Protokol for akut og kronisk Økotoksicitet afprøvning af turkis Killifish Nothobranchius furzeri
Summary
I dette arbejde beskriver vi en akut, kronisk og mindretalsspørgsmålet bioassay for at studere virkningerne af enkelt og kombinerede stressfaktorer på den turkise killifish Nothobranchius furzeri. Denne protokol er designet til at studere livshistorie træk (dødelighed, vækst, frugtbarhed, vægt) og kritiske termisk maksimum.
Abstract
Killifish Nothobranchius furzeri er en spirende model organisme med hensyn til økotoksikologi og dens anvendelighed i akut og kronisk Økotoksicitet test har påvist. Samlet set er følsomheden af arterne, giftige forbindelser i området med, eller er større end de andre arter, model.
Dette arbejde beskriver protokoller for akut, kronisk og mindretalsspørgsmålet bioassays for enkelt og kombinerede stressor effekter på N. furzeri. På grund af sin korte modning tid og liv-cyklus, denne hvirveldyr model giver mulighed for undersøgelse af slutpunkter som modning tid og frugtbarhed inden fire måneder. Transgenerationel fulde livscyklus eksponering forsøg kan udføres i så lidt som 8 måneder. Da denne art producerer æg, der er tørke-resistent og forbliver levedygtige i årevis, on-site kultur af arterne er ikke nødvendig men enkeltpersoner kan være ansat, når det kræves. Protokollerne er designet til foranstaltning livshistorie træk (dødelighed, vækst, frugtbarhed, vægt) og kritiske termisk maksimum.
Introduction
Følsomhed profiler af en bred vifte af arter for strategisk udvalgte giftige stoffer har været beskrevet1 for den europæiske nå lovgivning (registrering, evaluering, autorisation og begrænsning af kemikalier). Akut eller kortsigtet toksicitet var for det meste bruges til dette formål, da de giver en hurtig indikation af en art følsomhed. Men i deres naturlige miljø, organismer udsættes i meget længere perioder og fuld af levetiden eller endda flere generationer kunne være berørt2. Derudover er organismer i forurenede miljøer typisk udsat for mere end en stressor på et tidspunkt, der kan interagere med hinanden, hvilket kan resultere i synergivirkninger3. Derfor kan sikkert koncentrationer beregnes baseret på akut, enkelt stressor toksicitet undervurdere de faktiske risici pålagt af giftige stoffer i naturlige miljøer. Det er derfor tilrådeligt at også studere de kroniske og mindretalsspørgsmålet virkninger af subletale koncentrationer af giftige stoffer i en miljømæssigt relevante kontekst som anbefalet af Kommissionen4,5 og USEPA (Forenede States Environmental Protection Agency)6,7. Især i hvirveldyr forskning er omkostninger i form af arbejdskraft, penge og tid høj, når du udfører kronisk og mindretalsspørgsmålet eksponeringsundersøgelser på grund af den relativt lange levetid af hvirveldyr i forhold til hvirvelløse modelorganismer. Derfor er det tilrådeligt at vælge den mest hensigtsmæssige fisk model organisme, afhængigt af forskningsspørgsmål. Desuden bør en bred vifte af vertebrater være tilgængelig for at teste det generelle indhold af svar på tværs af arter at tilpasse regler baseret på de mest følsomme arter. For nu er der behov for at udvikle nye og effektive protokoller med hvirveldyr model arter karakteriseret ved korte livscyklus at sænke omkostningerne ved udførelsen af kronisk og mindretalsspørgsmålet engagementer på hvirveldyr7,8.
Den turkis killifish Nothobranchius furzeri er en interessant fisk model til brug i sådanne langsigtede eksponering eksperimenter på grund af sin korte modning tid og liv-cyklus (generation gang mindre end 4 uger9). Det betyder, at økologisk relevante slutpunkter som modning tid og frugtbarhed kan studeres inden for en kort tidsramme i forhold til andre fisk modeller7. Derudover producerer disse fisk tørke-resistent, hvilende æg, at forbliver levedygtige i flere år når gemt under standardbetingelser, hvilket eliminerer behovet for en kontinuerlig kultur9. Økotoksikologiske undersøgelser indebærer dette også at kopiere fisk kan alle blive udklækket på nøjagtig samme tidspunkt, hvilket resulterer i tid synchrony for alle dyr, selv blandt partier af æg, der produceres på forskellige tidspunkter. Vi rådgiver, ved hjælp af laboratoriet GRZ stamme til at udføre eksponering eksperimenter. Denne stamme udfører godt under laboratorieforhold, er homozygot (undtagen kønskromosomer) og genomet er godt præget10,11.
Økotoksikologiske undersøgelser er det vigtigt at vælge den passende række af test-koncentrationer. Flere komplementære metoder kan bruges til dette formål. Den nominelle koncentrationsområde kan baseres på følsomheden af en beslægtede arter såsom Nothobranchius guentheri12. Alternativt, området kan være baseret på følsomheden af standard fisk modeller, såsom zebrafisk (Danio rerio)2 , der har en tilsvarende følsomhed for de fleste giftige stoffer (Philippe et al. (i anmeldelse)). I kombination med begge disse muligheder, bør et udvalg at finde eksperiment gennemføres for at vælge rækken nominelle koncentration. I forbindelse med akutte test bør forskere sigte efter koncentration behandlinger med 100% dødelighed, mellemliggende dødelighed og 0% dødelighed efter 24 timers eksponering for giftstoffet. For kroniske test, er det tilrådeligt at køre rækkevidde at finde eksperiment i to uger til at kontrollere, hvis larve dødelighed i stand med den højeste test-koncentration ikke overstiger 10% i løbet af denne referenceperiode.
Protokollen kan tjene som udgangspunkt til at udføre akut og kronisk eksponering for vandbårne forurenende stoffer på N. furzeri, undersøge potentielle virkninger af stressfaktorer på individuelle og cellulære niveau. Det kan også bruges til at udføre flere stressor forskning til at rumme en højere økologiske relevans, blande forskellige giftige stoffer eller studerer interaktive effekter mellem forurening og andre naturlige stressorer (fx prædation) eller menneskeskabte stressorer (f.eks. opvarmning på grund af klimaændringer).
Protocol
Representative Results
Discussion
Værket beskriver en ny bioassay ved hjælp af Nothobranchius furzeri, en spirende model organisme, for at studere enkelte og kombineret langtidsvirkninger af giftige stoffer og andre stressfaktorer. De præsenterede protokoller blev anvendt med succes til at måle følsomhed af arter til en bred vifte af giftige stoffer (kobber, cadmium, 3,4-dichloranilin og chlorpyrifos). På grund af den hurtige livscyklus, denne hvirveldyr model giver mulighed for vurdering af subletale og transgenerationel virkninger inden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for gruppen KUGLENS af UAntwerpen og afdeling for Plantebeskyttelse i Ugent analyse af vandprøver. Under dette projekt blev leveret af Excellence Center ‘ Eco og socio-evolutionære dynamics (PF/10/007) af KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) og ESJT (CVE-SB151323) blev finansieret som ph.d.- og TP (12F0716N) som post-ph.d.-stipendiat ved CVE Flandern (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
