JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по 32P-postlabeling

Published: March 20, 2018
doi:
10.3791/57177
1Department of Biochemistry,Charles University

Summary

Оценка потенции окружающей среды химических веществ и лекарств, чтобы быть энзиматического bioactivated для промежуточных генерации ковалентных ДНК аддукты, является важной области в развитии рака и его лечении. Описаны методы для активации соединения к форме, которую аддукты ДНК, а также методов их обнаружения и количественного определения.

Abstract

Ковалентный ДНК аддукты формируется химических веществ или препаратов с канцерогенными потенции оцениваются как один из наиболее важных факторов в этапе инициирования канцерогенных процессов. Теперь этот ковалентных привязки, который считается причиной tumorigenesis, оценивается как Центральная догма химического канцерогенеза. Здесь описаны методы использования реакции, катализируемой цитохрома Р450 и дополнительные биотрансформации ферменты расследовать потенции химических веществ или препаратов для их активации метаболитов, образуя эти ДНК аддукты. Процедуры представлены описания изоляции сотовой фракций, обладающие ферментов биотрансформации (микросомальной и цитозольной образцы с цитохромов P450 или других ферментов биотрансформации, т.е., пероксидазы, NADPH: цитохрома Р450 Оксидоредуктазы, NAD (P) H:quinone Оксидоредуктазы или ксантиноксидаза). Кроме того, описаны методы который может использоваться для активации метаболических анализируемого химических веществ в этих ферментов, а также для изоляции ДНК. Кроме того соответствующие методы обнаружения и количественного химического вещества/препарата производные ДНК аддукты, то есть, различные модификации метода P-postlabeling 32и занятости радиоактивных обозначенного анализа химических веществ, являются показано в деталях.

Introduction

Метаболизм ксенобиотиков (окружающей среды химических веществ или лекарств) происходит в два этапа1. Фазы I и II цель оказать более гидрофильные первоначально гидрофобные (не растворимые в воде) соединений (водорастворимые), таким образом делая их легко excretable через моча, фекалии или пота. Этап I (функционализация) реакции включают окисления, сокращение, и гидроксилирования катализируемых ферментами, например цитохрома P450s (P450s, CYPs), пероксидазы (т.е., циклооксигеназы, кокс), reductases (AKRs), Альдо Кето и микросомальной флавинсодержащих монооксигеназ (FMOs). Этап I также включает снижение реакции, при посредничестве различных reductases т.е. микросомальной NADPH: цитохрома P450 редуктаза (POR) и H:quinone Оксидоредуктазы цитозольной NAD (P) (NQO1), ксантиноксидаза (XO) и альдегид оксидазы (AO)1 . На втором этапе (спряжение), функциональные группы, которые были приложены в фазе я используются для конъюгата малых полярных молекул для дальнейшего увеличения полярности. Примеры ферментов, считается, что участие в реакции фазы II включают sulfotransferases (результаты), N, O– acetyltransferases (NAT), methyltransferases как катехол –О– метилтрансфераза (КОМТ), глутатион S– трансферазы (GSTs) и уридина дифосфат glucuronosyltransferases (UGTs)1. Ферментов в фазе I или II является классификация, однако, не жесткой, и некоторые ферменты вероятно могут быть сгруппированы в любой категории.

Р450 ферментов (EC 1.14.14.1) являются гема, содержащих белков, присутствующих в различных организмах, которые участвуют в биотрансформацию многих химических веществ, катализирующих преобразование3,4. Энзимы Р450 катализировать гидроксилирования многих субстратов, с реакцией, где один атом непосдедственно вводится в молекуле ксенобиотиков, в то время как второй атом кислорода уменьшается до формы воды по реакции, которая требует двух электронов [уравнение (1 3,)]4:

RH + O2 + НАДФН + H+ → Ро + H2O + NADP+ (1)

Энзимы Р450 локализуется в мембраны эндоплазматического ретикулума mammalian клеток (микросомальной системы P450) являются членами multienzyme монооксигеназ системы, которая также содержит NADPH: цитохрома P450 редуктаза (POR) и цитохром b5 , субстрат фермента называется как NADH: цитохромы b5 редуктазы. Общепринятые теории гипотез, что доноров двух электронов, необходимые для P450 является NADPH/POR системой. Тем не менее цитохромы b5 может также выступать в качестве донора электронов для P450, а именно в качестве донора электрона, уменьшение P450 во время второго сокращения цикла своей реакции, где он действует совместно с НАДН: цитохромы b5 редуктазы2,3,4.

Млекопитающие используют различные энзимы Р450 (например, энзимы семей 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 и 27) для синтеза ценных эндогенных соединений, такие как стероиды и использовать их для катаболизма натуральных продуктов2,3 . Другие ферменты CYP млекопитающих, таких как человека CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2D 6 и 3A4, метаболизму экзогенных химических веществ, которые используются как наркотики. 5 , 6 наиболее важных ферментов, катализирующих метаболизм препаратов являются CYPs 3A подсемейство, особенно CYP3A4. Преобразования ксенобиотиков, такие как канцерогены pro и pro токсикантов, являются опосредовано человека CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2Е1 и 3A42,5. Большинство из этих CYPs присутствуют в печени (за исключением CYP1A1 и 1B1). Тем не менее CYPs также выражаются в нескольких внепеченочных органах. Такая P450s может иметь большое значение, преимущественно когда участие они активация метаболизма химических веществ (лекарственные препараты) для реактивной интермедиатов в эти органы7. Различные P450s вызванных несколько соединений, которые являются их субстратов, хотя это не обязательно так.

Многие энзимы Р450 играют роль в токсичности химических (наркотиков). Они могут не только превратить их метаболитов детоксикации ксенобиотиков, но также активировать их для реактивных видов, которые изменить эндогенные макромолекул, которые дополнительно демонстрируют различные биологические свойства, как правило, вызывает их токсичности. ДНК, липидов и белков может быть цели для их модификации реактивного электрофилами и радикалы, образующиеся при активации химических веществ. В случае ДНК урегулировании нескольких ответов важно генов и их механизмы уже известны2,3,4,5.

Изменения в ДНК может привести к снижению роста ячейки, и считается, что это явление является преобладающим фактором, ведущим к разработке канцерогенных процессов. Поколения ковалентных ДНК аддуктов с химическими веществами, имеющие канцерогенных потенции оценивается как один из наиболее важных шагов в фазе начала канцерогенных процессов8,9,10,11. Было продемонстрировано, что отношения между формирования ДНК аддукты и tumorigenesis происходят, в то время как уменьшение количества ДНК аддукты отвечает за химиопрофилактики8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. образование канцерогенов, наркотиков полученных ДНК аддукты зависит от индивидуальных оснований ДНК и зависит от последовательности этих оснований в ДНК. Ремонт ДНК аддукты зависит от их расположения (на strand ДНК транскрибируется или не транскрибируется) и виды модифицированных нуклеотидных последовательностей8,11,12,15, 16.

В этой статье, мы описываем процедуры с использованием ферментов катализированное преобразования химических веществ (лекарственные препараты), расследовать их потенции активироваться в метаболиты, которые изменены ДНК (генерации ДНК аддукты). Для ковалентной ДНК привязки, тест соединения обычно должен быть активирован либо окислительная или восстановительной реакции, в зависимости от отдельных препаратов. Окислительная или восстановительной активация испытания химических веществ при посредничестве P450-зависимых ферментативные системы, присутствующих в микросомальной фракции субцеллюлярные или путем сокращения с reductases представить как в микросом (POR, НАДН: цитохромы b5 редуктазы, энзимы Р450) и в сотовой цитозольной субцеллюлярные фракций (NQO1, глутатионпероксидазы, XO, AO). Реактивных метаболитов затем связываются с ДНК ДНК формируя аддукты. Потому что реакций окислительного и восстановительной важны для того активировать несколько препаратов к этим реактивного видов, экспериментальной процедуры, используя окисления/снижение ферментативной системы описаны. Кроме того, соответствующие методы, способные обнаружения и количественного определения этих ДНК аддукты подробно описаны.

Два независимых процедур для определения ли испытания химического, активации ферментных систем, привязан к ДНК, рекомендуется: 32P-postlabeling техники и использования радиоактивных меченых соединений (например., 3Ч или 14 C). Для первого пилота, скрининг 32P-postlabeling assay рекомендуется. Определение содержания ДНК в растворах, точно оценены, должны предшествовать обоих методов.

32P-postlabeling техника использует ферментативного гидролиза ДНК, изменена нерадиоактивные химических веществ (канцерогенов/наркотиков) 3´-phosphodeoxynucleosides, дополнительные фосфорилирование с радиоактивного фосфора (32P) на 5´- OH позиции и разделение химико deoxynucleotide аддукты от нормальных (неизмененным) deoxynucleotides хроматографии17 (рис. 1). ДНК, изменена химический состав гидролизованный смесью эндонуклеазы, Микрококковая Нуклеаза и exonuclease, известный как селезенке фосфодиэстеразы. Смесь гидролизованный ДНК, содержащие оба нормальный (неизмененном) и изменения deoxyribonucleoside, который реагирует с [γ –32P] АТФ в присутствии перевозчика (нерадиоактивного) СПС и T4-полинуклеотид киназы при pH 9.5 в форме 5´- 3´-monophosphates 32P-меченых 3´, 5´-bisphosphates («стандарт» процедура на рис. 1). Используется щелочной рН способен минимизировать активность фермента протеинкиназы T4-полинуклеотид для dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates на позиции 3´. Разделение и резолюции 32P-меченых аддуктов с надписью deoxynucleotides, которые не изменены химическими веществами осуществляется разнонаправленный Анионообменная тонким слоем хроматографии (ТСХ) на полиэтиленимина (PEI) целлюлозы (Рисунок 2 ). В первой и второй элюции шаги (в направлении D1 и D2) помечены нормальной (неизмененным) deoxynucleotides, а также [32P] фосфат этого eluted от начала пластину TLC-ПЭЙ целлюлозы с использованием водных растворов электролитов на короткий кусок хроматографического бумага применяется на верхней пластине TLC, тогда как deoxynucleotides, содержащие связанные химических веществ, проявляющие гидрофобные свойства (канцероген/наркотиков аддукты) поддерживаются в начале Пей целлюлозные плиты дополнительно решить с несколько различных растворителей систем в D3 и D4 направлениях (рис. 2). Локализация аддукты осуществляется с помощью авторадиографии расширение экрана; раздельный аддукты определяются как темные пятна узнаваемым на рентгеновских пленок. Области пятен иссечена от плиты и используется для количественного определения радиоактивности ЖС или Cerenkov подсчета. Хранения люминофора, изображения метод, который был адаптирован к сопоставить и количественно определить ДНК аддукты на хроматограммы обнаружены 32P-postlabeling пробирного теперь также используется. 18 мгновенного Imager машина часто используются такие обнаружения и количественного определения ДНК аддукты. Этот метод обеспечивает более чем 10 – раз выше чувствительность обнаружения 32P, чем методика экрана Улучшено авторадиографии19.

Количество ДНК аддукты определяются как значения относительной аддукт маркировки (RAL), рассчитывается с помощью уравнения (2) следующим образом:

CPM. в аддукт deoxynucleotides
RAL =—(2)
Удельная активность 32P-АТФ (в cpm. / пмоль) x pmol deoxynucleotides

RALs значений соотношение количество ставок углубил deoxynucleotides над количество ставок общей [углубил и нормальной (неизмененным) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Однако, этот расчет основан на равных маркировки эффективности аддукты и нормальной deoxynucleotides22. Классическая процедура («стандарт») 32P-postlabeling техника подходит для различных ДНК аддукты (громоздкие и/или не громоздкие аддукты), ее чувствительность, однако, не является удовлетворительным для обнаружения аддукты в малых количествах в ДНК. С помощью этой процедуры, количество аддукт в 10 deoxynucleotides7 немодифицированные ДНК (0,3 фмоль adduct/мкг ДНК) является обнаруживаемой.

Повысить чувствительность метода были использованы различные модификации этой классической 32P-postlabeling процедура. До 10-100 раз выше чувствительность определения аддукты 32P-маркировки был достигнут с помощью предельных уровней [γ –32P] АТФ (усиление процедуры). 23 , 24 дальнейшая процедура условии, что увеличение чувствительности метода P-postlabeling 32использует инкубации переваривается ДНК-содержащие аддуктов с нуклеиназы P1 (от Penicillium обыкновенный)21 (рис. 1). Этот фермент предпочитает dephosphorylate неизмененном deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, тогда как deoxynucleotides с связанных химикатов (углубил нуклеотидов) являются по сути не субстратов этого фермента. Таким образом, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (например, диоксирибонуклеозиды) не phosphorylated, T4-полинуклеотид киназы, фосфат [32P] от γ –32P] СПС. Однако, некоторые из нуклеотидов, где химические вещества связаны (углубил deoxynucleotides), такие, как arylamine аддукты заменен на C8 deoxyguanosine, может bedephosphorylated этого фермента. В отличие от этого, большинство других аддукты (например, аддукты в N2 deoxyguanosine) не dephosphorylated от нуклеиназы P1. Эта модификация 32P-postlabeling делает этот метод значительно более чувствительны, повышение его чувствительности более чем трех порядков. Кроме того, эта версия 32P-postlabeling предоставляет метод, где выше количество ДНК (5-10 мкг) и избыток свободных перевозчика [γ – 32P] СПС могут быть использованы.

Другой метод, чтобы обогатить аддукты, описываемого Гупта25, использует физико-химических свойств громоздкие deoxynucleotide аддукты, которые могут быть извлечены в n-бутанол присутствии этап передачи агента tetrabutylammonium хлорид (TBA) (рис. 1) перед [32P] фосфат маркировки, тогда как неизмененное deoxynucleotides плохо извлекаемые этой органического растворителя. Однако, менее гидрофобные аддукты, состоящий на пример deoxynucleotides изменен с неароматических громоздкие постановление или небольших алкил остатков, не извлекаются эффективно с n-бутанол. Следовательно они являются по существу обнаружить, когда анализируются этой модификации 32P-postlabeling метод.

Как упоминалось ранее версии 32P-postlabeling увеличение чувствительности и количественного определения ДНК аддукты чрезвычайно (до трех порядков), будучи в состоянии обнаружить одно аддукт на нормальных 1010 9, нуклеотидов (0,3 – 3 amol в мкг ДНК). Эти два метода, рекомендуется для тестирования химических веществ для их эффективность ковалентно связываются с ДНК, и поэтому они описаны в этой работе в деталях.

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с положениями для ухода и использования лабораторных животных (311/1997, Министерство сельского хозяйства, Чешская Республика), которое в соответствии с Хельсинкской декларации. 1. изоляция печеночная микросомально?…

Representative Results

Использование протоколов, описанные здесь для использования активации фермента катализированное (т.е., P450, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы) расследовать потенции химических веществ (канцерогенов/препараты) для метаболизируется до промежуточных проду?…

Discussion

В этом документе доказано, что широко доступной методологии для изучения потенции химических веществ, чтобы быть bioactivated на метаболические промежуточных продуктов, что приводит к генерации ковалентных ДНК аддукты. Это очень важный вопрос, потому что оценки потенции окружающей среды хи…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано чешский научного фонда (GACR, Грант 17-12816S).

Materials

Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14 (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21 (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29 (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25 (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4 (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14 (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57 (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213 (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture – lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5 (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6 (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. . Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. , 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577 (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14 (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30 (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (10), 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13 (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts – biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3 (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7 (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12 (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6 (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231 (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45 (11 Pt 2), 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8 (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150 (1), 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814 (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21 (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17 (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658 (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73 (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12 (1), 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158 (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14 (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90 (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23 (11), 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63 (11), 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65 (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118 (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23 (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17 (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234 (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500 (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116 (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726 (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127 (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62 (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16 (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64 (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82 (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2 (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302 (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37 (Suppl 1), 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148 (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20 (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31 (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204 (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20 (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221 (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676 (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26 (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34 (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247 (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4 (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14 (77), 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378 (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35 (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23 (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207 (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27 (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2 (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334 (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Tags

Covalent DNA AdductsEnzymatic ActivationCarcinogensDrugs32P-postlabelingCytochrome P450BiotransformationCancer DevelopmentMolecular MechanismsDNA DamageToxification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image