Summary

Bile Salt-inducerad Biofilm bildning i enteriska patogener: tekniker för identifiering och kvantifiering

Published: May 06, 2018
doi:

Summary

Detta protokoll gör det möjligt för läsaren att analysera galla salt-inducerad biofilm bildning i enteriska patogener använder en mångfacetterad strategi för att fånga den dynamiska karaktären av bakteriell biofilm genom att bedöma följsamhet, extracellulära polymera substansen matrisen bildande, och spridning.

Abstract

Biofilm bildning är en dynamisk, flerstegs process som sker i bakterier under svåra miljöförhållanden eller tider av stress. För enteriska patogener induceras en betydande stress svar under gastrointestinal transit och vid galla exponering, en normal del av mänskliga matsmältningen. För att övervinna de bakteriedödande effekten av galla, bildar många enteriska patogener en biofilm som hypotes för att tillåta överlevnad när transiteras genom tunntarmen. Här presenterar vi metoder för att definiera biofilm bildning genom fasta fasen följsamhet analyser samt extracellulära polymera ämne (EPS) matrix upptäckt och visualisering. Dessutom presenteras biofilm dispersion bedömning för att efterlikna analys av händelser som utlöser frisättning av bakterier under infektionsprocessen. Kristallviolett färgning används för att upptäcka vidhäftande bakterier i en hög genomströmning plattan med 96 brunnar följsamhet-analys. EPS-produktion bedömning bestäms av två analyser, nämligen mikroskopi färgning av EPS-matrisen och semikvantitativ analys med en fluorescently-konjugerad polysackarid bindning lectin. Slutligen, biofilm dispersion mäts genom kolonin räknas och plätering. Positiva data från flera analyser stöder karakterisering av biofilmer och kan användas för att identifiera galla salt-inducerad biofilm bildning i andra bakteriestammar.

Introduction

Biofilm bildning är ett viktigt bakteriell överlevnadsstrategi inducerad under svåra miljöförhållanden. Exponering för bakteriedödande föreningar som antibiotika eller förändringar i näringsämne eller syre tillgänglighet inducerar ett stressat tillstånd i bakterier som kan lindras genom biofilm bildning. En biofilm kännetecknas av bakteriell fäste på en yta eller andra bakterier och åtföljs av utsöndringen av en EPS matris huvudsakligen består av polysackarider1,2,3. Biofilm bildning är en dynamisk process där en kaskad av händelser kulminerar i bildandet av en mogen vidhäftande bakteriell gemenskapen1,2,3. Bakterier producerar adhesiner för att underlätta tidig fastsättning medan skiftande adhesin gen uttryck profiler för att stärka fastsättning under biofilm mognad. Samtidigt uppstår EPS produktion till pälsen en matris bakteriell gemenskapen att skydda celler från den inledande stressfaktor. Bakterier som finns i biofilmen är långsamt växande; och som sådan gör de flesta antibiotika ineffektiva. Dessutom sparar den långsamma tillväxten energi tills förutsättningarna förändras för att gynna bakterietillväxt1,2,3. Efter de hårda villkoren har passerat, bakterier skingra biofilmen och återuppta en plankton livsstil1,2,3. Traditionellt biofilmer observeras på ytor och representerar en ihållande kliniska utmaning på grund av infektion reservoarer på katetrar och i-bostad enheter1,2,3.

Biofilm bildning beskrevs nyligen för flera enteriska patogener. bakterier som infekterar tunntarmen eller tjocktarmen4. För Shigella arterna, uppstår infektion i människors kolon efter en transitering genom majoriteten av mag-tarmkanalen. Under passagen genom tunntarmen, är Shigella utsatt för galla; ett lipid-förnedrande rengöringsmedel som utsöndras till tarmen att underlätta matsmältningen av lipider medan samtidigt dödar de flesta bakterier5. Enteriska patogener har en unik förmåga att motstå de bakteriedödande effekten av galla6. Vår senaste analys utnyttjas i vivo-gillar kombinationer av glukos och gallsalter att demonstrera robusta biofilm bildning i S. flexneri samt andra arter av Shigella, patogena Escherichia colioch Salmonella4. Tidigare, Salmonella enterica serovar Typhi visades att bilda en galla-inducerad biofilm på grund av unika koloniseringen av gallblåsan under kronisk infektion7,8,9, 10. Dessutom tidigare forskning med Vibrio11och Campylobacter12 visat biofilm bildning svar på galla. Därför analyser extended galla-inducerad biofilm bildning observationerna andra patogener och bidra till att upprätta demonstration av ett bevarat enteriska patogener svar på galla. Till skillnad från kronisk biofilmer där bakteriell gentranskription är begränsad och cellen åldras kan förekomma1,2,3, föreslår vi att den enteriska galla-inducerad biofilmen är mer övergående. Detta övergående, virulenta biofilm är tillverkas av en snabb demontering (som sett i dispersion-analysen) och förbättrad virulens genuttryck hos biofilm befolkningen4,6

Biofilm bildning är en mångsidig, dynamisk process och användning av gallsalter som en inledande faktor har endast nyligen beskriven för mest enteriska patogener, är de verktyg och tekniker som används unika och kreativa program av traditionella metoder. Därför är presenteras här tre gratis strategier att kvantifiera flera viktiga egenskaper hos galla salt-inducerad biofilm bildning, inklusive bakteriell vidhäftning, produktion av EPS-matrisen och spridning av livskraftiga bakterier från biofilmen. Dessa tekniker har använts främst för forskning med Shigella; och utvärdering av andra enteriska patogener kan därför kräva optimering. Trots positiva data från alla tre analyser stödja identifiering av biofilmer och upprätta reproducerbara protokoll för galla salt-inducerad biofilm bildning.

Protocol

1. beredning av reagens Gallsalter medium: för att förbereda tryptic soy buljong (TSB) som innehåller 0,4% gallsalter (vikt/volym), Återsuspendera 200 mg av gallsalter i 50 mL Ånghärdad TSB. Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Se färska medium varje vecka.Anteckningar: Gallsalter som rutinmässigt används är en 1:1 blandning av natrium cholate och natriumdeoxikolat isolerade från får och nötkreatur gallbladders. Som visat tidigare4, krävdes förekomst av glukos för …

Representative Results

I figur 1induceras biofilm bildning i de flesta av sex enteriska patogener testade följande ökningen av media som innehåller gallsalter. En betydande ökning av vidhäftande bakterier efter gallsalter exponering observeras i nästan alla stammar testade. Undantaget är enteroaggregative E. coli (Euratom); dock notera inducerad observationen av Δaaf mutant4. Resultaten tyder på att ytterligare följsamhe…

Discussion

Analys av biofilm bildning är utmanande på grund av den dynamiska karaktären av biofilmer och variabiliteten mellan stammar, material, laboratorier och testmetoder. Här presenteras flera strategier för att fastställa biofilm bildning i enteriska patogener efter gallsalter exponering med experimentella insikt för att främja reproducerbarhet. Det finns ytterligare överväganden att säkerställa reproducerbarhet. Först och främst rekommenderar vi utför minst tre oberoende experiment med tekniska exemplar att be…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Rachael B. Chanin och Alejandro Llanos-Chea för tekniskt bistånd. Vi tackar Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski och Bobby Cherayil för de stammar som används i denna studie. Detta arbete stöds av det nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich  22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G 
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500 
Formaldehyde Sigma-Aldrich  F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One  655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

References

  1. Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror “real-world” pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn’s Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Play Video

Cite This Article
Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

View Video