JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Dannelsen av kovalente DNA-addukter av enzymatisk aktivert kreftfremkallende og narkotika In Vitro og deres vilje av 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Vurderer styrken på miljømessige kjemikalier og farmakologiske, være enzymatisk bioactivated til mellomprodukter generere kovalente DNA-addukter, er et viktig felt i utviklingen av kreft og dens behandling. Metodene er beskrevet for sammensatte aktivisering skjemaet DNA-addukter, samt deres oppdagelse og kvantifisering.

Abstract

Kovalente DNA-addukter dannet av kjemikalier eller stoffer med kreftfremkallende styrke vurderes som en av de viktigste faktorene i Release fase av kreftfremkallende prosesser. Denne kovalente bindingen, som er årsaken til tumorigenesis, evalueres nå som en sentral dogme av kjemiske kreft. Her metodene er beskrevet ansette reaksjonene katalysert av cytochrome P450 og ekstra biotransformation enzymer å undersøke styrken av kjemikalier eller medisiner for aktivisering å metabolitter danner disse DNA-addukter. Prosedyrer blir presentert som beskriver isolering av mobilnettet fraksjoner besitter biotransformation enzymer (mikrosomale og cytosolic prøver med cytochromes P450 eller andre biotransformation enzymer, dvs., peroxidases, NADPH: cytochrome P450 oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase eller xantin oksidase). Videre metodene er beskrevet som kan brukes for metabolske aktivering av analysert kjemikalier av disse enzymene samt for isolering av DNA. Videre riktig metodene kan oppdage og kvantifisere kjemiske/narkotika-avledet DNA-addukter, dvs.forskjellige modifikasjoner av 32P-postlabeling teknikk og ansettelse av radioaktivt-merket analysert kjemikalier, er vist i detalj.

Introduction

Metabolismen av xenobiotics (miljømessige kjemikalier eller medisiner) oppstår i to faser1. Faser I og II mål å gjengi den opprinnelig hydrofobe (ikke vannløselige) forbindelser mer hydrofile (vannløselige), dermed gjør dem lett excretable via urin, avføring eller svette. Fase I (functionalization) reaksjoner inkluderer oksidasjon, reduksjon, og hydroksylering katalysert av enzymer som cytochrome P450s (P450s, CYPs), peroxidases (dvs., cyclooxygenase, COX), aldo-keto reductases (AKRs), og mikrosomale Flavin inneholder monooxygenases (FMOs). Fase I omfatter også reduksjon reaksjoner, formidlet av en rekke reductases dvs mikrosomale NADPH: cytochrome P450 reduktase (POR) og cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xantin oxidase (XO) og aldehyd oxidase (AO)1 . I den andre fasen (bøyning), de funksjonelle gruppene som fulgte i fase er jeg pleide å bøy små polare molekyler å ytterligere øke polaritet. Eksempler på enzymer anses å delta i reaksjonen av fase II inkluderer sulfotransferases (SULTs), N, O– acetyltransferases (NAT), methyltransferases som catechol –O– methyltransferase (COMT), glutation S– transferases (GSTs) og uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. Klassifisering av enzymer i fase I eller II er, ikke rigid, og noen enzymer kan kanskje grupperes i hver kategori.

P450 enzymer (EC 1.14.14.1) er måltema inneholder proteiner i ulike organismer, som deltar i biotransformation av mange kjemikalier, utløse deres konvertering3,4. P450 enzymer katalysere hydroksylering av mange underlag, med en reaksjon der en atom av dioxygen føres inn molekyl av xenobiotics, mens andre atom oksygen er redusert til skjemaet vann reaksjon som krever to elektroner [ligningen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymer lokalisert i endoplasmatiske retikulum membranen av pattedyrceller (mikrosomale P450 systemer) er medlemmer av multienzyme monooxygenase system, som inneholder ytterligere NADPH: cytochrome P450 reduktase (POR) og cytochrome b5 , underlaget av enzymet betegnet som NADH: cytochrome b5 reduktase. En allment aksepterte teori hypothesizes at giveren av to elektroner trengs for P450 er NADPH/POR systemet. Likevel kan cytochrome b5 også fungere som en donor av elektroner for P450, nemlig som giver av elektron å redusere P450 under andre reduksjon av syklusen reaksjon der den fungerer sammen med NADH: cytochrome b5 reduktase2,3,4.

Pattedyr utnytte ulike P450 enzymer (f.eks enzymer familier 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 og 27) for syntese av verdifulle endogene forbindelser, som steroider, og bruke dem til katabolisme naturprodukter2,3 . Andre CYP pattedyr enzymer, som menneskelige CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 og 3A4, metabolismer eksogene kjemikalier som brukes som narkotika. 5 , 6 viktigste enzymer utløse metabolismen av narkotika er CYPs av 3A og, spesielt CYP3A4. Konverteringer av xenobiotics, for eksempel pro-kreftfremkallende og pro-giftstoffer, er formidlet av menneskelige CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 og 3A42,5. De fleste CYPS disse finnes i leveren (unntatt CYP1A1 og 1B1). Likevel, CYPs er også uttrykt i flere extrahepatic organer. Slike P450s kan være av stor betydning, hovedsakelig når delta de i bioactivation metabolismen av kjemikalier (narkotika) til reaktive mellomprodukter i disse organene7. Ulike P450s er indusert av flere stoffer som er deres underlag, men dette ikke er nødvendigvis tilfelle.

Mange P450 enzymer spiller en rolle i kjemikalier (legemiddel) toksisitet. De kan konvertere xenobiotics ikke bare til sine avrusning metabolitter, men også aktivere dem til reaktive arter, som endre endogene makromolekyler som i tillegg viser ulike biologiske egenskaper, vanligvis forårsaker giftigheten. DNA, lipider og proteiner kan være mål for endringen av reaktive elektrofiler og radikale generert fra aktivert kjemikalier. I tilfelle av DNA, å løse flere viktige genet svar og deres mekanismer er allerede kjent2,3,4,5.

Endringene i DNA kan føre til en nedgang i veksten cellekontroll, og dette fenomenet anses å være den dominerende faktoren som fører til utvikling av kreftfremkallende prosesser. Generering av kovalente DNA-addukter kjemikalier har kreftfremkallende styrke er vurdert som en av de viktigste trinnene i Release fase av kreftfremkallende prosesser8,9,10,11. Det ble demonstrert at relasjoner mellom dannelsen av DNA-addukter og tumorigenesis oppstår, mens en nedgang i DNA-addukter er ansvarlig for chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. dannelsen av kreftfremkallende/narkotika-avledet DNA-addukter avhenger av individuelle baser av DNA og påvirkes av sekvenser av disse baser i DNA. Reparasjonen av DNA-addukter er avhengige av deres plassering (på den transkribere eller ikke-transkribert DNA stranden) og typer endret nukleotid sekvenser8,11,12,15, 16.

I denne artikkelen beskriver vi prosedyrer utnytte konvertering enzym-katalysert av kjemikalier (narkotika) å undersøke deres styrke aktiveres i metabolitter som endret DNA (generere DNA-addukter). Kovalente DNA bindende, test sammensatte bør vanligvis være aktivert ved oksidativt eller reductive reaksjoner, avhengig av enkelte stoffer. Oksidativt eller reductive aktivisering testet kjemikalier er formidlet av en P450-avhengige enzymatisk system i mikrosomale subcellular brøken eller ved reduksjon med reductases presentere både i microsomes (POR, NADH: cytochrome b5 reduktase, P450 enzymer) og i mobilnettet cytosolic subcellular brøker (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reaktiv metabolitter deretter binde til DNA danner DNA-addukter. Fordi både oksidativt og reductive reaksjoner er viktige for å aktivere flere legemidler til disse reaktive arter, er eksperimentelle prosedyrene ansette oksidasjon/reduksjon enzymatisk systemet beskrevet. Videre riktig metodene kan oppdage og kvantifisere disse DNA-addukter er beskrevet i detalj.

To uavhengige prosedyrer for å avgjøre om testen kjemisk, aktivert av enzymatiske systemer, er bundet til DNA anbefales: 32P-postlabeling teknikk og utnytte radioaktivt-merket sammensatte (f.eks., 3H eller 14 C). For første anbefales pilot, screening 32P-postlabeling analysen. Fastsettelse av DNA innholdet i løsninger, nettopp evalueres, må komme foran begge metodene.

De 32P-postlabeling teknikk benytter enzymatisk hydrolyse av DNA endret av ikke-radioaktivt kjemikalier (karsinogen/stoff) til 3´-phosphodeoxynucleosides, ekstra fosforylering med radioaktive fosfor (32P) på 5´- OH addukter posisjon og separasjon av kjemiske-deoxynucleotide fra normal (uendret) deoxynucleotides av kromatografi17 (figur 1). DNA endret av kjemisk forbindelse er hydrolyzed av en blanding av endonuclease, micrococcal nuclease og exonuclease, kjent som milt fosfodiesterase. Blandingen av hydrolyzed DNA som inneholder både normale (uendret) og endret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates er reagert med [γ –32P] ATP i nærvær av carrier (ikke-radioaktive) ATP og T4-polynucleotide kinase ved pH 9,5 til skjemaet 5´- 32P-merket 3´, 5´-bisphosphates (“standard” prosedyre i figur 1). Brukte alkaliske pH er i stand til å minimere enzymaktiviteten av T4-polynucleotide kinase til dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på posisjon 3´. Separasjon og oppløsning av 32P-merket addukter fra merket deoxynucleotides som ikke endres av kjemikalier er utført av retninger anion exchange tynt lag kromatografi (TLC) på polyethyleneimine (PEI) cellulose (figur 2 ). I første og andre elueringsrør trinnene (i D1 og D2 retninger) er merket normal (uendret) deoxynucleotides samt [32P] fosfat elut fra starten av TLC-PEI-cellulose platen med vann løsninger av elektrolytt på et kort stykke brukt kromatografiske papir brukes på TLC platen, mens deoxynucleotides som inneholder bundne kjemikalier viser hydrofobe egenskaper (karsinogen/narkotika-addukter) er opprettholdt på starten av PEI innen platen løses på i tillegg med flere ulike løsemiddel systemer i D3 og D4 retninger (figur 2). Lokalisering av addukter ved hjelp av skjermen forbedret autoradiography; den separerte addukter registreres som mørke gjenkjennelig flekker på X-ray filmer. Flekker er forbrukeravgift fra platen og brukt om å kvantifisere radioaktivitet av flytende scintillation eller Cerenkov teller. En lagring fosfor imaging metode som er tilpasset til kart og kvantifisere DNA-addukter på chromatograms oppdaget av den 32P-postlabeling analysen er nå også brukt. 18 the Instant Imager maskin er ofte brukt for slike deteksjon og kvantifisering av DNA-addukter. Denne metoden gir mer enn 10 ganger høyere følsomhet for å oppdage 32P enn teknikken av skjermen forbedret autoradiography19.

Mengder DNA-addukter er bestemt som verdier av relativ adduct merking (RAL), beregnet ved hjelp av formelen (2) som følger:

CPM. i adduct deoxynucleotides
RAL =—(2)
aktiviteten av 32P-ATP (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

Verdiene for RALs er forholdet mellom antall priser adducted deoxynucleotides over antall utbredelsen av totalt [adducted og normal (uendret) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Men denne beregningen er basert på like merking effektiviteten av addukter og normal deoxynucleotides22. Klassisk (“standard”) prosedyren av 32P-postlabeling teknikk er passende for ulike DNA-addukter (omfangsrik og/eller ikke-klumpete addukter), men sin følsomhet er ikke tilfredsstillende å oppdage addukter finnes i små mengder i DNA. Bruker denne fremgangsmåten, er mengden av en adduct i 107 uendret deoxynucleotides i DNA (0,3 fmol adduct/µg DNA) synlig.

En rekke modifikasjoner av klassisk 32P-postlabeling prosedyren har vært benyttet for å heve sensitiviteten av teknikken. Opptil 10 – til 100-ganger høyere følsomhet til fastsettelse av addukter av 32P-merking er oppnådd begrensende nivåene [γ –32P] ATP (intensivering prosedyren). 23 , 24 en ytterligere prosedyren gir en økning i følsomhet av 32P-postlabeling metoden benytter en inkubering av fordøyd DNA inneholder addukter med nuclease P1 (fra penicillin citrinum)21 (figur 1). Dette enzymet foretrekker å dephosphorylate uforandret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, mens deoxynucleotides bundet kjemikalier (adducted nukleotider) er egentlig ikke underlag av dette enzymet. Derfor dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) er ikke fosforylert av T4-polynucleotide kinase av [32P] fosfat fra γ –32P] ATP. Men noen av nukleotider hvor kjemikalier er bundet (adducted deoxynucleotides), som arylamine addukter erstattet på C8 av deoxyguanosine, kan bedephosphorylated av dette enzymet. I kontrast, de fleste andre addukter (f.eksaddukter erstattet N2 av deoxyguanosine) er ikke dephosphorylated av nuclease P1. Denne endringen av 32P-postlabeling gjør denne metoden betydelig mer følsomme, øke sensitiviteten av mer enn tre størrelsesordener. Dessuten, denne versjonen av 32P-postlabeling gir en metode der høyere mengder DNA (5-10 µg) og et overskudd av transportør-fri [γ – 32P] ATP kan benyttes.

En annen metoden å berike den addukter, beskrevet av Gupta25, utnytter den mekanisk-egenskapene for store deoxynucleotide addukter, som kan trekkes inn n-butanol i nærvær av en fase overføring agent tetrabutylammonium klor (TBA) (figur 1) før [32P] fosfat merking, mens uforandret deoxynucleotides pakkes dårlig av denne organiske løsemidler. Men mindre hydrofobe addukter, består for eksempel av deoxynucleotides endret med ikke-aromatiske store moieties eller liten alkyl rester, ikke effektivt er utvunnet med n-butanol. Derfor er de i hovedsak undetectable når analyseres av denne endringen av 32P-postlabeling metoden.

Begge de nevnte versjonene av 32P-postlabeling øker følsomheten og måling av DNA-addukter enormt (opptil tre størrelsesordener), å kunne oppdage en adduct per 109,10 vanlige nukleotider (0,3 – 3 amol/µg DNA). Disse to metodene anbefales for testing kjemikalier for deres effektivitet covalently binde til DNA, og derfor de er beskrevet i dette arbeidet i detaljer.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til og bruk av forsøksdyr (311/1997, Landbruksdepartementet, Tsjekkia), som er i samsvar med erklæringen i Helsinki. 1. isolering av Hepatic mikrosomale og Cytosolic fraksjoner Forberede leveren subcellular brøker (microsomes rik på P450 enzymer og cytosols rik på reductases eller løselig peroxidases) fra rotter ved enkel differensial sentrifugering (105 000 x g).Merk: Det pellets og nedbryting tas som microsomes og cytosols, …

Representative Results

Ved hjelp av protokoller beskrevet her for utnyttelse av enzym-katalysert aktivering (dvs. P450, peroxidase, reduktase) for å undersøke styrken av kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika) for å være metaboliseres til mellomprodukter som resulterer i deres kovalente binding til DNA (generasjon av DNA-addukter), vi kunne løse (i) en roman mekanisme av farmakologiske handlingen av anticancer agent-ellipticine (for gjennomgang se,29,<sup class…

Discussion

I denne utredningen er det demonstrert en allment tilgjengelig metode for å studere styrken av kjemikalier skal bioactivated til metabolske mellomprodukter, som resulterer i generasjon av kovalente DNA-addukter. Dette er et viktig spørsmål, fordi evaluering av styrken på miljømessige kjemikalier eller medisiner av enzymatisk aktivisering å metabolitter generere kovalente DNA-addukter er et viktig felt i utviklingen av kreft og dens behandling. Endring av DNA av kreftfremkallende vurdert årsaken til tumor utvikling…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av tsjekkiske Science Foundation (GACR, gi 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image