本文提出了一种周过渡金属伴侣在其本机结合的背景下提取的协议, 并给出了 X 射线荧光和 radiometal 吸收对其基质含量的生物物理表征。
我们展示了一个可伸缩的方法分离细菌从从细胞质。该方法用于纯化周蛋白的生物物理特性, 并测定周与细胞质间的基底转移。通过仔细地限制从与细胞质分离的时间, 实验者可以提取出感兴趣的蛋白质, 并对每个舱室单独进行分析, 而不必在隔间之间进行污染。从分馏提取的蛋白质, 然后可以进一步分析三维结构确定或底物结合剖面。另外, 这种方法可以在孵化后与示, 以确定总百分比的摄取量, 以及分布的示踪剂 (和因此金属运输) 在不同的细菌隔间。实验与示可以帮助区分生理基质和 artefactual 基质, 如那些引起的 mismetallation。
x 射线荧光可用于发现样品中金属的存在或缺失, 以及测量金属结合物中可能发生的变化, 作为生长条件、纯化条件和/或结晶条件的产物。x 射线荧光也为每种金属提供了一个相对的丰度量, 可以用来确定最佳的金属能量吸收峰, 用于反常的 x 射线散射数据的采集。Radiometal 摄取可以作为一种方法来验证的生理性质的基片检测 X 射线荧光, 以及支持发现的新的基板。
在革兰氏阴性菌中, 过渡金属原子的细胞质池通过内膜 ABC (ATP 结合盒) 进口商增加和补充, 从而减少了内膜的金属易位。周簇 A-1 基质结合蛋白 (SBPs) 组成一组的伴侣, 直接绑定金属原子和摆渡他们通过从, 以交付他们的同源 ABC 进口商1。其他的 SBPs 群专门用于运输基材, 例如螯合金属 (簇 A-2)、碳水化合物 (b 和 D-1) 和氨基酸 (b、C、F-2 和 F-4);然而, 不管基质, SBPs 遵循一个进化保守的 c 钳折叠2。本文提出的广义的收缩基底转移机制包括 c 钳经历一系列类似金星蝇3的扭曲。一般来说, 集群 A-1 SBPs 纯化的全息 (金属约束) 的形式, 虽然研究这些 SBPs 是有限的困难, 产生的生产力 (无金属) 形式的蛋白质实验4。迄今为止, 研究 A-1 SBPs 的策略仅限于诱变、透析和乙酸酸 (EDTA) 合剂的部分变性,5,6,7,8,9,10,11. 来自这些实验的结构数据表明, 星团 A-1 SBPs 可能不完全遵循金星蝇机制。目前从文献中缺失的是一种使用生理结合的伙伴,在体内生成 A-1 SBPs 的方法。
我们首次使用细胞分馏来纯化 YfeA, 这是鼠疫的病原体, 通过与其生理同源 YfeBCDE ABC 进口商的相互作用, 将其转化为 A-1 形态, 从而使其成为一种由鼠疫耶尔森氏杆菌组成的群. 在牢房里我们通过能量色散 x 射线光谱学 (EDS) 来展示 YfeA 的形式, 也被称为 x 射线荧光。我们还通过将细胞分馏与高度敏感的放射性金属吸收研究相结合, 来证明 YfeBCDE 的功能, 以区分金属在外膜上的摄取和金属在内膜上的进口。使用放射性示踪剂, 可以检测 pg/L 数量的金属, 大大低于检测的限制, 如电感耦合等离子体质谱 (ICP) 或原子吸收光谱 (AAS) 的技术。这允许对所研究的系统进行最小扰动。此外, 所列出的传统方法通常需要更大的样本量、额外的后处理和更长的轮圈时间, 这些都不是示分析的典型。因此, 使用示提供了一个方便和直接的方法来监测金属在细胞内的分布和摄取。还有待确定的是, 如果用这种方法生产的一个载脂蛋白簇 A-1, 将会从目前用于产生蛋白的做法中得到结构观察。
细胞分馏是分离细胞隔间的一种既定方法, 用于在隔离12中专门探测其内容的隐含目的。细胞分馏通常用于确认分子在细胞周期中的位置, 或测量特定隔间的活动13。例如, 金属运输活动可以通过探测金属基板的蜂窝室来检测。整合细胞分馏可以区分和比较金属的摄取横跨外膜和金属转移横跨内膜。这些过程然后可以反过来被测量随着时间。在蛋白质纯化的情况下, 最常见的方法细胞裂解和可溶性成分分离不溶性成分是机械中断 (即研磨, 混合), 高压均质 (即, 法国压力细胞压, 细胞干扰) 和超声波频率 (i. e., 超声)14。使用超声频率溶解细胞通常是最适合小体积;然而, 超声是已知的产生过量的热量, 可以变性蛋白质。为了避免产生过量的热量, 超声频率通常被应用在连续的短脉冲中, 这可能会耗费时间, 并无意间将 DNA 分子分解成更小的碎片。此外, 在准备和分析实验中, 可能需要多个昂贵的超声探头, 因为每个探头的样本量范围有限, 可以进行处理。在寒冷的环境如寒冷的房间里, 使用高压溶解细胞避免在裂解或操作细胞干扰的过程中在细胞裂解时产生过热的压力。像超声探头一样, 可能需要购买多组法国压力电池冲压组件来处理大量的样品卷。法国压力电池按组件是容易连接, 但笨拙的操作和清洁, 可能是沉重的移动和容易堵塞, 从密集的样品。利用超声频率和高压系统对溶解细胞的好处包括高样品回收率, 能处理多样品与最小的交叉污染, 和可调整的剪切力, 可以适应裂解优化多种样本类型。通过调整超声波频率、爆炸持续时间、每平方英寸活塞压力磅 (psi) 和通过压力机的通过次数, 可以实现优化。对溶解细胞的机械破坏可能是最技术上的琐碎和最便宜的细胞裂解策略。机械中断可能会给样品回收带来挑战, 并且不适合处理多个样品。机械破坏比高压或超声波频率更温和, 但不是高吞吐量, 容易产生低效的裂解。一个重要的实验限制机械中断, 高压均匀化, 和超声频率, 是无法控制的破坏整个蜂窝结构, 这样, 在裂解后, 所有的水细胞组分混合一起.此外, 所有的细胞隔间不会同时中断;因此, 溶解早期的舱室的内容可能会受到持续的破坏性力量的干扰, 比溶解晚的舱室的内容还要长。细胞分馏允许便宜, 技术简单, 高效的细胞内容分离的基础上, 同时避免昂贵的设备和样品接触苛刻的, 破坏性的力量的需要。
在这种情况下, 进口的基质被重新引入到潜在的蛋白, 并在裂解过程中再生全息蛋白, 在下游色谱或其他纯化技术之前。在裂解过程中加入 edta 合剂是一个额外的障碍, 在这种情况下, 由于 edta 将金属从色谱树脂中剥离出来并防止蛋白质结合15, 因此无法将金属亲和性作为第一步进行蛋白质纯化。一个简单和廉价的解决方案是细胞分馏渗透休克, 其中差异离心和普通实验室试剂, 使研究员仔细提取足够的蛋白质功能分析。渗透冲击分馏利用渗透压的两个步骤的变化, 以分离的细胞舱室。首先, 高渗缓冲液会使细胞在水离开每个细胞时产生圆齿, 其次, 低渗缓冲液会使细胞膨胀, 因为水重新进入每个细胞。通过仔细控制细胞膨胀的时间, 外层的膜可以有选择地裂解 (由于来自流入水的渗透压的积聚), 从而使它们的内容排空到缓冲液中。内膜的保存保证了细胞质中的原生质, 并通过离心分离与周的含量。
YfeA 是一种能结合铁、锰和锌原子的 polyspecific 的收缩型,16。结合金属的相对比例可以根据生长过程中的金属补充而改变, 并通过 X 射线荧光检测, 如阿贡国家实验室的高级光子源16。x 射线荧光使研究人员能够快速地描述一个广泛的金属组装, 而不需要大的或衍射质量的晶体, 甚至可以从蛋白质沉淀或蛋白质溶液中收集数据。
x 射线荧光可以迅速揭示意想不到的结果, 如, 在这种情况下, 主要 YfeA 基板是锌, 而不是书面的生理基质铁或锰的16。如果在收集 x 射线散射数据之前使用, x 射线荧光可以在实验设计中告知研究者, 例如, 用于反常 x 射线散射数据收集的金属能量边缘。就像确定金属的相对丰度一样, X 射线荧光也可以确定样品中是否缺少金属, 提供了一种快速的方法, 即从全息蛋白中分离含有载脂蛋白蛋白的晶体, 并估计金属信号强度不需要耗时的数据处理。在识别具有强金属信号的样品时, 用于反常 X 射线散射数据收集的精确波长可以通过多波长反常色散 (MAD) 扫描来确定。
本详细的协议旨在帮助新的实验者成功地进行细胞分馏, 并有效利用同步辐射光束的硬件来分析全金属含量, 并推进金属结合蛋白的研究。
细胞分馏是一个有用的工具, 专门探测的内容的蜂窝室, 并可以作为一个有用的工具, 以提取小分子, 如金属原子, 以及大分子, 如蛋白质。值得注意的是, 细胞分馏不是一个绝对的技术, 可能是错误的容易, 不小心注意到混合/悬浮, 孵化温度, 和孵化时间。不完全混合可导致最小的膜裂解, 从而可忽略的分馏, 室温下的分馏可导致两种膜的快速裂解, 导致周分数与细胞质含量的污染, 并延长潜伏期也会导致过度的溶解, 从而造成分数污染。为实现高效和相对完整的外膜裂解 (同时保持内膜) 的合理折衷方法是在低渗分馏缓冲液中, 在冰上进行20分钟的孵化。另一种考虑是提取的方法, 即通过摇晃或涡流的苛刻提取可能会损害提取物的质量, 如导致蛋白质聚集。建议采用刮刀、倒置或吸管吸液等方法进行混合, 以保持高质量的下游分析材料。从制备细胞分馏的纯化可以发生在可变效率, 如图 1所示。在一个实验中, YfeA 开始作为提取的周内容的 8% (图 1C), 而在另一个实验中, YfeA 开始作为17% 的周内容 (图 1D)。这些区别可能起因于几个原因例如变的表达条件 (增加 EDTA 对生长媒介能增加基因的表示由饥饿机制调控, 例如毛皮章程 Yfe 促进者), 反复使用冷冻永久股票和人为错误。而不是调整孵化时间, 建议扩大的准备。从从分数的纯化建议包括一个线性梯度洗脱从阴离子交换色谱步骤。阶梯梯度洗脱是一种洗脱策略, 在流动相组成 (i. e., 0 毫米氯化钠, 50 毫米氯化钠, 150 毫米氯化钠,等) 中使用离散和突变。线性梯度洗脱是一种洗脱策略, 使用渐进变化的流动相组成 (即, 0 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钠, 10 毫米氯化钠,等。阶梯梯度是有用的分离分子有不同的亲和力为固定相, 和线性梯度洗脱是有用的分离分子, 有相似的亲和力为固定相。在纯化蛋白的情况下, 没有人工纯化标记 (为了增强对固定相的亲和性) 从一个富含独特蛋白质种类的细胞室, 建议线性梯度洗脱分离蛋白质的非, 可能有相似的亲和力, 固定相作为蛋白质的兴趣。一般来说, 1-2 毫克的纯化载脂蛋白 YfeA 的产量预计从每公升的文化表达 YfeA 从其内源性的鼠疫杆菌启动子。
x 射线荧光是一种技术, 使调查人员能够快速确定样品中的金属含量, 并告知调查人员关于意外的金属合并, 否则将是未知的。虽然 EDTA 是包括在高渗分馏缓冲, 以消除松散相关或自由金属, YfeA 衍生的从部分可以包含一些全息蛋白。鉴于金属运输是一个动态的过程, 也许全息蛋白质的内容来源于 YfeA, 它还没有将其货物捐赠给 YfeBCDE。值得注意的是, X 射线荧光只测量总的金属含量, 不表明金属是否在晶格中有序, 或特定的与蛋白质结合。要确定金属是否在晶格中有序排列, 以及/或特异地与蛋白质分子结合, 需要进行 X 射线散射数据的采集和处理。然而, x 射线荧光可以快速抽样评估金属污染和/或残余的全息蛋白整合。同步辐射时间是有限的, 并没有总有时间来制定一个战略, 收集 x 射线散射数据的每个样本, 因此 x 射线荧光是一个有价值的技术, 以筛选许多晶体和优先级的样品 x 射线应收集散射数据。此外, x 射线荧光可以从不衍射 x 射线的样品中收集数据。在收集 X 射线荧光数据时, 有时信号会非常微弱, 由此产生的光谱言之无物。为了提高信号的强度, 无论是 x 射线荧光或疯狂扫描, 考虑增加曝光时间和/或减少 x 射线束衰减。当样品被确定为收集 x 射线散射数据时, 建议在样品的不同部分收集 x 射线散射数据, 而不是用于 x 射线荧光和疯狂扫描以减少辐射损伤, 提高数据质量收集, 并尽量减少任何潜在的异常信号的减少。
检测放射性示踪剂需要 nanomolar 数量的材料或更少, 并使用这些示踪物作为分子追踪试剂提供了一种简单和高度敏感的探测细胞过程的方法。上述 radiometal 测定方法可用于测定全金属的摄取量, 分布在细胞间, 以及吸收率。事实上, 每个数据的时间点需要40分钟的分馏;然而, 随着每个时间点的到达, 细胞立即颗粒和孵化在高盐缓冲 (图 5, 步骤 1)。Radiometal 测量介质, 丢弃高盐缓冲器 (图 5, 步骤 1) 和周和细胞质分数后 (图 5, 步骤 3) 表示高盐缓冲孵化成功地删除所有剩余的无关联自由金属, 在到达时间点后, 在最初的离心后徘徊。初始离心去除大部分 (高达 80%) 无关联的游离金属, 和离心后, 孵化在高盐缓冲也删除额外剩余的无关联自由金属。在40分钟的分馏过程中, 任何悬而未决的游离金属都不会对金属运输产生显著影响。40分钟的分馏对细胞内金属运输的影响是谨慎的数据解释的另一个考虑。几乎整个分馏协议发生在冰上, 除了30第二次离心之间的步骤。金属运输时间课程实验表明, 保持电池在4° c 废除的金属传输20,21,22;因此, 由于实验是在冰层上进行的, 40 分钟的分馏不会在细胞质的从中显著地增加金属含量, 而金属含量则有望代表细胞的时间点。最初离心。
测定不同细胞间的相对摄取量可以帮助了解 XFS 的数据, 证实基板的生理性质, 并使研究者能够进一步探测一个机制的分子细节。例如, 增加基因突变的 radiometal 吸收实验提供了一个直接的方法来加强关键功能残留物或分子参与基板运输。radiometal 吸收实验和分析的优点包括: 快速周转, 高吞吐量, 高重现性, 以及比较生长条件和遗传结构的实验的并行化。
The authors have nothing to disclose.
还收集了通用/CA@APS 的数据, 该基金全部或部分资金来自国家癌症研究所 (ACB-12002) 和国立普通医学科学研究所 (AGM-12006) 的联邦基金会。这项研究使用了先进的光子源 (APS) 的资源, 美国能源部 (doe) 科学办公室的用户设施, 由阿贡国家实验室在合同 No. 操作的能源部科学办公室DE-AC02-06CH11357使用先进的光子源得到了美国能源部, 科学办公室, 基础能源科学办公室的支持, 合同 No。W-31-109-Eng-38
我们要感谢 UAB 综合癌症中心-质谱/蛋白质组共享设施 (P30CA13148-38), 以帮助他们在质谱分析。
C.D.R. 得到了阿拉巴马大学伯明翰分校多元化、公平和包容性办公室的资助。L.L.R. 在伯明翰的阿拉巴马大学放射科的支持下。能源部, 科学办公室, 同位素计划支持52锰生产和 a.v.f. m. 根据授予 DESC0015773。
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |