फ़िरोज़ा Killifish के तीव्र और जीर्ण Ecotoxicity परीक्षण के लिए प्रोटोकॉल Nothobranchius furzeri
Summary
इस काम में, हम एक तीव्र, जीर्ण और multigenerational के लिए फ़िरोज़ा killifish Nothobranchius furzeriपर एकल और संयुक्त तनाव के प्रभाव का अध्ययन परख का वर्णन । इस प्रोटोकॉल जीवन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है इतिहास लक्षण (मृत्यु दर, विकास, fecundity, वजन) और महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम ।
Abstract
killifish Nothobranchius furzeri ecotoxicology के क्षेत्र में एक उभरते मॉडल जीव और तीव्र और जीर्ण ecotoxicity परीक्षण में अपनी प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया गया है । कुल मिलाकर, विषाक्त यौगिकों के लिए प्रजातियों की संवेदनशीलता के साथ रेंज में है, या अधिक से अधिक है, कि अन्य मॉडल प्रजातियों की.
यह काम तीव्र, जीर्ण, और multigenerational के एकल और संयुक्त चाले प्रभाव के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है N. furzeriपर । अपनी छोटी परिपक्वता समय और जीवन चक्र के कारण, इस हड्डीवाला मॉडल चार महीने के भीतर परिपक्वता समय और fecundity जैसे समापन के अध्ययन की अनुमति देता है । Transgenerational पूर्ण जीवन चक्र जोखिम परीक्षणों में प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में छोटे रूप में 8 महीने । चूंकि इस प्रजाति के अंडे है कि सूखा प्रतिरोधी रहे है और साल के लिए व्यवहार्य रहने का उत्पादन, पर प्रजातियों की साइट संस्कृति की जरूरत नहीं है, लेकिन व्यक्तियों जब आवश्यक भर्ती किया जा सकता है । प्रोटोकॉल जीवन को मापने के लिए डिज़ाइन कर रहे है इतिहास लक्षण (मृत्यु दर, विकास, fecundity, वजन) और महत्वपूर्ण थर्मल अधिकतम ।
Introduction
सामरिक रूप से चयनित विषालु प्रजातियों की एक सरणी के संवेदनशीलता प्रोफाइल यूरोपीय पहुंच कानून के लिए1 बताया गया है (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण, और रसायनों के प्रतिबंध) । तीव्र या अल्पकालिक विषाक्तता परीक्षण ज्यादातर इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया के रूप में वे एक ‘ प्रजातियों की संवेदनशीलता का एक त्वरित संकेत दे । हालांकि, उनके प्राकृतिक वातावरण में, जीवों बहुत लंबी अवधि और पूर्ण जीवन चक्र या यहां तक कि कई पीढ़ियों को प्रभावित किया जा सकता है पर उजागर कर रहे हैं2. इसके अलावा, प्रदूषित वातावरण में जीवों को आम तौर पर एक समय में एक से अधिक तनाव के संपर्क में हैं, जो एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं, संभवतः synergistic प्रभाव3में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, सुरक्षित सांद्रता तीव्र, एकल तनाव विषाक्तता परीक्षणों के आधार पर गणना वास्तविक जोखिम प्राकृतिक वातावरण में विषालु द्वारा लगाया मूल्यवान समझना हो सकता है । इसलिए, यह भी एक पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक संदर्भ में विषालु के जीर्ण और multigenerational प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उचित है के रूप में यूरोपीय आयोग ने4,5 और यूएसईपीए (संयुक्त राज्यों पर्यावरण संरक्षण एजेंसी)6,7. विशेष रूप से हड्डीवाला अनुसंधान में, श्रम, धन के मामले में लागत, और समय उच्च रहे है जब invertebrate मॉडल जीवों की तुलना में रीढ़ की अपेक्षाकृत लंबी उंर की वजह से पुरानी और multigenerational जोखिम अध्ययन प्रदर्शन । इसलिए, यह सबसे उपयुक्त मछली मॉडल जीव का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है, अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है । इसके अलावा, हड्डीवाला प्रजातियों की एक विस्तृत सरणी के क्रम में सबसे अधिक संवेदनशील प्रजातियों के आधार पर नियमों को अनुकूल करने में सक्षम होने के लिए प्रजातियों में प्रतिक्रियाओं की सामान्यता का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध होना चाहिए । अभी के लिए, हड्डीवाला मॉडल प्रजातियों के साथ नए, कुशल प्रोटोकॉल विकसित करने की जरूरत है, लघु जीवन चक्र द्वारा विशेषता के लिए रीढ़7,8पर जीर्ण और multigenerational जोखिम प्रदर्शन की लागत कम है ।
फ़िरोज़ा killifish Nothobranchius furzeri एक दिलचस्प मछली के लिए अपनी छोटी परिपक्वता समय और जीवन चक्र की वजह से इस तरह के दीर्घकालिक जोखिम प्रयोगों में उपयोग करने के लिए मॉडल है (पीढ़ी कम समय से 4 सप्ताह9) । इसका मतलब यह है कि इस तरह की परिपक्वता समय और fecundity के रूप में पारिस्थितिकी प्रासंगिक समापन अंय मछली मॉडल7की तुलना में एक कम समय सीमा के भीतर अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, इन मछली सूखे का उत्पादन-प्रतिरोधी, निष्क्रिय अंडे है कि कई वर्षों के लिए व्यवहार्य रहते है जब मानक शर्तों के तहत संग्रहित है, जिससे एक सतत संस्कृति9की आवश्यकता को नष्ट करने । ecotoxicological अध्ययन में, यह भी संकेत मिलता है कि मछली दोहराने सभी सटीक एक ही पल में रचा जा सकता है, सभी जानवरों के लिए समय synchrony में जिसके परिणामस्वरूप, यहां तक कि विभिंन समय में उत्पादित अंडे के बैचों के बीच । हम जोखिम प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगशाला GRZ तनाव का उपयोग करने की सलाह. यह तनाव प्रयोगशाला शर्तों के तहत अच्छी तरह से करता है, homozygous है (सेक्स गुणसूत्रों को छोड़कर) और जीनोम अच्छी तरह से10,11विशेषता है ।
ecotoxicological अध्ययन में, यह परीक्षण सांद्रता के उपयुक्त सीमा का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । कई पूरक तरीकों इस अंत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नाममात्र एकाग्रता रेंज जैसे Nothobranchius guentheri12के रूप में एक संबंधित प्रजातियों, की संवेदनशीलता पर आधारित हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, सीमा मानक मछली मॉडल की संवेदनशीलता पर आधारित हो सकता है, जैसे zebrafish (ढाणियो rerio)2 कि सबसे विषालु (फिलिप एट अल करने के लिए एक तुलनीय संवेदनशीलता है । (समीक्षा में)). संयोजन में, इन विकल्पों में से दोनों के साथ, एक प्रयोग खोज रेंज नाममात्र एकाग्रता रेंज का चयन करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए । तीव्र परीक्षण के लिए, शोधकर्ताओं ने विषाक्तता के लिए जोखिम के 24 ज के बाद १००% मृत्यु दर, मध्यवर्ती मृत्यु दर और 0% मृत्यु दर के साथ एकाग्रता उपचार के लिए लक्ष्य होना चाहिए । जीर्ण परीक्षण के लिए, यह दो सप्ताह के लिए प्रयोग खोज रेंज चलाने के लिए सलाह दी जाती है यदि उच्चतम परीक्षण सांद्रता के साथ हालत में लार्वा मृत्यु इस संदर्भ अवधि के दौरान 10% से अधिक नहीं है ।
प्रोटोकॉल एक आधार रेखा के रूप में सेवा कर सकते है करने के लिए तीव्र और क्रोनिक प्रदर्शन करने के लिए एन furzeriपर जलजनित प्रदूषण, तनाव के संभावित प्रभाव की जांच दोनों व्यक्तिगत और सेलुलर स्तर पर । यह भी बहु तनावपूर्ण अनुसंधान प्रदर्शन के लिए एक उच्च पारिस्थितिक प्रासंगिकता को समायोजित किया जा सकता है, विभिंन विषाक्त यौगिकों मिश्रण या प्रदूषण और अंय प्राकृतिक तनाव के बीच इंटरैक्टिव प्रभाव का अध्ययन (उदा predation) या anthropogenic तनाव (जैसे जलवायु परिवर्तन के कारण वार्मिंग) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम एक नया Nothobranchius furzeri, एक उभरते मॉडल जीव का उपयोग कर परख का वर्णन, व्यक्ति और संयुक्त विषालु और अंय तनाव के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन । प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विषालु (तांबा, कैडमियम, 3, 4-dichloroan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम UAntwerpen के क्षेत्र समूह और पानी के नमूनों के विश्लेषण के लिए Ugent के फसल संरक्षण विभाग के लिए आभारी हैं । इस परियोजना के दौरान सहायता, केयू Leuven रिसर्च फंड के उत्कृष्टता केंद्र ‘ इको और सामाजिक-विकासवादी गतिशीलता (पीएफ/10/007) द्वारा प्रदान की गई थी । AFG (11Q0516N) और ESJT (FWO-SB151323) डॉक्टरेट और टी. पी. (12F0716N) के रूप में पोस्ट डॉक्टरेट फेलो द्वारा FWO Flanders (शौकीनों Wetenschappelijk Onderzoek) के रूप में वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).
