JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Dannelsen af kovalent DNA adukter af enzymatisk aktiveret kræftfremkaldende stoffer og narkotika In Vitro og deres bestemmelse af 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Vurdere styrken af miljømæssige kemikalier og lægemidler, er enzymatisk bioactivated til mellemprodukter generere kovalente DNA adukter, er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Metoder er beskrevet for sammensatte aktivering til at danne DNA adukter, samt teknikker til deres påvisning og kvantificering.

Abstract

Kovalente DNA adukter dannet af kemikalier eller stoffer med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste faktorer i indledningen fase af kræftfremkaldende processer. Denne kovalent binding, der betragtes som årsag til tumordannelse, vurderes nu som en central dogme af kemiske carcinogenese. Her metoder er beskrevet beskæftiger de reaktioner, der katalyseres af cytochrom P450 og yderligere biotransformation enzymer til at undersøge styrken af kemikalier eller lægemidler til deres aktivering til metabolitter danner disse DNA adukter. Procedurer er præsenteret beskriver isolation af cellulære fraktioner besidder biotransformation enzymer (mikrosomale og cytosole prøver med cytokromer, der P450 eller andre biotransformation enzymer, dvs., peroxidases, NADPH: cytokrom P450 oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, eller xanthin oxidase). Derudover metoder er beskrevet som kan bruges til metabolisk aktivering af analyseret kemikalier af disse enzymer samt dem til isolering af DNA. Yderligere, de relevante metoder i stand til at påvise og kvantificere kemiske/stof-afledte DNA adukter dvs., forskellige modifikationer af 32P-postlabeling teknik og beskæftigelse af radioaktivt mærket analyseret kemikalier, er vist i detaljer.

Introduction

Metabolismen af fremmedstoffer (Miljøkontaminanter eller narkotika) forekommer i to faser1. Faser I og II har til formål at gøre de oprindeligt hydrofobe (ikke vandopløselig) forbindelser mere hydrofile (vandopløselige), hvilket gør dem let excretable via urin, afføring eller sved. Fase I (functionalization) reaktioner omfatter oxidation, reduktion, og hydroxylering katalyseres af enzymer såsom cytokrom P450s (P450s, CYPs), peroxidases (dvs., cyclooxygenase, COX), aldo-keto reductases (AKRs), og mikrosomalt Flavin-holdige monooxygenases (FMO’er). Fase I indeholder også reduktion reaktioner, medieret af en række reductases dvs mikrosomale NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytosole NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthin oxidase (XO) og aldehyd oxidase (AO)1 . I den anden fase (konjugering), funktionelle grupper, der var fastgjort i fase brugte jeg konjugat små polære molekyler for at øge polaritet. Eksempler på enzymer anses for at deltage i fase II omfatter sulfotransferases (SULTs), N, O– acetyltransferases (NAT’er), methyltransferases såsom catechol –O– methyltransferase (COMT), glutathion S– reaktion transferaser (GSTs), og uridine ud glucuronosyltransferases (UGTs)1. Klassificering af enzymer i fase I eller II er, dog, ikke stive, og nogle enzymer kan velsagtens grupperes i enten kategori.

P450 enzymer (EF 1.14.14.1) er hæm indeholdende proteiner til stede i forskellige organismer, der deltager i biotransformation af mange kemikalier, katalysere deres konvertering3,4. P450 Enzymer katalyserer hydroxylering af mange substrater, med en reaktion, hvor ét atom af dioxygen er indført i molekyle af fremmedstoffer, mens det andet atom ilt, er reduceret til form vand ved den reaktion, der kræver to elektroner [ligningen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymer lokaliseret i det endoplasmatiske reticulum membran af mammale celler (mikrosomale P450 systemer) er medlemmer af multienzyme monooxygenase system, hvilket yderligere indeholder NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytokrom b5 , substrat enzymet betegnes som NADH: cytokrom b5 reduktase. En generelt accepteret teori hypothesizes, at donor af to elektroner til P450 er NADPH/POR system. Ikke desto mindre kan cytokrom b5 også fungere som en donor af elektroner for P450, nemlig som en donor af elektron reduktion P450 under anden reduktion af sin reaktion cyklus, hvor det fungerer sammen med NADH: cytokrom b5 reduktase2,3,4.

Pattedyr udnytte forskellige P450 enzymer (f.eks. enzymer familier 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 og 27) til syntese af værdifulde endogene stoffer, såsom steroider, og bruge dem til katabolisme af naturprodukter2,3 . De andre CYP pattedyr enzymer, såsom menneskelige CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2D 6 og 3A4, nedbryde eksogene kemikalier, der anvendes som lægemidler. 5 , 6 de mest vigtige enzymer katalysere metabolisme af narkotika er CYPs af 3A underfamilie, især CYP3A4. Konverteringer af fremmedstoffer, som pro-kræftfremkaldende og pro-giftstoffer, er medieret af menneskelig CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 og 3A42,5. De fleste af disse CYPs findes i leveren (undtagen CYP1A1 og 1B1). Ikke desto mindre, CYPs er også udtrykt i flere ekstrahepatisk organer. Sådanne P450s kunne være af stor betydning, overvejende når deltager de i bioactivation metabolisme af kemikalier (narkotika) til reaktiv mellemprodukter i disse organer7. Forskellige P450s er fremkaldt af flere forbindelser, der er deres substrater, selv om dette ikke nødvendigvis er tilfældet.

Mange P450 enzymer spiller en rolle i kemiske (narkotika) toksicitet. De kan konvertere fremmedstoffer ikke kun i deres metabolitter, afgiftning, men også aktivere dem reaktive arter, som ændrer endogene makromolekyler, der desuden udstiller forskellige biologiske egenskaber, normalt forårsager deres toksicitet. DNA, lipider og proteiner kan være mål for deres ændring af reaktive electrophiles og radikaler genereret fra aktiveret kemikalier. I tilfælde af DNA, løse flere vigtige gen svar og deres mekanismer er allerede kendt2,3,4,5.

Ændringer i DNA kan resultere i en nedgang i celle vækst kontrol, og dette fænomen er anset for at være den dominerende faktor, der fører til udvikling af kræftfremkaldende processer. Generation af kovalent DNA adukter med kemikalier med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste skridt i indledningen fase af kræftfremkaldende processer8,9,10,11. Det blev påvist, at relationer mellem dannelsen af DNA adukter og tumordannelse opstår, mens et fald i mængden af DNA adukter er ansvarlig for naturstoffers8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. dannelsen af kræftfremkaldende/stof-afledte DNA adukter afhænger af enkelte baser i DNA, og påvirkes af sekvenser af disse baser i DNA. Reparationer af DNA adukter er afhængig af deres placering (på den transskriberede eller ikke-transskriberede DNA streng) og typer af modificerede nukleotid-sekvenser8,11,12,15, 16.

I denne artikel vil vi beskrive procedurer udnytter de enzym-katalyserede konvertering af kemikalier (medicin) at undersøge deres potens skal aktiveres i metabolitter, som er modificeret DNA (generere DNA adukter). Kovalente DNA bindende, testforbindelsen bør normalt være aktiveret enten af oxidative eller reduktiv reaktioner, afhængigt af individuelle narkotika. Oxidative eller reduktiv aktivering af testede kemikalier er medieret af et P450-afhængige enzymatisk system i de mikrosomale subcellulært brøkdel eller ved reduktion med reductases findes både i microsomes (POR, NADH: cytokrom b5 reduktase, P450 enzymer) og i cellulære cytosole subcellulært fraktioner (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reaktive metabolitters derefter binde til DNA danner DNA adukter. Fordi både oxidative og reduktiv reaktioner er vigtigt at aktivere flere lægemidler til disse reaktive arter, er de eksperimentelle procedurer beskæftiger oxidation/reduktion af enzymatiske systemet beskrevet. Ydermere, egnede metoder i stand til at påvise og kvantificere disse DNA adukter er beskrevet i detaljer.

To uafhængige procedurer til at bestemme, om teststoffet, aktiveres ved enzymatisk systemer, er bundet til DNA anbefales: 32P-postlabeling teknik og udnytte radioaktivt mærket stof (fx., 3H eller 14 C). For først anbefales pilot, screening 32P-postlabeling assay. Fastlæggelsen af DNA-indhold i løsninger, netop evalueret, skal gå forud for begge metoder.

32P-postlabeling teknikken udnytter enzymatisk hydrolyse af DNA modificeret af ikke-radioaktive kemikalier (kræftfremkaldende/narkotika) til 3´-phosphodeoxynucleosides, ekstra fosforylering med radioaktivt fosfor (32P) på 5´- ÅH adukter holdning og adskillelse af kemikalie-deoxynucleotide fra normal (uændrede) deoxynucleotides ved kromatografi17 (figur 1). DNA modificeret ved kemisk forbindelse er hydrolyseret af en blanding af endonuklease, micrococcal nukleasen og exonuclease, kendt som milt phosphodiesterase. Blandingen af hydrolyseret DNA indeholdende både almindelig (uændrede) og ændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates er reagerede med [γ –32P] ATP i overværelse af carrier (ikke-radioaktive) ATP og T4-polynucleotide kinase ved pH 9.5 til form 5´- 32P-mærket 3´, 5´-bisphosphates (“standard” procedure i figur 1). Den anvendte basisk pH er i stand til at minimere enzymaktiviteten i T4-polynucleotide kinase til dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på position 3´. Adskillelse og opløsning på 32P-mærket adukter fra mærket deoxynucleotides, ikke som ændres af kemikalier er udført af flerstrenget anion-exchange tyndtlagskromatografi (TLC) på polyethyleneimine (PEI) cellulose (figur 2 ). I de første og anden eluering trin (i D1 og D2 retning), er mærket normal (uændrede) deoxynucleotides samt [32P] phosphat elueret fra starten af TLC-PEI-cellulose pladen ved hjælp af vand løsninger af elektrolyt på en kort stykke af kromatografiske papir anvendes på toppen af TLC-pladen, der henviser til, at de deoxynucleotides, der indeholder bundet kemikalier udstiller hydrofobe egenskaber (kræftfremkaldende/stof-adukter) vedligeholdes ved starten af PEI-cellulose plade skal desuden løses med flere forskellige opløsningsmiddel systemer i D3 og D4 retninger (figur 2). Lokalisering af adukter udføres ved hjælp af skærmen forbedret Autoradiografi; den adskilte adukter registreres som mørke genkendelige pletter på X-ray film. Områderne af steder er skåret ud fra pladen og bruges til at kvantificere radioaktivitet af flydende scintillation eller Cerenkov tælle. En storage phosphor billedbehandling metode, der er blevet tilpasset til at kortlægge og kvantificere DNA adukter på kromatogrammer opdaget af 32P-postlabeling assay er nu også bruges. 18 den Instant Imager maskine er ofte udnyttet til sådan påvisning og kvantificering af DNA adukter. Denne metode giver mere end 10 – gange højere følsomhed til at afsløre 32P end teknikken med skærmen forbedret Autoradiografi19.

Mængder af DNA adukter bestemmes som værdier af relativ addukt mærkning (RAL), beregnes ved hjælp af ligningen (2) som følger:

CPM. i addukt deoxynucleotides
RAL =—(2)
specifikke aktivitet af 32P-ATP (i cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

Værdierne af uindfriede forpligtelser er forholdet mellem tæller satser af adduceret deoxynucleotides over tæller satser for alt [adduceret og normal (uændrede) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Denne beregning er imidlertid baseret på lige mærkning virkningsgrader adukter og normal deoxynucleotides22. Klassisk (“standard”) proceduren for 32P-postlabeling teknik er passende for forskellige DNA adukter (pladskrævende og/eller ikke-pladskrævende adukter), men dets følsomhed er ikke tilfredsstillende at opdage adukter findes i små mængder i DNA. Brug denne procedure, kan mængden af en adduct i 107 uændrede deoxynucleotides i DNA (0,3 fmol adduct/µg DNA) påvises.

En række ændringer af denne klassiske 32P-postlabeling procedure har været udnyttet til at ophøje følsomheden af teknikken. Op til 10 til 100 gange højere følsomhed for bestemmelse af adukter af 32P-mærkning er opnået ved hjælp af begrænsende niveauer af [γ –32P] ATP (intensivering procedure). 23 , 24 en yderligere procedure giver en stigning i følsomheden af 32P-postlabeling metode udnytter en inkubation af fordøjet DNA indeholdende adukter med nukleasen P1 (fra Penicillium citrinum)21 (figur 1). Dette enzym foretrækker at dephosphorylate uændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, hvorimod deoxynucleotides med bundne kemikalier (adduceret nukleotider) er stort set ikke substrater af dette enzym. Derfor defosforyleret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) er ikke fosforyleret af T4-polynucleotide kinase af [32P] fosfat fra γ –32P] ATP. Men nogle af nukleotider hvor kemikalier er bundet (adduceret deoxynucleotides), som arylamine adukter substitueret på C8 af deoxyguanosine, kan bedephosphorylated af dette enzym. I modsætning hertil er de fleste andre adukter (fxadukter substitueret på N2 i deoxyguanosine) er ikke defosforyleret af nukleasen P1. Denne ændring af 32P-postlabeling gør denne metode betydeligt mere følsomme, øge sin følsomhed ved mere end tre størrelsesordener. Desuden, denne version af 32P-postlabeling giver en metode hvor højere mængder DNA (5-10 µg) og et overskud af carrier-fri [γ – 32P] ATP kan blive udnyttet.

En anden metode til at berige den adukter, beskrevet af Gupta25, udnytter de fysisk-kemiske egenskaber af pladskrævende deoxynucleotide adukter, der kan udtrækkes til n-butanol i overværelse af en fase transfer agent tetrabutylammonium chlorid (TBA) (figur 1) før [32P] phosphat mærkning, hvorimod umodificeret deoxynucleotides er dårligt udvundet af denne organisk opløsningsmiddel. Men mindre hydrofobe adukter, består for eksempel på deoxynucleotides modificerede med ikke-aromatiske pladskrævende fraspaltning eller små alkyl restkoncentrationer, er ikke effektivt ekstraheret med n-butanol. De er derfor hovedsagelig målbart når analyseres af denne ændring af 32P-postlabeling metode.

Begge de tidligere nævnte versioner af 32P-postlabeling øget følsomhed og kvantificering af DNA adukter enormt (op til tre størrelsesordener), at være i stand til at opdage en addukt pr. 109,10 normale nukleotider (0,3 – 3 Jørgen/µg DNA). Disse to metoder er anbefalet til testning kemikalier til deres effektivitet kovalent binding til DNA, og derfor, de er beskrevet i dette værk i detaljer.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (311/1997, Ministeriet for landbrug, Tjekkiet), som er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. 1. isolering af hepatisk mikrosomale og cytosole fraktioner Forberede lever subcellulært fraktioner (microsomes rig på P450 enzymer eller cytosols rige i reductases eller opløselige peroxidases) fra rotter ved simpel differential centrifugering (105.000 x g).Bemærk: Pe…

Representative Results

Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her for udnyttelsen af enzym-katalyserede aktivering (dvs, P450, peroxidase, reduktase) for at undersøge potens af kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) for at blive metaboliseret til mellemprodukter resulterer i deres kovalente binding til DNA (generation af DNA adukter), vi var i stand til at løse en roman mekanisme i den farmakologiske virkning af anticancer agent ellipticine (for en gennemgang under<sup class="xref"…

Discussion

I dette papir, er det påvist, bredt tilgængelige metoder til at studere styrken af kemikalier til at være bioactivated til metaboliske mellemprodukter, hvilket resulterer i generation af kovalent DNA adukter. Dette er et afgørende spørgsmål, fordi vurdering af styrken af miljømæssige kemikalier eller lægemidler af deres enzymatiske aktivering til metabolitter generere kovalente DNA adukter er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Ændring af DNA af kræftfremkaldende stoffer betragtes som ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af Czech Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image