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Biochemistry

Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Avaliar a potência dos produtos químicos ambientais e drogas, a ser enzimaticamente adutos bioactivated gerando covalent DNA e intermediários, é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Métodos são descritos para ativação composta para formar que adutos de DNA, bem como técnicas para a sua detecção e quantificação.

Abstract

Adutos de DNA covalente formado por produtos químicos ou drogas com potência cancerígena são julgadas como um dos fatores mais importantes na fase de iniciação de processos cancerígenos. Essa ligação covalente, que é considerada a causa da tumorigênese, agora é avaliada como um dogma central da carcinogénese química. Aqui, são descritos métodos empregando as reações catalisadas pelo citocromo P450 e enzimas de biotransformação adicional para investigar a potência de produtos químicos ou drogas para sua ativação para metabólitos formando esses DNA adutos. Os procedimentos são apresentados descrevendo o isolamento de frações celulares possuindo enzimas de biotransformação (amostras microssomais e citosólica com citocromo P450 ou outras enzimas de biotransformação, ou seja, peroxidases, NADPH: citocromo P450 oxidorredutase, oxidorredutase de H:quinone NAD (P) ou xantina oxidase). Além disso, são descritos os métodos que podem ser usados para a ativação metabólica de substâncias químicas analisadas por estas enzimas, bem como aqueles para isolamento do DNA. Além disso, os métodos apropriados capazes de detectar e quantificar o DNA químico/drogas-derivado adutos, ou seja, diferentes modificações da técnica P-postlabeling 32e emprego de radioativo marcado analisados produtos químicos, são mostrado no detalhe.

Introduction

O metabolismo de xenobióticos (substâncias químicas ambientais ou drogas) ocorre em duas fases1. As fases I e II pretendem processar os compostos hidrofóbicos originalmente (não solúveis em água) mais hidrofílico (hidrossolúvel), tornando-os facilmente excretable via urina, fezes ou suor. Fase I (functionalization) reações incluem oxidação, redução, e hidroxilação catalisada por enzimas como a citocromo P450s (P450s, CYPs), peroxidases (i. e., ciclooxigenase, COX), aldo-keto redutases (AKRs) e microssomais Flavin, contendo monooxigenases (FMO). Fase I inclui também as reações de redução, mediadas por uma variedade de redutases ou seja, microssomais NADPH: citocromo P450 redutase (POR) e citosólica oxidorredutase de H:quinone NAD (P) (NQO1), xantina oxidase (XO) e aldeído oxidase (AO)1 . Na segunda fase (conjugação), que foram anexados na fase de grupos funcionais são costumava conjugado de pequenas moléculas polares para aumentar ainda mais a polaridade. Exemplos de enzimas, consideradas-se a participar na reação de fase II incluem sulfotransferases (quente), N, O– acetiltransferases (NATs), metiltransferases como catecol –O– metiltransferase (COMT), glutationa S– transferases (GST) e uridina difosfato glucuronosiltransferases (UGTs)1. A classificação das enzimas na fase I ou II é, no entanto, não é rígida, e algumas enzimas, indiscutivelmente, podem ser agrupadas em duas categorias.

Enzimas P450 (CE 1.14.14.1) são o hemo que contém proteínas presentes em vários organismos, que participam da biotransformação de muitos produtos químicos, Catalisando a conversão de3,4. As enzimas P450 catalisam a hidroxilação de muitos substratos, com uma reação onde um átomo de dioxigénio é introduzido a molécula de xenobióticos, enquanto o segundo átomo de oxigênio é reduzido à água de forma pela reação que requer dois elétrons [a equação (1 4.3,)]:

RH + O2 + NADH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

As enzimas P450 localizadas na membrana do retículo endoplasmático de células de mamíferos (microssomal P450 sistemas) são membros do sistema multienzyme monooxigenase, que contém mais NADPH: citocromo P450 redutase (POR) e citocromo b5 , o substrato da enzima denominado como NADH: citocromo b5 redutase. Uma teoria geralmente aceita hypothesizes que o doador dos dois elétrons necessários para P450 é o sistema de NADPH/POR. Não obstante, citocromo b5 pode também atuar como um doador de elétrons para P450, nomeadamente como um doador do elétron reduzindo P450 durante segunda redução do seu ciclo de reação, onde atua em conjunto com a NADH: citocromo b5 redutase2,3,4.

Mamíferos utilizam várias enzimas P450 (por exemplo, as enzimas das famílias, 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 e 27) para a síntese de compostos endógenos valiosos, como os esteroides e usá-los para o catabolismo de produtos naturais2,3 . As outras CYP mamíferos enzimas, tais como humano CYP1A2, 2 9, 2 19, 2D6 e 3A4, metabolizam substâncias químicas exógenas que são usadas como drogas. 5 , 6 as mais importantes enzimas catalisando o metabolismo de drogas são CYPs da subfamília 3A, principalmente CYP3A4. As conversões de xenobióticos, tais como pro-agentes cancerígenos e pro-substâncias tóxicas, são mediadas por humano CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 e 3A42,5. A maioria destes CYPs está presente no fígado (exceto CYP1A1 e 1B1). Não obstante, os CYPs também são expressos em vários órgãos extra-hepáticas. Tais P450s pode ser de grande importância, principalmente quando participar eles bioactivation metabolismo de substâncias químicas (drogas) e intermediários reativos nestes órgãos7. Vários P450s são induzidas por vários compostos que são seus substratos, embora isto não é necessariamente o caso.

Muitas enzimas P450 desempenham um papel na toxicidade química (drogas). Eles podem converter os xenobióticos não somente em seus metabólitos de desintoxicação, mas também ativá-los para espécies reactivas, que modificam a macromoléculas endógenas que além disso, apresentam diferentes propriedades biológicas, geralmente causando sua toxicidade. DNA, lipídios e proteínas podem ser os alvos para a sua modificação por eletrófilos reativos e radicais gerados a partir de produtos químicos registrados. No caso do DNA, resolvendo várias respostas importante gene e seus mecanismos já são conhecidos2,3,4,5.

As mudanças no DNA podem resultar em uma diminuição no controle do crescimento celular, e esse fenômeno é considerado ser o fator predominante, levando ao desenvolvimento de processos cancerígenos. A geração de DNA covalente adutos com produtos químicos ter potência cancerígena é julgada como um dos passos mais importantes na fase de iniciação de cancerígenos processa8,9,10,11. Foi demonstrado que as relações entre a formação do ADN adutos e tumorigênese ocorra, Considerando que uma diminuição na quantidade de DNA adutos é responsável para Quimioprevenção8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. a formação de substância cancerígena/drogas-derivado adutos de DNA depende de bases individuais do DNA e é afetado por sequências destas bases no DNA. Os reparos de DNA adutos dependem da sua localização (na cadeia do DNA transcrita ou não-transcrita) e tipos de nucleotídeos modificados sequências8,11,12,15, 16.

Neste artigo, descrevemos os procedimentos utilizando a conversão catalisada por enzima de produtos químicos (drogas) para investigar sua potência para ser ativado em metabólitos que modificado o DNA (gerar DNA adutos). Para ligação covalente de DNA, o teste composto geralmente deve ser ativado por reacções oxidativas ou redutoras, dependendo de drogas individuais. Oxidativa ou redutora de ativação de produtos químicos testados é mediada por um sistema enzimático P450 dependente, presente na fração microssomal subcellular ou pela redução com redutases apresentar ambos em microssomas (POR, NADH: citocromo b5 redutase, enzimas P450) e no celulares fracções subcelulares citosólica (NQO1, XO, AO, peroxidase). Metabólitos reativos depois ligam ao DNA formar DNA adutos. Porque as reações oxidativas e redutoras são importantes para ativar vários medicamentos para estas espécies reactivas, são descritos os procedimentos experimentais empregando o sistema enzimático de oxidação/redução. Além disso, os métodos apropriados capazes de detectar e quantificar esses DNA adutos são descritas em detalhes.

Dois procedimentos independentes para determinar se a substância, ativada por sistemas enzimáticos, está vinculado ao DNA são recomendados: a técnica de P-postlabeling 32e utilizando composto radioativo marcado (EG., 3H ou 14 C). Para o primeiro piloto, o ensaio de 32P-postlabeling de triagem é recomendado. A determinação do teor de DNA em soluções, precisamente avaliada, deve preceder a ambos os métodos.

O 32P-postlabeling técnica utiliza a hidrólise enzimática de DNA modificado por produtos químicos não-radioativo (substância cancerígena/drogas) para 3´-phosphodeoxynucleosides, fosforilação adicional com fósforo radioativo (32P) no 5´… OH posição e a separação do produto químico-deoxynucleotide adutos de normais (sem modificações) desoxinucleótidos por cromatografia17 (Figura 1). DNA modificado por um composto químico é hidrolisada por uma mistura de endonuclease, micrococcal nuclease e do exonuclease, conhecido como baço fosfodiesterase. A mistura de DNA hidrolisado contendo ambos normais (sem modificações) e modificado desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates é reagida com [γ –32P] ATP na presença de portadora (não-radioativo) ATP e T4-polinucleotídicas quinase em pH 9,5 a forma 5´- 32P-rotulados 3´, 5´-bisphosphates (procedimento “padrão” na Figura 1). O pH alcalino utilizado é capaz de minimizar a actividade enzimática da quinase de T4-polinucleotídicas para dephosphorylate desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates em posição 3´. Separação e resolução de 32P-rotulado adutos de desoxinucleótidos rotulado que não são modificados por químicos é realizado por cromatografia de camada fina permutadora multidirecional (TLC) em polyethyleneimine (PEI) celulose (Figura 2 ). As etapas de eluição de primeiro e segundo (no sentido de D1 e D2), rotulados normais desoxinucleótidos (sem modificações), bem como fosfato [32P] é eluído desde o início da placa de TLC-PEI-celulose usando soluções de água do eletrólito em um pedaço curto de cromatográfica papel aplicado na parte superior da placa de TLC, Considerando que o desoxinucleótidos contendo produtos químicos acoplados exibindo propriedades hidrofóbicas (substância cancerígena/drogas-adutos) são mantidos no início da placa de celulose-PEI ser adicionalmente resolvidos com vários sistemas solventes diferentes em D3 e D4 as direções (Figura 2). Localização de adutos é executada usando autoradiografia tela reforçada; adutos a separados são detectados como manchas escuras de reconhecíveis em películas de raio x. As áreas de manchas são extirpadas da placa e usadas para quantificar a radioatividade por cintilação líquida ou Cerenkov contando. Um fósforo de armazenamento de imagem método que foi adaptado para mapear e quantificar o DNA adutos em cromatogramas detectadas pelo 32P-postlabeling ensaio agora também é usado. 18 máquina the Instant Imager é frequentemente utilizada para tal deteção e quantificação de DNA adutos. Este método fornece mais de 10 vezes maior sensibilidade para a detecção de 32P do que a técnica da tela reforçada autoradiografia19.

Quantidades de DNA adutos são determinados como valores de parente aduto rotulagem (RAL), calculado através da equação (2) como segue:

CPM. em aduto desoxinucleótidos
RAL =—(2)
atividade específica de 32P-ATP (em cpm. / pmol) desoxinucleótidos x pmol

Os valores da APL são a relação de taxas de contagem de desoxinucleótidos aduzidos sobre taxas de contagem do total [aduzidos e normais (sem modificações) desoxinucleótidos] desoxinucleótidos20,21. No entanto, este cálculo baseia-se na igualdade rotular as eficiências de adutos e normal desoxinucleótidos22. O procedimento clássico (“padrão”) dos 32P-postlabeling técnica é apropriado para adutos de DNA diferentes (volumosos e/ou não-volumosos adutos), no entanto, a sua sensibilidade não é satisfatória detectar adutos encontrado em pequenas quantidades no DNA. Usando este procedimento, a quantidade de um aduto em 10 desoxinucleótidos7 sem modificações no DNA (0,3 fmol aduto / µ g DNA) é detectável.

Uma variedade de modificações deste clássico 32procedimento P-postlabeling têm sido utilizados para elevar a sensibilidade da técnica. Até 10 a 100 vezes maior sensibilidade de determinação de adutos por 32P-rotulagem foi conseguido usando limitantes níveis de ATP [γ –32P] (o processo de intensificação). 23 , 24 um procedimento adicional, proporcionando que um aumento na sensibilidade do método 32P-postlabeling utiliza uma incubação de digerido DNA contendo adutos com nuclease P1 (de Penicillium citrinum)21 (Figura 1). Esta enzima prefere dephosphorylate sem modificações desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates, Considerando que o desoxinucleótidos com produtos químicos acoplados (nucleotídeos aduzidos) são essencialmente não os substratos desta enzima. Portanto, dephosphorylated desoxirribonucleosídeo 3´-monophosphates (ou seja, deoxyribonucleosides) não são fosforiladas pela quinase T4-polinucleotídicas pelo fosfato [32P] de γ –32P] ATP. No entanto, alguns dos nucleotídeos onde produtos químicos são vinculados (desoxinucleótidos aduzidos), tais como arylamine adutos substituído no C8 de Desoxiguanosina, pode bedephosphorylated por esta enzima. Em contraste, a maioria dos outros adutos (p. ex., adutos substituído no N2 de Desoxiguanosina) não são dephosphorylated por nuclease P1. Esta modificação de 32P-postlabeling faz com que este método consideravelmente mais sensível, aumentando a sua sensibilidade por mais de três ordens de magnitude. Além disso, esta versão de 32P-postlabeling fornece um método onde a maior quantidades de DNA (5-10 µ g) e um excesso de transportadora-livre [γ – 32P] ATP pode ser utilizado.

Um outro método para enriquecer os adutos, descrito por Gupta25, utiliza as propriedades físico-químicas adutos Propriedades de deoxynucleotide volumoso, que podem ser extraídos em n-butanol na presença de um tetrabutilamónio de agente de transferência de fase cloreto de (TBA) (Figura 1) antes da [32P] fosfato etiquetando, Considerando que não modificados desoxinucleótidos mal são extraídos por este solvente orgânico. No entanto, adutos menos hidrofóbico, constituído por exemplo de desoxinucleótidos modificado com metades volumosos não aromáticos ou alquila pequena resíduos, não são efetivamente extraídos com n-butanol. Portanto, eles são essencialmente indetectáveis quando são analisados por esta modificação do método de P-postlabeling a 32.

Ambas as versões mencionadas anteriormente de 32P-postlabeling aumentar a sensibilidade e a quantificação de DNA adutos enormemente (até três ordens de magnitude), sendo capaz de detectar um aduto por 109,10 normal nucleotídeos (0.3 – 3 amol / µ g DNA). Esses dois métodos são recomendados para testar os produtos químicos para sua eficiência ligar covalentemente ao DNA e, portanto, são descritos neste trabalho em detalhes.

Protocol

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os regulamentos para o cuidado e o uso de animais de laboratório (311/1997, Ministério da agricultura, República Checa), que está em conformidade com a declaração de Helsinque. 1. isolamento de fracções microssomais e citosol hepáticos Prepare o fígado fracções subcelulares (microssomas ricas em enzimas P450 ou citosol rica em redutases ou solúveis peroxidases) de ratos por centrifugação diferencial…

Representative Results

Usando os protocolos descritos aqui para a utilização de ativação catalisada por enzima (ou seja, P450, peroxidase, redutase) para investigar a potência dos produtos químicos (agentes cancerígenos/drogas) para ser metabolizada e intermediários resultando em suas ligações covalentes ligação ao DNA (geração de DNA adutos), fomos capazes de resolver (i) um romance mecanismo da ação farmacológica do ellipticine agente anticâncer (para uma revisão, ver,<sup class="x…

Discussion

Neste trabalho, está demonstrado uma metodologia amplamente acessível para estudar a potência dos produtos químicos para ser bioactivated e intermediários metabólicos, resultando na geração de DNA covalente adutos. Esta é uma questão crucial, porque a avaliação da potência de produtos químicos ambientais ou drogas de sua ativação enzimática de metabolitos gerando covalent DNA adutos é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Agora, a modificação do DNA por agentes canceríge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado pela Fundação de ciência Checa (GACR, concessão 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
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