Summary

急性および慢性毒性試験ターコイズ メダカによる furzeriのためのプロトコル

Published: April 24, 2018
doi:

Summary

この作業による furzeriのターコイズのヒメダカにおよぼす単一および複合ストレスの効果を研究する、急性、慢性、多世代生物検定法について述べる.このプロトコルは、(死亡率、成長、産卵数、重量) の生活史形質と臨界温度最大研究するため設計されています。

Abstract

生態毒性の分野で新たなモデル生物であるメダカによる furzeriと急性および慢性毒性試験の適用性を実証されています。全体的にみて、有毒化合物種の感度は、または、モデルの他の種のそれより高い範囲内。

この作品では、シングル、複合ストレスに及ぼす影響(名) furzeriの急性、慢性、多世代の生物検定のプロトコルについて説明します。その短い成熟の時間とライフ サイクルのためこの脊椎動物モデルは 4 ヶ月以内成熟時間や多産などのエンドポイントの研究をことができます。継代完全なライフ サイクル暴露試験は、わずか 8 ヶ月で実行できます。この種は干ばつ耐性がある卵を作り出す年間実行可能に残るので、種の敷地内の文化は必要ありませんが、必要な場合に個人を募ることができます。プロトコルは、メジャー生活史特性 (死亡率、成長、産卵数、重量) と重要な熱の最大しています。

Introduction

戦略的に選択した毒性の種の配列の感度分布は、欧州 REACH 法案 (登録、評価、承認、および化学物質の制限) に記載されている1をされています。急性または短期毒性試験はこの目的のため彼らは種の感度の簡単な目安として大抵使用されました。しかし、彼らの自然環境における生物は、はるかに長い期間にわたってさらされている、完全ライフ サイクルまたはさらにいくつかの世代がある影響を受ける2。また、汚染された環境で生物は通常なり相乗効果3時に、互いに相互作用があります、これで 1 つ以上のストレッサーに公開されます。したがって、安全な濃度計算に基づく、急性ストレッサー毒性試験が自然環境の毒性によって課された実際のリスクを過小評価します。それは、したがって、また欧州委員会45と米国環境保護庁 (米国によって提唱される環境に関連するコンテキストでは有効成分の致死濃度の慢性的な多世代の効果を勉強することをお勧め合衆国環境保護庁)6,7。脊椎動物の研究を中心に、脊椎動物無脊椎動物モデルと比較して比較的長い寿命のため慢性的な多世代の露出研究を実行するとき、労力、お金と時間の面でコストが高い。したがって、研究の質問に応じて、最も適切な魚モデル生物を選択することをお勧めします。さらに、幅広い脊椎動物に最も敏感な種に基づく規制を適応できる種にわたって応答の一般性をテストするために使用できます。今のところ、新しい、脊椎動物7,8の慢性および多世代のエクスポー ジャーを実行するコストを削減する短いライフ サイクルによって特徴付けられる脊椎動物のモデル種で効率的なプロトコルを開発する必要があります。

による furzeriの青緑色のメダカは、その短い成熟の時間とライフ サイクル (生成時間 4 週間9未満) のためこのような長期の屋外暴露実験で使用する興味深い魚モデルです。これは、成熟時間や多産など生態学上関連するエンドポイントが他魚モデル7と比較して短い時間枠の内で学ぶことができますを意味します。さらに、これらの魚は、連続培養9の機能は不要、標準的な条件下で保存されているとき、数年間実行可能に残る干ばつ耐性、休眠卵を産みます。生態毒物学的研究、これもレプリケートする魚すべてハッチングできます同じ瞬間に異なる時間に生成される卵のバッチの中でさえ、すべての動物の時間同期の結果を意味します。暴露実験を行う研究所見る: GRZ ひずみを使用してお勧めします。この緊張は実験室の条件の下でよく行う、ホモ (性染色体) を除いて、ゲノムはよく特徴付けられて10,11

生態毒性試験、試験濃度の適切な範囲を選択することが重要です。いくつかの相補的な方法は、この目的のために使用できます。公称濃度範囲は、生き餌による12などの近縁種の感受性に基づいて設定できます。ほとんど毒性 (フィリップに匹敵する感度を持つゼブラフィッシュ (動脈分布)2などの標準的な魚モデルの感度の範囲をベースことができますまた、[レビュー))。これらのオプションの両方との組み合わせでわずかな集中の範囲を選択する範囲の実験を見つけることを実施しなければなりません。急性テスト、研究者目指すべき濃度処理率は 100%、中間の死亡率 0% の死亡率と、毒性物質への暴露の 24 時間後。慢性的なテストでは、範囲の最高の試験濃度条件で幼虫の死亡率がこの期間中に 10% を超えないかどうかことを確認する 2 週間の実験を見つけることを実行することをお勧めします。

プロトコルは、個々 および細胞レベルでみられるストレスに関する潜在的な影響を調べる、 N. furzeri、上の水系汚染物質への急性および慢性暴露のベースラインとして使用できます。さまざまな有毒な化合物を混合または汚染とその他の自然のストレス (例えば捕食) と対話型効果を勉強して高い生態学的関連に対応するマルチ ストレス研究を実行するも使用できますまたは人為的ストレス (例えば気候変動による地球温暖化)。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、カトリック ・ ルーヴェン大学の倫理委員会によって承認されています。 1. 孵化と名 furzeriの一般的なメンテナンス 準備魚の 14 ° C の温度で媒体 (pH 7) と 600 μ S/cm (24 の ° C) の伝導度に追加された標準化された塩の精製タイプ II 水を追加。 標準化された条件13の下に格納されている見る: GRZ (ゴ…

Representative Results

2.5.2 のように銅の濃度; furzeriの急性曝露の結果が計算される、cleardose 応答の関係 (図 1) を表示します。毒性物質の濃度を増加させると死亡率の増加があります。LC50値は時間をかけて減少し濃度を減少させるとより多くの時間がレプリケート死ぬの 50% の前に通過するを意味します。N. furzeri他の種と比較して種の感受性の比…

Discussion

この仕事個人を研究する新しいバイオアッセイによる furzeri、新興のモデル生物と有害物質と他のストレス要因の長期効果を組み合わせます。示されたプロトコル (銅、カドミウム、3, 4-dichloroaniline、クロルピリホス) は有害物質の配列に種の感度計測に適用されました。その高速のライフ サイクルによりこの脊椎動物モデルにより致死の評価と継代が 4 ヶ月以内に効果します。毒性ス?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

水試料の分析のため、UAntwerpen と、どうすればの作物保護の部門の球グループに感謝しております。このプロジェクトの期間中、サポートはエクセレンス センターによって提供された ‘ エコ社会進化系区ルーヴェン研究基金 (PF/10/007)。AFG (11Q0516N) と ESJT (FWO SB151323) 資金が供給された、博士と FWO フランダース (フォン Wetenschappelijk Onderzoek) で博士研究員として TP (12F0716N)。

Materials

purified water Type 1 (milli Q) Millipore
Sea Salt Instant Ocean
2L plastic tank SAVIC Always separate material for control and toxicity treatments
1L plastic tank (spawning) Avamoplast Always separate material for control and toxicity treatments
nets Aqua bilzen Always separate material for control and toxicity treatments
2L glass jars Sepac-Flacover Always separate material for control and toxicity treatments
0,5L glass jars Sepac-Flacover Always separate material for control and toxicity treatments
Artemia eggs Ocean Nutrition
chironomus Ocean Nutrition frozen
tricaine Sigma aldrich
petri dishes VWR
Parafilm VWR
pipettes MLS
tweezers FST
500 µm mesh sieve / self-made
microcentrifuge tube (2ml) BRAND To store fish in freezer
glass vials Sigma aldrich For water analysis
weighing boat MLS
Jiffy 7c pellets Jiffy
water bath Gilac for Ctmax
liquid nitrogen Air liquide
digital thermometer Testo AG testo 926
HETO therm heater Anker Schmitt
calibrated balance Mettler-Toledo AG
camera /
platform for camera / self-made
Multiparameter kit HACH
Freezer (-80°C) Panasonic Ultra low temperature freezer
Name Company Catalog Number Comments
Fysio
homogenisation buffer VWR 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100
chloroform:methanol Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitate Sigma Aldrich
amyloglucosidase Sigma Aldrich A7420
glucose assay reagent Sigma Aldrich G3293
Biorad protein dye VWR
96-well microtiter plate Greiner Bio-one
384 microtiter plates Greiner Bio-one
2 ml glass tubes Fiers For fat analysis
2,5ml eppendorf tubes VWR
homogeniser Ultra-turrax TP 18/10
photospectrometer Infinite M200 TECAN
heater for glass tubes Hach COD REACTOR
centrifuge Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator Bumako

References

  1. European-Chemicals-Bureau. . TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
  2. Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
  3. Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
  4. Consommateurs, S. S. d. . Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, (2002).
  5. Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
  6. . Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996)
  7. Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
  8. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  9. Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
  10. Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
  11. Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
  12. Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
  13. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  14. Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
  15. Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
  16. Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
  17. Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
  18. Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Philippe, C., Gregoir, A. F., Thoré, E. S. J., De Boeck, G., Brendonck, L., Pinceel, T. Protocol for Acute and Chronic Ecotoxicity Testing of the Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri. J. Vis. Exp. (134), e57308, doi:10.3791/57308 (2018).

View Video