי לזהות את הריכוז של NaCl נדרש להסיר האלה מזהמים.
Apo מטוהרים, ההולוגרפי YfeA להתגבש בתנאים התגבשות זהה, על פי תמונות של אפו ואת ההולוגרפי מורפולוגיות קריסטל YfeA להראות הבדלים הצמיחה קריסטל בין אפו ההולוגרפי YfeA הברית (איור 3). בנוסף ספקטרומטר מסה אימות הנתונים קרני רנטגן (לא מוצג) שנאספו מ גבישים שגידלו של חלבון מטוהרים בשיטה זו אישר לטיהור ודה התגבשות של YfeA. היקף זיהום תא (אבץ cytoplasmic החזרה apo לחלבון ההולוגרפי של השבר periplasm) יכול להיות מוערך על ידי לכידת רנטגן פלורסצנטיות ספקטרה (איור 4). בהתחשב בכך אבץ הוא המצע העיקרי קשור YfeA רקומביננטי16, ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן במהירות יכולה להבדיל בין מדגם YfeA המכיל אות חזק אבץ והמנהיגות ההולוגרפי YfeA (איור 4A), מעידה על צלב זיהום, או אות חלש אבץ רמיזות של אפו YfeA, זיהום לחצות מינימלי (איור 4B). ניתוח של ICP-MS של התקשורת מינימלי M9 אישר מתכות מעבר רמות הן בטווח תת-micromolar (לא מוצג); לכן, זיהוי רק מינימלי כמויות של מתכות המעבר אמור להיות צפוי בעקבות של fractionation מוצלח. Fractionation אנליטית (איור 5) ניתן למדוד את תעריפי התחבורה radiometal וללכוד נתונים פונקציונלי. 60 דקות בזק השוואת שברים periplasmic, cytoplasmic של e. coli תאים לבטא YfeA בלבד, המשגר YfeABCDE מלאה ואף אחד הרכיבים YfeABCDE חושף את התוצאות של ביטוי חלבון רקומביננטי יחיד או חלבונים מורכבים על ספיגת מתכת (איור 6). E. coli תאים המבטאים אין חלבון רקומביננטי מועבר כ מחצית 52Mn הוסיף לתקשורת אל הציטופלסמה עם שמירה מינימלית ב periplasm. פקד שלילי זה מייצג תחבורה מנגן אנדוגני. E. coli התאים לבטא YfeA רקומביננטי מועבר כ רבע 52Mn נוסף לתקשורת אל הציטופלסמה עם עוד רבע דולר נשמרים ב- periplasm. מנגן השמירה periplasm, התחבורה הציבורית מוגבל אל הציטופלסמה מדגים את חילוף חומרים הביקושים ואת צוואר בקבוק שהוטלו על ידי ייצור YfeA בהיעדרו של המשגר Yfe. E. coli התאים לבטא רקומביננטי טרנספורטר YfeABCDE מועבר כמעט 100% של 52Mn הוסיף לתקשורת אל הציטופלסמה עם שמירה מינימלית ב periplasm. מנגן augmented התחבורה הציבורית אל הציטופלסמה ממחיש את התרומה של המשגר Yfe בהעברה מנגן.
איור 1. טיהור של YfeA מאת fractionation. א. מודל תיאורטי Yfe המשלח. B. ג'ל מרחביות-דף YfeA טיהור של שבר periplasm, באמצעות לינארית • תנאי מעבר מ- exchange אניון. ג'ל מרחביות-דף מציג את העשרת של YfeA (30 kDa) לאורך שלבי טיהור. חץ שחור מציין המיקום של הגירה electrophoretic עבור YfeA. תקני משקל מולקולרי המוצג מימין. (1) שבר periplasm. (2) Q אניון להחליף עמודה לזרום. (3) Q אניון exchange עמודה שיא • תנאי. (4) superdex 200 pg ג'ל סינון העמודה שיא. ג. YfeA העשרה – דוגמא טובה. עיבוד תמונה של הג'ל מרחביות-דף מ- B מחשבת הכוללת העשרה של YfeA על ידי densitometry לגדול מ- 8% של השבר periplasmic ל-61% של המוצר סינון ג'ל. הקופסאות הכחולות מציינים אותות YfeA/סה כ משמש חישובי densitometry. ניתוח ספקטרומטר מסה של הלהקה מסגרת בנתיב 4 זיהה 259/280 YfeA חומצות אמינו, המוצגים סימון ירוק. נוכח מפוליפפטיד בוגרת חומצות אמינו מיוצגים באותיות גדולות בטקסט שחור ומודגש, חומצות אמינו להלחין את פפטיד אות cleaved מיוצגים בטקסט נטוי אפור באותיות קטנות. D. YfeA העשרה - דוגמא גרועה. מרחביות-דף ג'ל YfeA טיהור של שבר periplasm, באמצעות שלב • תנאי מעבר מ- exchange אניון. ג'ל מרחביות-דף מראה העשרה של YfeA על פני שלבים טיהור. חץ שחור מציין המיקום של ההגירה electrophoretic של החלבון העיקרי מזהם משופרת במהלך אניון חילופי גזים. תקני משקל מולקולרי המוצג מימין. (1) superdex 200 pg ג'ל סינון העמודה שיא. (2) Q אניון exchange עמודה 250 מ מ NaCl שלב מעבר צבע • תנאי. (3) שבר periplasm. עיבוד תמונה של ג'ל מרחביות-דף מ ד מחשבת שולית העשרה הכוללת של YfeA על ידי densitometry למקסימום של 20% של המוצר סינון ג'ל. הקופסאות הכחולות מציינים אותות YfeA/סה כ משמש חישובי densitometry. מסה ספקטרומטר ניתוח של הלהקה מסומן על ידי חץ שחור בנתיב 1 זיהה 26 פפטידים הייחודי של LivJ (39 kDa), 25 פפטידים הייחודי של EfeO (41 kDa), 17 פפטידים הייחודי של LivK (39 kDa). כל שלושת מזהמים הם periplasmic e. coli SBPs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. אפו YfeA ו ההולוגרפי YfeA ג'ל סינון chromatograms. חץ שחור מציין המיקום של נפח חלל. ג'ל סינון פסגות עבור לאיי YfeA (עיקול שחור) וקובע ההולוגרפי YfeA (עיקול כחול) הצג שני חלבונים elute • תנאי באותה רמת עוצמה, המציין את אפו ש-yfea טהור מן השבר periplasm יש רדיוס hydrodynamic דומה כמו ההולוגרפי ש-yfea מטוהרים מסכום תכנים סלולריים אחרי קנקן צרפתי.
איור 3. אפו YfeA מורפולוגיות קריסטל ההולוגרפי YfeA. YfeA ההולוגרפי מתגבשת גביש מונוליטי, בעוד אפו YfeA בדרך כלל מייצרת גבישים תאומים התגבשות באותו מצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. אפו YfeA ו ההולוגרפי YfeA רנטגן פלורסצנטיות ספקטרה. א. צילום רנטגן ספקטרום קרינה פלואורסצנטית של ההולוגרפי YfeA זה יש מטוהר מהמדיה M9 מינימלי עם עקומת תוספי, ירוק אין מתכות מעבר נוספים. פסגות האופיינית מסומנות מנגן, ברזל, אבץ. B. רנטגן ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מהדגימה YfeA המיוצר בהקשר של YfeBCDE. פסגות האופיינית מסומנות מנגן, ברזל, אבץ. עקומת כחול. ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן של YfeA מכל ההקשר של YfeBCDE ו- fractionation מוצלחת של השבר periplasm עם זיהום מזערי של מתכות המעבר cytoplasmic ו/או ההולוגרפי חלבון YfeA. עקומת אדום. ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן של YfeA מטוהרים בהקשר של YfeBCDE עם fractionation לא מוצלח של פירוק יתר וזיהום משמעותית של מתכות המעבר cytoplasmic ו/או ההולוגרפי חלבון YfeA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. מוכללת זרימת עבודה עבור fractionation. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6-60 דקות ספיגת מתכת רדיואקטיבי fractionation נתונים. כל הניסוי בוצע שלוש פעמים, קווי שגיאה מציינות סטיית תקן. הבר באדום. E. coli תאים שאינם מכילים המשגר Yfe להעביר כ ~ 50% 52Mn לתוך הציטופלסמה לאחר 60 דקות, ולשמור על רמות נמוכות של periplasmic 52Mn. פס כחול. E. coli תאים המכילים התעבורה טרנספורטר Yfe > 90% 52Mn לתוך הציטופלסמה לאחר 60 דקות והוא לשמור על רמות נמוכות של periplasmic 52Mn. בר ירוק. E. coli תאים המכילים רק YfeA להעביר כ ~ 25% 52Mn לתוך הציטופלסמה ולשמר ~ 25% 52Mn ב- periplasm אחרי 60 דקות.
Radiometal להשתמש בעבודה זו, 52Mn (t1/2 = 5.59 d), היה המיוצר במתקן ציקלוטרון UAB (ברמינגהאם, AL) על ידי פרוטון הפגזה על מטרה Cr טבעי, מטוהרים כפי שדווחה בעבר19. זהירות: 52Mn היא פולט פוזיטרון (β+avg = 242 קוו, 29.4%), והוא גם פולט מספר קרני גמא אנרגיה גבוהה בעוצמה גבוהה (Eוγ = 744.2, 935.5, 1434.0 קוו; אני = 90.0%, 94.5%, 100%). מסיבות אלו, הניסוי חייב להתבצע בעקבות עקרונות הגנת קרינה ALARA, כמתואר לעיל. כל הפריטים המוגדרים פסולת רדיואקטיבית צריך להיות בהתאם הכילה, עם תוויות ברורות, מושלך על פי נהלים הקים.
Discussion
תא fractionation הוא כלי שימושי עבור במיוחד בודק את התוכן של תא הסלולר, יכול לשמש כלי שימושי עבור חילוץ מולקולות קטנות כגון אטומי המתכת, כמו גם מקרומולקולות כגון חלבונים. ראוי לציין כי fractionation תא אינה טכניקה מוחלטת וניתן מועדת לשגיאות ללא תשומת-לב רבה ערבוב/resuspension בטמפרטורת דגירה, זמן הדגירה. ערבוב לא שלם יכול לגרום פירוק עלי הלוואי קרומיים מינימלית, fractionation ובכך זניח, fractionation בטמפרטורת החדר יכול לגרום פירוק מהיר של שתי ממברנות וכתוצאה של השבר periplasmic עם תוכן cytoplasmic, זיהום, פעמים דגירה ממושכת עלולה לגרום גם פירוק מופרז ובכך שבר זיהום. פשרה סבירה להשגת פירוק הממברנה החיצונית יעיל ומלא יחסית (תוך שמירה על קרום פנימי) הוא הדגירה 20 דקות מעל הקרח במאגר fractionation היפוטוניק. שיקול נוסף הוא שיטת החילוץ, איפה החילוץ הקשה על ידי טלטול או מערבולת יכול לסכן את האיכות של התמצית: גרימת צבירת חלבון. מומלץ לערבב בעדינות כגון, המרית, היפוך או כ רפה בעברית על ידי פיפטה כדי לשמור על חומרים באיכות גבוהה עבור ניתוח במורד הזרם. טיהור של תא מפוח fractionation יכול להתרחש עם היעילות משתנה כפי שמעידים איור 1. בניסוי אחד, YfeA החלה לפי 8% של התוכן שחולץ periplasmic (איור 1C), ואילו בניסוי נוסף, YfeA החלה 17% מהתוכן periplasmic (איור 1D). הבדלים אלה יכול לנבוע ממספר סיבות כגון תנאי ביטוי משתנה (הוספת EDTA למדיה גדילה יכול להגדיל ביטוי של גנים מוסדר על ידי מנגנוני הרעב כגון פרווה רגולציה של האמרגן Yfe), השימוש החוזר ונשנה של קפואה מניות קבוע, טעות אנוש. במקום התאמת הזמנים דגירה, מומלץ הסולם ההכנה. טיהור של השבר periplasm מומלץ לכלול של מעבר צבע • תנאי ליניארי מהשלב כרומטוגרפי exchange אניון. • הדרגתי תנאי שלב היא אסטרטגיית • תנאי שימושים נפרדים פתאומי השינויים בתוך הרכב (כלומר-, 0 מ מ NaCl, 50 מ מ NaCl, 150 מ מ NaCl, וכו '.). • תנאי מעבר צבע ליניארי היא אסטרטגיית • תנאי המשתמשת שינוי הדרגתי ב"מוביל שלב הקומפוזיציה (קרי, 0 מ מ NaCl, 5 מ מ NaCl, 10 מ מ NaCl וכד'). מעבר הדרגתי צעד שימושי עבור הפרדת מולקולות שיש הזיקות שונות לשלב נייח, • תנאי מעבר צבע ליניארי שימושית לצורך הפרדת מולקולות בעלות הזיקות דומה לשלב נייח. במקרה של טיהור חלבון עם אין תג טיהור מלאכותיים (כדי לשפר את הזיקה לשלב נייח) מתא לתא כי הוא עשיר במינים חלבון ייחודי, • תנאי מעבר צבע ליניארי מומלץ להפריד חלבונים של noninterest שלא ניתן יש דומה הזיקות לשלב נייח כמו החלבון עניין. באופן כללי, תשואה של 1-2 מ"ג של apo מטוהרים YfeA צפוי של כל ליטר תרבות לבטא YfeA מ שלה אנדוגני יזם י' pestis .
פלואורסצנציה רנטגן היא טכניקה המאפשרת החוקר לקבוע תוכן מתכת במדגם, ובמהירות ליידע את החוקר על התאגדות מתכת בלתי צפוי, שאחרת היה לא ידוע. למרות EDTA נכלל במאגר של hypertonic fractionation ' כדי להסיר הקשורים באופן רופף או ללא מתכת, YfeA נגזר מן השבר periplasm יכול להכיל כמה חלבון ההולוגרפי. בהתחשב בכך תחבורה מתכת הוא תהליך דינמי, אולי תכולת החלבון של ההולוגרפי מקורו של YfeA זה עדיין לא תרמה את מטענה כדי YfeBCDE. ראוי לציין כי פלואורסצנציה רנטגן רק מודד הכולל תוכן מתכת, אינו מציין אם המתכת היא הורה בשריג גבישי, או קשור במיוחד חלבון. כדי לקבוע אם המתכת היא הורה בשריג גבישי ו/או קשור במיוחד מולקולה של חלבון, נדרש איסוף נתונים פיזור קרני רנטגן ועיבוד. ובכל זאת, פלואורסצנציה רנטגן מאפשר הערכת מדגם מהיר של זיהום מתכת ו/או ההולוגרפי משקעי חלבון אינטגרציה. סינכרוטרון קרינה זמן מוגבל, לא תמיד יש זמן לתכנן אסטרטגיה איסוף הנתונים פיזור קרני רנטגן כל דגימה, ובכך פלואורסצנציה רנטגן היא טכניקה יקר עבור הקרנת קריסטלים רבים וקביעת סדרי עדיפויות עבור אילו דגימות רנטגן פיזור נתונים צריכים להיאסף. יתר על כן, פלואורסצנציה רנטגן מאפשר איסוף נתונים מדגימות כי ייתכן מכמותה צילומי רנטגן. בעת איסוף הנתונים פלורסצנטיות רנטגן, לפעמים האות יכול להיות חלש מאוד ולא ומתחמקות הספקטרום המתקבל. כדי לשפר את עוצמת האות, או פלואורסצנציה רנטגן או סריקה כועס, שקול להגדיל את זמן החשיפה ו/או הפחתת הרנטגן לשגר הנחתה. כאשר דגימת מזוהה עבור איסוף נתונים פיזור קרני רנטגן, מומלץ לאסוף נתוני הפיזור רנטגן בחלק אחר של המדגם מאשר מה היה משמש פלואורסצנציה רנטגן ו- MAD סריקה כדי למזער נזק הקרינה, לשפר את איכות הנתונים אוסף, ולצמצם את כל פוטנציאל הפחתה של אות חריג.
זיהוי של קליעים נותבים רדיואקטיביים דורש nanomolar כמויות של חומר או פחות, וזה שימוש אלה המשדרים כסוכני מעקב מולקולרית מספק שיטה פשוטה מאוד רגיש נחטט תהליכים תאיים. וזמינותו radiometal שפורטו לעיל יכול לשמש כדי לקבוע את סך ספיגת מתכת, הפצה על פני תאים סלולריים, כמו גם המחירים של ספיגת. אכן, כל נקודת זמן נתונים דורשת fractionation של 40 דקות; עם זאת, כמו כל נקודת הזמן הגיע, תאים מגורען, מיד מתפשט במאגר מלח גבוהה (איור 5שלב 1). מדידות Radiometal של המדיה, זרוקים מאגר מלח גבוהה (איור 5שלב 1), שברים periplasmic, cytoplasmic לאחר (איור 5שלב 3) מציינים שהדגירה מאגר מלח גבוהה בהצלחה מסיר את כל שנותר לא משויכות למתכת חינם התעכבו בעקבות את צנטריפוגה הראשונית לאחר שהגיע נקודת זמן. צנטריפוגה הראשונית מסיר רוב (עד 80%) של המתכת חינם לא משויכות, צנטריפוגה לאחר דגירה במאגר מלח גבוהה גם מסירה נוספים שנותרו מתכת חינם לא משויכת. מתכת חינם לא משויכות מתמשכת בכל לא צפויה להשפיע באופן משמעותי על תחבורה מתכת במהלך fractionation 40 דקות. השפעת fractionation 40 דקות בתחבורה מתכת תאיים הוא שיקול נוסף על פרשנות הנתונים שקולה. כמעט פרוטוקול fractionation כולה מתרחשת על קרח, מלבד צנטריפוגה השני 30 בין השלבים. מתכת תחבורה זמן הקורס ניסויים הראו כי שמירה על תאים ב 4 ° C abrogates תחבורה מתכת20,21,22; לכן, בגלל הניסויים מתרחשת על קרח, fractionation 40 דקות לא צפוי להגדיל באופן משמעותי את רמות מתכת periplasm של הציטופלסמה, רמות מתכת צפויים להיות נציג של נקודות זמן שבו היו התאים בתחילה centrifugalized.
נחישות של ספיגת היחסי בתאים הסלולר שונה יכול לסייע ליידע את נתוני המערכות, לאמת מהות מצע פיזיולוגיים, כמו גם לאפשר החוקר לחקור עוד יותר את הפרטים מולקולרית של מנגנון. לדוגמה, תוספת של גנטי מוטגנזה מכוונת. radiometal ספיגה ולניסויים מספק שיטה ישירה לחזק את שאריות פונקציונלי מפתח או מולקולות מעורב התחבורה המצע. היתרונות של radiometal ספיגת ניסויים וניתוחים כוללים אספקה מהיר, תפוקה גבוהה, גבוהה הפארמצבטית parallelization של ניסויים השוואת תנאי הגידול וקבועים גנטי.
Disclosures
המחברים מצהירים שיש להם שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
הנתונים נאספו גם ב- GM/CA@APS, אשר מימנה במלואם או בחלקם עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לסרטן (ACB-12002) הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (AGM-12006). מחקר זה נעשה שימוש במשאבים של מקור הפוטון מתקדם (APS), ארצות הברית מחלקת האנרגיה (DOE) במשרד של המשתמש מתקן מדעי פעלו במשרד DOE של המדע על ידי Argonne National Laboratory תחת חוזה מס דה-AC02-06CH11357. השימוש המקור הפוטון מתקדם נתמכה על ידי מחלקת האנרגיה של ארה ב, משרד המדע, משרד בסיסי אנרגיה למדעים, תחת חוזה מס W-31-109-Eng-38.
ברצוננו להודות UAB מקיף במרכז לחקר הסרטן - מסה ספקטרומטר/פרוטאומיקס משותפים מתקן (P30CA13148-38) לסיוע שלהם בניתוח ספקטרומטר מסה.
פיקוד נתמך על ידי מענק של אוניברסיטת אלבמה-המשרד המגוון של ברמינגהאם, הון עצמי והכללה. L.L.R. נתמכה על ידי המחלקה לרדיולוגיה של אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם. התוכנית איזוטופ משרד האנרגיה, משרד המדע, נתמך 52Mn ייצור ולהעניק A.V.F.M. תחת DESC0015773.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
- ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
- Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
- Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
- Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
- Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
- Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
- Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
- McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
- Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
- Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
- Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
- Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
- Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
- Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
- Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
- Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
- Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).
