急性および慢性毒性試験ターコイズ メダカによる furzeriのためのプロトコル
Summary
この作業による furzeriのターコイズのヒメダカにおよぼす単一および複合ストレスの効果を研究する、急性、慢性、多世代生物検定法について述べる.このプロトコルは、(死亡率、成長、産卵数、重量) の生活史形質と臨界温度最大研究するため設計されています。
Abstract
生態毒性の分野で新たなモデル生物であるメダカによる furzeriと急性および慢性毒性試験の適用性を実証されています。全体的にみて、有毒化合物種の感度は、または、モデルの他の種のそれより高い範囲内。
この作品では、シングル、複合ストレスに及ぼす影響(名) furzeriの急性、慢性、多世代の生物検定のプロトコルについて説明します。その短い成熟の時間とライフ サイクルのためこの脊椎動物モデルは 4 ヶ月以内成熟時間や多産などのエンドポイントの研究をことができます。継代完全なライフ サイクル暴露試験は、わずか 8 ヶ月で実行できます。この種は干ばつ耐性がある卵を作り出す年間実行可能に残るので、種の敷地内の文化は必要ありませんが、必要な場合に個人を募ることができます。プロトコルは、メジャー生活史特性 (死亡率、成長、産卵数、重量) と重要な熱の最大しています。
Introduction
戦略的に選択した毒性の種の配列の感度分布は、欧州 REACH 法案 (登録、評価、承認、および化学物質の制限) に記載されている1をされています。急性または短期毒性試験はこの目的のため彼らは種の感度の簡単な目安として大抵使用されました。しかし、彼らの自然環境における生物は、はるかに長い期間にわたってさらされている、完全ライフ サイクルまたはさらにいくつかの世代がある影響を受ける2。また、汚染された環境で生物は通常なり相乗効果3時に、互いに相互作用があります、これで 1 つ以上のストレッサーに公開されます。したがって、安全な濃度計算に基づく、急性ストレッサー毒性試験が自然環境の毒性によって課された実際のリスクを過小評価します。それは、したがって、また欧州委員会4、5と米国環境保護庁 (米国によって提唱される環境に関連するコンテキストでは有効成分の致死濃度の慢性的な多世代の効果を勉強することをお勧め合衆国環境保護庁)6,7。脊椎動物の研究を中心に、脊椎動物無脊椎動物モデルと比較して比較的長い寿命のため慢性的な多世代の露出研究を実行するとき、労力、お金と時間の面でコストが高い。したがって、研究の質問に応じて、最も適切な魚モデル生物を選択することをお勧めします。さらに、幅広い脊椎動物に最も敏感な種に基づく規制を適応できる種にわたって応答の一般性をテストするために使用できます。今のところ、新しい、脊椎動物7,8の慢性および多世代のエクスポー ジャーを実行するコストを削減する短いライフ サイクルによって特徴付けられる脊椎動物のモデル種で効率的なプロトコルを開発する必要があります。
による furzeriの青緑色のメダカは、その短い成熟の時間とライフ サイクル (生成時間 4 週間9未満) のためこのような長期の屋外暴露実験で使用する興味深い魚モデルです。これは、成熟時間や多産など生態学上関連するエンドポイントが他魚モデル7と比較して短い時間枠の内で学ぶことができますを意味します。さらに、これらの魚は、連続培養9の機能は不要、標準的な条件下で保存されているとき、数年間実行可能に残る干ばつ耐性、休眠卵を産みます。生態毒物学的研究、これもレプリケートする魚すべてハッチングできます同じ瞬間に異なる時間に生成される卵のバッチの中でさえ、すべての動物の時間同期の結果を意味します。暴露実験を行う研究所見る: GRZ ひずみを使用してお勧めします。この緊張は実験室の条件の下でよく行う、ホモ (性染色体) を除いて、ゲノムはよく特徴付けられて10,11。
生態毒性試験、試験濃度の適切な範囲を選択することが重要です。いくつかの相補的な方法は、この目的のために使用できます。公称濃度範囲は、生き餌による12などの近縁種の感受性に基づいて設定できます。ほとんど毒性 (フィリップらに匹敵する感度を持つゼブラフィッシュ (動脈分布)2などの標準的な魚モデルの感度の範囲をベースことができますまた、[レビュー))。これらのオプションの両方との組み合わせでわずかな集中の範囲を選択する範囲の実験を見つけることを実施しなければなりません。急性テスト、研究者目指すべき濃度処理率は 100%、中間の死亡率 0% の死亡率と、毒性物質への暴露の 24 時間後。慢性的なテストでは、範囲の最高の試験濃度条件で幼虫の死亡率がこの期間中に 10% を超えないかどうかことを確認する 2 週間の実験を見つけることを実行することをお勧めします。
プロトコルは、個々 および細胞レベルでみられるストレスに関する潜在的な影響を調べる、 N. furzeri、上の水系汚染物質への急性および慢性暴露のベースラインとして使用できます。さまざまな有毒な化合物を混合または汚染とその他の自然のストレス (例えば捕食) と対話型効果を勉強して高い生態学的関連に対応するマルチ ストレス研究を実行するも使用できますまたは人為的ストレス (例えば気候変動による地球温暖化)。
Protocol
Representative Results
Discussion
この仕事個人を研究する新しいバイオアッセイによる furzeri、新興のモデル生物と有害物質と他のストレス要因の長期効果を組み合わせます。示されたプロトコル (銅、カドミウム、3, 4-dichloroaniline、クロルピリホス) は有害物質の配列に種の感度計測に適用されました。その高速のライフ サイクルによりこの脊椎動物モデルにより致死の評価と継代が 4 ヶ月以内に効果します。毒性ス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
水試料の分析のため、UAntwerpen と、どうすればの作物保護の部門の球グループに感謝しております。このプロジェクトの期間中、サポートはエクセレンス センターによって提供された ‘ エコ社会進化系区ルーヴェン研究基金 (PF/10/007)。AFG (11Q0516N) と ESJT (FWO SB151323) 資金が供給された、博士と FWO フランダース (フォン Wetenschappelijk Onderzoek) で博士研究員として TP (12F0716N)。
Materials
| purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
| Sea Salt | Instant Ocean | ||
| 2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| 0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
| Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
| chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
| tricaine | Sigma aldrich | ||
| petri dishes | VWR | ||
| Parafilm | VWR | ||
| pipettes | MLS | ||
| tweezers | FST | ||
| 500 µm mesh sieve | / | self-made | |
| microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
| glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
| weighing boat | MLS | ||
| Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
| water bath | Gilac | for Ctmax | |
| liquid nitrogen | Air liquide | ||
| digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
| HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
| calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
| camera | / | ||
| platform for camera | / | self-made | |
| Multiparameter kit | HACH | ||
| Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fysio | |||
| homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
| chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
| glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
| amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
| glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
| Biorad protein dye | VWR | ||
| 96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
| 384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
| 2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
| 2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
| homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
| photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
| heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
| centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
| Incubator | Bumako |
References
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