Bile Salt-inducerad Biofilm bildning i enteriska patogener: tekniker för identifiering och kvantifiering

Summary

Detta protokoll gör det möjligt för läsaren att analysera galla salt-inducerad biofilm bildning i enteriska patogener använder en mångfacetterad strategi för att fånga den dynamiska karaktären av bakteriell biofilm genom att bedöma följsamhet, extracellulära polymera substansen matrisen bildande, och spridning.

Abstract

Biofilm bildning är en dynamisk, flerstegs process som sker i bakterier under svåra miljöförhållanden eller tider av stress. För enteriska patogener induceras en betydande stress svar under gastrointestinal transit och vid galla exponering, en normal del av mänskliga matsmältningen. För att övervinna de bakteriedödande effekten av galla, bildar många enteriska patogener en biofilm som hypotes för att tillåta överlevnad när transiteras genom tunntarmen. Här presenterar vi metoder för att definiera biofilm bildning genom fasta fasen följsamhet analyser samt extracellulära polymera ämne (EPS) matrix upptäckt och visualisering. Dessutom presenteras biofilm dispersion bedömning för att efterlikna analys av händelser som utlöser frisättning av bakterier under infektionsprocessen. Kristallviolett färgning används för att upptäcka vidhäftande bakterier i en hög genomströmning plattan med 96 brunnar följsamhet-analys. EPS-produktion bedömning bestäms av två analyser, nämligen mikroskopi färgning av EPS-matrisen och semikvantitativ analys med en fluorescently-konjugerad polysackarid bindning lectin. Slutligen, biofilm dispersion mäts genom kolonin räknas och plätering. Positiva data från flera analyser stöder karakterisering av biofilmer och kan användas för att identifiera galla salt-inducerad biofilm bildning i andra bakteriestammar.

Introduction

Biofilm bildning är ett viktigt bakteriell överlevnadsstrategi inducerad under svåra miljöförhållanden. Exponering för bakteriedödande föreningar som antibiotika eller förändringar i näringsämne eller syre tillgänglighet inducerar ett stressat tillstånd i bakterier som kan lindras genom biofilm bildning. En biofilm kännetecknas av bakteriell fäste på en yta eller andra bakterier och åtföljs av utsöndringen av en EPS matris huvudsakligen består av polysackarider^1,2,3. Biofilm bildning är en dynamisk process där en kaskad av händelser kulminerar i bildandet av en mogen vidhäftande bakteriell gemenskapen^1,2,3. Bakterier producerar adhesiner för att underlätta tidig fastsättning medan skiftande adhesin gen uttryck profiler för att stärka fastsättning under biofilm mognad. Samtidigt uppstår EPS produktion till pälsen en matris bakteriell gemenskapen att skydda celler från den inledande stressfaktor. Bakterier som finns i biofilmen är långsamt växande; och som sådan gör de flesta antibiotika ineffektiva. Dessutom sparar den långsamma tillväxten energi tills förutsättningarna förändras för att gynna bakterietillväxt^1,2,3. Efter de hårda villkoren har passerat, bakterier skingra biofilmen och återuppta en plankton livsstil^1,2,3. Traditionellt biofilmer observeras på ytor och representerar en ihållande kliniska utmaning på grund av infektion reservoarer på katetrar och i-bostad enheter^1,2,3.

Biofilm bildning beskrevs nyligen för flera enteriska patogener. bakterier som infekterar tunntarmen eller tjocktarmen⁴. För Shigella arterna, uppstår infektion i människors kolon efter en transitering genom majoriteten av mag-tarmkanalen. Under passagen genom tunntarmen, är Shigella utsatt för galla; ett lipid-förnedrande rengöringsmedel som utsöndras till tarmen att underlätta matsmältningen av lipider medan samtidigt dödar de flesta bakterier⁵. Enteriska patogener har en unik förmåga att motstå de bakteriedödande effekten av galla⁶. Vår senaste analys utnyttjas i vivo-gillar kombinationer av glukos och gallsalter att demonstrera robusta biofilm bildning i S. flexneri samt andra arter av Shigella, patogena Escherichia colioch Salmonella⁴. Tidigare, Salmonella enterica serovar Typhi visades att bilda en galla-inducerad biofilm på grund av unika koloniseringen av gallblåsan under kronisk infektion^{7,8,9, 10}. Dessutom tidigare forskning med Vibrio¹¹och Campylobacter¹² visat biofilm bildning svar på galla. Därför analyser extended galla-inducerad biofilm bildning observationerna andra patogener och bidra till att upprätta demonstration av ett bevarat enteriska patogener svar på galla. Till skillnad från kronisk biofilmer där bakteriell gentranskription är begränsad och cellen åldras kan förekomma^1,2,3, föreslår vi att den enteriska galla-inducerad biofilmen är mer övergående. Detta övergående, virulenta biofilm är tillverkas av en snabb demontering (som sett i dispersion-analysen) och förbättrad virulens genuttryck hos biofilm befolkningen^4,6. 

Biofilm bildning är en mångsidig, dynamisk process och användning av gallsalter som en inledande faktor har endast nyligen beskriven för mest enteriska patogener, är de verktyg och tekniker som används unika och kreativa program av traditionella metoder. Därför är presenteras här tre gratis strategier att kvantifiera flera viktiga egenskaper hos galla salt-inducerad biofilm bildning, inklusive bakteriell vidhäftning, produktion av EPS-matrisen och spridning av livskraftiga bakterier från biofilmen. Dessa tekniker har använts främst för forskning med Shigella; och utvärdering av andra enteriska patogener kan därför kräva optimering. Trots positiva data från alla tre analyser stödja identifiering av biofilmer och upprätta reproducerbara protokoll för galla salt-inducerad biofilm bildning.

Protocol

1. beredning av reagens Gallsalter medium: för att förbereda tryptic soy buljong (TSB) som innehåller 0,4% gallsalter (vikt/volym), Återsuspendera 200 mg av gallsalter i 50 mL Ånghärdad TSB. Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Se färska medium varje vecka.Anteckningar: Gallsalter som rutinmässigt används är en 1:1 blandning av natrium cholate och natriumdeoxikolat isolerade från får och nötkreatur gallbladders. Som visat tidigare4, krävdes förekomst av glukos för …

Representative Results

I figur 1induceras biofilm bildning i de flesta av sex enteriska patogener testade följande ökningen av media som innehåller gallsalter. En betydande ökning av vidhäftande bakterier efter gallsalter exponering observeras i nästan alla stammar testade. Undantaget är enteroaggregative E. coli (Euratom); dock notera inducerad observationen av Δaaf mutant4. Resultaten tyder på att ytterligare följsamhe…

Discussion

Analys av biofilm bildning är utmanande på grund av den dynamiska karaktären av biofilmer och variabiliteten mellan stammar, material, laboratorier och testmetoder. Här presenteras flera strategier för att fastställa biofilm bildning i enteriska patogener efter gallsalter exponering med experimentella insikt för att främja reproducerbarhet. Det finns ytterligare överväganden att säkerställa reproducerbarhet. Först och främst rekommenderar vi utför minst tre oberoende experiment med tekniska exemplar att be…

Materials

Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
Crystal Violet	Sigma	C6158-50
Concanavalin-A FITC	Sigma	C7642-10mg
Glucose	Sigma	G7021-1KG
Bile Salts	Sigma	B8756-100G
LB Agar	Sigma	L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile	Fisher	14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635-500
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)	TPP	92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)	Greiner Bio-One	655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)	TPP	92424
Glass coverslips 12mm, round	Fisher	08-774-383
96-well plate reader	Spectramax
Flourescent plate reader	Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope	Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator	New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator	Thermolyne Series 5000