En protokol til udvinding af en periplasmic overgang metal anstandsdame i forbindelse med sine indfødte bindende partnere og Biofysisk karakterisering af substrat indholdet af X-ray fluorescens og radiometal optagelse er præsenteret.
Vi demonstrere en skalerbar metode til adskillelse af den bakterielle periplasm fra cytoplasmaet. Denne metode bruges til at rense periplasmic protein biofysiske karakterisering og foranstaltning substrat overførsel mellem periplasmic og cytoplasmatisk rum. Ved nøje begrænser den tid, periplasm er adskilt fra cytoplasma, kan eksperimentatoren udvinde protein af interesse og assay hvert rum enkeltvis til substrat uden fremførsel kontaminering mellem rum. Den udpakkede protein fra fraktionering kan derefter analyseres yderligere for tre-dimensionelle struktur bestemmelse eller substrat-bindende profiler. Alternativt, kan denne metode udføres efter inkubering med en radiotracer til at bestemme samlede procent optagelse, samt distribution af tracer (og dermed metal transport) på tværs af forskellige bakterielle rum. Eksperimenter med en radiotracer kan hjælpe med at differentiere mellem en fysiologisk substrat og artefactual substrat, såsom dem, der forårsages af mismetallation.
X-ray fluorescens kan bruges til at opdage tilstedeværelsen eller fraværet af metal indarbejdelse i en prøve, samt måle ændringer, der kan opstå i metal inkorporering som et produkt af vækstbetingelser, rensning betingelser og/eller krystallisering betingelser. X-ray fluorescens giver også en relativ måling af overflod for hvert metal, som kan bruges til at bestemme den bedste metal energi absorption peak skal bruges til indsamling af anomale X-ray spredning. Radiometal optagelse kan bruges som en metode til at validere den fysiologiske karakter af et substrat, opdaget af X-ray fluorescens samt støtte opdagelsen af roman substrater.
I gram-negative bakterier, er cytoplasmatisk puljer af overgangen metal atomer øget og genopfyldes med indre membran ABC (ATP-binding kassetten) importører, at afbøde metal translokation tværs over den indre membran. Periplasmic Cluster A-1 substrat-bindende proteiner (SBPs) komponere en gruppe af chaperoner, der binder de metal atomer direkte og ferry dem gennem periplasm at levere dem til beslægtet ABC importører1. Andre klynger af SBPs er dedikeret til transport af substrater, såsom chelaterede metal (klynge A-2), kulhydrater (klynger B og D-1) og aminosyrer (klynger B, C, F-2 og F-4); ikke desto mindre, uanset substrat, SBPs følger et evolutionært bevaret c-clamp fold2. Den generaliserede foreslåede mekanisme for SBP substrat overførsel indeholder c-clamp undergår en række krumspring, der ligner en Venus flytrap3. Generelt, klynge A-1 SBPs rense i en holo (metal-bundet) form, om studiet af disse SBPs er begrænset af vanskeligheden i at generere apo (metal-fri) former for protein for eksperimenter4. Til dato, strategier til at studere apo klynge A-1 SBPs har været begrænset til mutagenese, dialyse og delvis denaturering med ethylendiamintetra syre (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. strukturelle data fra disse eksperimenter tyder på, at klyngen A-1 SBPs netop ikke kan følge Venus flytrap mekanisme. I øjeblikket mangler fra litteraturen er en metode til fremstilling af apo klynge A-1 SBPs i vivo ved hjælp af fysiologiske bindende partnere.
Vi demonstrere for første gang ved hjælp af celle fraktionering til at rense YfeA, en klynge A-1 SBP fra Yersinia pestis, den ætiologiske agent for pest, som var konverteret til apo form gennem interaktion med dens fysiologiske beslægtet YfeBCDE ABC importør i cellen. Vi viser YfeA i apo form af energy dispersive X-ray spektroskopi (Red.), også kendt som X-ray fluorescens. Vi viser også YfeBCDE funktionalitet ved at kombinere celle fraktionering med meget følsomme radioaktivt metal optagelse undersøgelser at skelne mellem metal udbredelse på tværs af den ydre membran og metal import gennem den indre membran. Brugen af et radioaktivt sporstof giver mulighed for påvisning af pg/L mængder af metaller, meget lavere end detektionsgrænsen for teknikker, sådan som Induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) eller atomare absorption spektroskopi (AAS). Dette giver mulighed for minimal undertrykkelse af netbårne af systemet ved at blive undersøgt. Desuden kræver de traditionelle metoder ofte større stikprøve diskenheder, yderligere efterbehandling og længere turn-around tid, som ikke er typiske for radiotracer assays. Således, ved hjælp af en radiotracer giver en bekvem og enkel metode til overvågning af metal distribution og udbredelse inden for en celle. Det henstår bestemmes hvis en apo klynge A-1 SBP fremstillet ved hjælp af denne metode vil gentage de strukturelle bemærkninger fra den nuværende praksis bruges til at generere apo protein.
Celle fraktionering er en etableret metode til at adskille cellulære rum implicitte med det formål at specifikt sondering deres indhold i isolation12. Celle fraktionering er almindeligt anvendt til at bekræfte placeringen af et molekyle i løbet af celle cyklus eller måler aktiviteten af et bestemt rum13. For eksempel kan metal transportaktiviteter analyseres ved sondering cellulære rum for metal substrat. Integrering af celle fraktionering muliggør skelnen og sammenligning mellem metal udbredelse på tværs af den ydre membran og metal overførsel på tværs af de indre membran. Disse processer kan derefter igen måles over tid. I tilfælde af protein oprensning, de mest almindelige metoder til celle lysis og adskillelse af opløselige komponenter fra uopløselige komponenter er mekanisk afbrydelse (dvs, formaling, blanding), højtryk homogenisering (dvs, fransk pres celle tryk, celle Disrupters), og ultrasonisk frekvenser (dvs., ultralydbehandling)14. Brug af ultrasonisk frekvenser til lyse celler er generelt bedst egnet til små mængder; dog er sonikering kendt for at skabe overdrevne varme, der kan denaturerer protein. For at undgå at generere overdreven varme, anvendes ultrasonisk frekvenser normalt i sekventielle korte stød, hvilket kan være tidskrævende og uforvarende nedbrydes DNA molekyler i mindre fragmenter. Derudover kan flere dyre sonikering sonder være påkrævet for forberedende og analytiske eksperimenter, som hver sonde har en begrænset rækkevidde for den sample volumen, der kan behandles. Brug af højt tryk til lyse celler undgår at generere overdreven varme under celle lysering af køling fransk pres celle presse komponenter før lysis eller opererer en celle disruptor i et koldt miljø som et koldt værelse. Ligesom sonikering sonder, kan flere sæt af fransk pres celle presse komponenter skal købes for at behandle en bred vifte af prøven diskenheder. Fransk pres celle presse forsamlinger er nemt at tilslutte men akavet at betjene og rense, kan være tung at flytte og er udsat for tilstopning af tætte prøver. Fordele ved at bruge ultrasonisk frekvenser og højtryks systemer til lyse celler omfatter høj prøve opsving, evnen til at behandle flere prøver med minimal krydskontaminering og justerbar klipning kraft, som kan være tilpasset til lysis optimering af en bred vifte af prøven typer. Optimering kan forekomme ved at justere ultralyd hyppigheden, varigheden af byger, stempel pres pounds per kvadrattomme (psi), og antallet af passerer gennem pressen. Anvendelse af mekanisk afbrydelse af lyse celler kan være den teknisk mest trivielle og billigste strategi for celle lysering. Mekanisk afbrydelse kan præsentere udfordringer i prøve opsving og er ikke ideelt til behandling af flere prøver. Mekanisk afbrydelse er blidere eksempler end højtryk eller ultrasonisk frekvenser, men er ikke høj overførselshastighed og er udsat for ineffektive lysering. En væsentlig eksperimentelle begrænsning af mekanisk afbrydelse, højtryk homogenisering og ultrasonisk frekvenser, er ukontrollabel afbrydelse af den hele cellulære arkitektur sådan, at efter lysis, alle vandig celle bestanddele blandes sammen. Desuden, alle celle rum ikke forstyrrer samtidig; indholdet af rum, der lyse tidligt kan derfor underkastet løbende forstyrrende kræfter længere end indholdet af rum, der lyse sent. Celle fraktionering giver mulighed for billig, teknisk ukompliceret, effektive rum-baserede adskillelse af celleindholdet samtidig undgå behovet for dyrt udstyr og prøve eksponering for barske, forstyrrende kræfter.
I tilfælde af SBP, importerede substrat er genindført til potentielt apo protein og regenererer holo protein under lysis, før downstream kromatografi eller andre rensning teknikker. Optagelse af EDTA chelator under lysis udgør en ekstra hindring, hvor metal affinitet som et første skridt af protein oprensning ikke er muligt da EDTA vil fratage metal fra kromatografi harpiks og forhindre protein bindende15. En enkel og billig løsning er celle fraktionering af osmotisk chok, hvor differential centrifugering og fælles laboratoriereagenser aktiverer investigator at omhyggeligt uddrage tilstrækkeligt protein for funktionelle analyse. Osmotisk chok fraktionering udnytter en to-trins ændring i osmotisk tryk til at adskille cellulære rum. For det første en hypertonisk buffer får cellerne til rundtakkede som vand forlader hver celle og for det andet en hypotonic buffer får cellerne til at svulme vand igen træder hver celle. Ved omhyggeligt at kontrollere hvor længe cellerne svulmer op, kan de ydre membraner selektivt mængden (på grund af ophobning af osmotisk tryk fra den indkommende vand), således at tømme deres indhold i bufferen. Bevarelse af den indre membraner sikrer, at cytoplasmatisk indholdet er bevaret i spheroplasts, og er let adskilt fra periplasmic indhold af centrifugering.
YfeA er en polyspecific SBP i stand til at bindende jern, mangan og zink atomer16. De forholdsvise mængder af indarbejdet metal kan ændres efter metal tilskud under væksten, og analyseres af X-ray fluorescens som er tilgængelig på Argonne National Laboratorys avancerede Photon kilde16. X-ray fluorescens muliggør investigator til hurtigt profil en bred samling af metaller uden behovet for stor eller diffraktion kvalitet krystaller, og selv kan indsamle data fra protein forhastede eller proteinholdige løsning.
X-ray fluorescens kan hurtigt afsløre uventede resultater som i dette tilfælde den primære YfeA substrat er zink og ikke dokumenteret fysiologiske substrater jern og mangan16. Hvis brugt før indsamling X-ray spredning data, kan X-ray fluorescens informere investigator i eksperimentelle design, såsom som metal energi edge(s) Hvis du vil bruge til anormale X-ray spredning dataindsamling. Lige så nyttig som bestemme den relative forekomst af en metal, X-ray fluorescens kan også afgøre, om en metal er fraværende i et udsnit, giver en hurtig metode til at adskille krystaller indeholdende apo protein fra holo protein, og estimering af metal signalstyrke uden behovet for tidskrævende databehandling. Ved at identificere en prøve med en stærk metal signal, kan den præcise bølgelængde skal bruges til indsamling af anomale X-ray spredning bestemmes af flere-bølgelængde anormal dispersion (MAD) scan.
Denne detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe nye eksperimentatorer held udføre celle fraktionering og gøre effektiv brug af synkrotron beamline hardware til at profilere metal totalindholdet og advance studiet af metal-bindende proteiner.
Celle fraktionering er et nyttigt værktøj for specifikt sondering indholdet af en cellulære rum, og kan tjene som et nyttigt værktøj til at udtrække små molekyler såsom metal atomer og makromolekyler såsom proteiner. Det er værd at bemærke, at celle fraktionering er ikke en absolut teknik og kan være fejl liggende uden omhyggelig med at blande/resuspension, inkubation temperatur og inkubationstiden. Ufuldstændig blanding kan resultere i minimal hindeagtige lysis og dermed ubetydelig fraktionering, fraktionering ved stuetemperatur kan forårsage hurtige lysering af begge membraner, hvilket resulterer i forurening af den periplasmic fraktion med cytoplasmatisk indhold, og udvidet inkuberingstider kan også resultere i overdreven lysis og dermed brøkdel forurening. Et rimeligt kompromis for at opnå effektiv og relativt komplet ydre membran lysis (samtidig bevare den indre membran) er 20 minutters inkubation over isen i hypotonic fraktionering buffer. En anden overvejelse er metoden til udvinding, hvor barske ekstraktion ved rystning eller vortex kunne forringe kvaliteten af ekstrakt som forårsager protein sammenlægning. Det anbefales at blandes forsigtigt som af spatel, inversion eller sugning af pipette til at opretholde høj kvalitet materiale til downstream analyse. Rensning fra forberedende celle fraktionering kan forekomme med variabel effektivitetsgevinster, som det fremgår af figur 1. YfeA begyndte i et eksperiment, som 8% af de udtrukne periplasmic indhold (figur 1 c), mens i et andet eksperiment, YfeA begyndte som 17% af de periplasmic indhold (fig. 1 d). Disse forskelle kan skyldes flere årsager såsom variable udtryk betingelser (tilføje EDTA til vækst medier kan øge udtryk af gener reguleret af sult mekanismer som pels regulering af Yfe promotor), gentagen brug af frosset permanente lagre, og menneskelige fejl. I stedet for at justere inkuberingstider, anbefales det at skala-up forberedelse. Oprensning fra periplasm fraktion er anbefalet at anføre en lineær gradient eluering fra anion exchange kromatografiske trin. Et trin gradient eluering er en eluering strategi bruger diskrete og pludselige ændringer i mobil fase sammensætning (dvs., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, osv.). En lineær gradient eluering er en eluering strategi, der bruger gradvis ændring i mobile fase sammensætning (dvs. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, osv.). Et trin gradient er nyttig til at adskille molekyler, der har forskellige tilhørsforhold til den stationære fase, og en lineær gradient eluering er nyttig til at adskille molekyler, der har lignende tilhørsforhold til den stationære fase. I forbindelse med rensning af protein med ingen kunstige rensning tag (at øge affinitet til den stationære fase) fra en celle kabine, som er rig på unikke protein arter, anbefales en lineær gradient eluering at adskille proteiner af noninterest, der kan har lignende tilhørsforhold til den stationære fase som protein af interesse. Generelt et udbytte på 1-2 mg renset apo YfeA forventes fra hver liter af kultur at udtrykke YfeA fra sin endogene Y. pestis promotor.
X-ray Fluorescens er en teknik, der gør det muligt for efterforsker hurtigt metal indholdet bestemmes i en prøve, og informere investigator om uventede metal indarbejdelse, der ellers ville være ukendt. Selvom EDTA er inkluderet i hypertonisk fraktionering bufferen til at fjerne løst forbundet eller gratis metal, kan YfeA stammer fra periplasm fraktion indeholde nogle holo protein. Metal transport er en dynamisk proces, måske stammer holo proteinindhold fra YfeA, der stadig ikke har doneret sin last til YfeBCDE. Det er værd at bemærke, X-ray fluorescens kun måler metal totalindholdet og angiver ikke, hvis metal er bestilt i en krystalgitter eller specifikt bundet til et protein. Bestem hvis metal er bestilt i en krystalgitter og/eller specifikt bundet til et protein molekyle er X-ray spredning dataindsamling og -behandling påkrævet. Ikke desto mindre X-ray fluorescens giver mulighed for hurtig prøve vurdering af metal kontaminering og/eller resterende holo protein integration. Synkrotron stråling tid er begrænset, og der er ikke altid tid til at udarbejde en strategi for indsamling af X-ray spredning data på hver prøve, således X-ray Fluorescens er en værdifuld teknik screening mange krystaller og prioritering for hvilke prøver X-ray spredning data bør indsamles. Derudover muliggør X-ray fluorescens indsamling af data fra prøver, der ikke kan diffract x-stråler. Mens indsamling X-ray fluorescens data, til tider signalet kan være meget svag og de deraf følgende spektre intetsigende. For at forbedre styrken af signalet, enten for X-ray fluorescens eller MAD scanner, overveje at øge eksponeringstiden og/eller faldende X-ray stråle dæmpning. Når en stikprøve er identificeret for indsamling af X-ray spredning data, anbefales det at indsamle X-ray spredning data på en anden del af prøven end hvad blev brugt til X-ray fluorescens og MAD scanner til at minimere strålingsskader, forbedre kvaliteten af dataene samling, og minimere eventuelle potentiale for reduktion af unormal signal.
Påvisning af radioaktive sporstoffer kræver nanomolar mængder af materiale eller mindre, og brugen af disse røbestoffer som Molekylær tracking agenter giver en simpel og yderst følsom metode til sondering cellulære processer. Radiometal analysen ovenfor skitserede kan bruges til at bestemme samlede metal optagelse, distribution på tværs af cellulære rum, som satserne for optagelse. Faktisk kræver hvert datapunkt tid en 40 minutters fraktionering; som hvert tidspunkt er nået, er celler dog straks pelleted og inkuberes i høje salt buffer (figur 5trin 1). Radiometal målinger af medierne, kasserede høje salt buffer (figur 5trin 1) og periplasmic, og cytoplasmatisk fraktioner efter (figur 5trin 3) angive høje salt buffer inkubering med held fjerner alle resterende ikke-tilknyttede gratis metal, der dvælede efter den indledende centrifugering efter at have nået tidspunkt. Den første centrifugering fjerner de fleste (op til 80%) af de ikke-tilknyttede gratis metal og centrifugeringen efter inkubation i det høje salt buffer fjerner også yderligere resterende ikke-tilknyttede gratis metal. Enhver dvælende unassociated gratis metal forventes ikke at betydeligt påvirke metal transport under 40 minutters fraktionering. Indflydelse af 40 minut fraktionering intracellulære metal transport er en anden overvejelse for forsigtig data fortolkning. Stort set opstår hele fraktionering protokol over isen, bortset fra de 30 anden centrifugering mellem trin. Metal transporttid kursus eksperimenter har tilkendegivet at opretholde celler ved 4 ° C ophæver metal transport20,21,22; Derfor, fordi eksperimenterne opstår over isen, 40 minutters fraktionering forventes ikke at betydeligt forøge metal niveauer i periplasm af cytoplasmaet og metal niveauerne forventes at være repræsentant for tidspunkter hvor cellerne var i første omgang centrifugalized.
Bestemmelse af relativ optagelse i forskellige cellulære rum kan hjælpe med at informere XFS data, bestyrker den fysiologiske karakter af et substrat samt aktiverer investigator at yderligere sonde molekylære detaljerne i en mekanisme. For eksempel, tilsætning af genetiske mutagenese til radiometal udbredelse eksperimenter giver en direkte metode til at styrke vigtige funktionelle restkoncentrationer eller molekyler involveret i substrat transport. Fordele ved radiometal optagelse forsøg og analyser omfatter hurtig turnaround, høj produktivitet, høj reproducerbarhed og parallelization af eksperimenter sammenligning vækstbetingelser og genetiske konstruktioner.
The authors have nothing to disclose.
Data blev også indsamlet på GM/CA@APS, som er blevet finansieret helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute (ACB-12002) og National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Denne forskning anvendes ressourcer af avancerede Photon kilde (APS), en US Department af energi (DOE) Office of Science bruger Facility drives for DOE Office of Science ved Argonne National Laboratory under Kontraktnr. DE-AC02-06CH11357. Brug af avanceret Photon kilde blev støttet af U. S. Department of Energy, Office of Science, Office af energi Grundvidenskab, under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38.
Vi vil gerne anerkende UAB Comprehensive Cancer Center – masse massespektrometri/Proteomics delt facilitet (P30CA13148-38) for deres hjælp i massespektrometri analyse.
C.D.R. blev støttet af en bevilling fra University of Alabama i Birmingham Office af mangfoldighed, egenkapital og inklusion. L.L.R. blev støttet af radiologi Institut for University of Alabama i Birmingham. Department of Energy, Office of Science, isotop Program støttet 52Mn produktion og A.V.F.M. under tildele DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |