Summary
在这里, 我们提出了一个可靠和直接的二维 (2D) 共培养系统, 研究肿瘤细胞和骨髓细胞之间的相互作用, 这表明黑色素瘤干细胞衍生因子的双重作用对骨髓脂肪的影响分化, 也为骨转移的机械学研究提供了经典的方法。
Abstract
骨髓脂肪细胞与癌细胞的串扰在骨转移过程中起着至关重要的作用。有多种方法可用于研究显著的串扰;然而, 共培养的二维 transwell 系统仍然是这种串扰研究的经典、可靠、简便的方法。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 显示了骨髓脂肪细胞和黑色素瘤的共培养。然而, 这种共培养系统不仅有助于研究骨髓脂肪细胞诱导的癌细胞信号 transductions, 而且可以为今后骨转移的机械学研究提供新的治疗靶点。转移。
Introduction
骨转移在晚期癌症患者中普遍存在, 但治疗仍不可用。除了专门储存能量作为脂肪, 脂肪细胞可以支持肿瘤生长和转移骨髓和其他器官1,2,3,4,5,6。此外, 脂肪细胞在调节癌细胞生物学7、8、9、10和新陈代谢方面起着至关重要的作用,4、11、12 ,13,14,15,16, 以及在骨转移1,4,12。在骨髓小生境中, 脂肪细胞还会影响癌细胞4、6、17的生物学行为。骨髓脂肪细胞与癌细胞 osteotropism 的相互作用对了解骨转移有重要意义。然而, 鲜为人知。
根据目前的研究, 各种方法适用于脂肪细胞, 包括两个或三维 (2/3 d) 和体外培养17,18,19,20,21。最近, Herroon等人设计了一种新的 3 d-培养方法来研究骨髓脂肪细胞与癌细胞的相互作用22。虽然3D 共培养是最佳的模仿脂肪细胞和癌细胞在体内的生理相互作用, 它的重现性差22,23。与2D 共培养系统相比, 3D 共培养系统可以提供不同的细胞表型, 如细胞形态学21、22、24、25、26。此外, 分离的松质骨组织片段的体外培养可以导致骨髓细胞培养出17的生长脂肪体。
然而, 与以前的模型相比, 2D 细胞培养模型仍然是一种经典的、可靠的、易于快速扫描候选分子的技术, 在体外1的脂肪细胞或癌细胞中的表型改变, 4,6,12,15,27.为更好地了解骨髓脂肪细胞与黑色素瘤的相互串扰, 我们提供了一个详细的协议, 为2D 共培养系统的骨髓脂肪细胞与黑色素瘤。
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Protocol
注: 本协议中使用的所有细胞在解冻后, 应至少生长三代。
1. 收获黑色素瘤细胞衍生因子
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准备
- 获得 B16F10 细胞和小鼠黑色素瘤细胞系。
注: 本协议中, 从中国科学院干细胞库获得了一条小鼠黑色素瘤细胞系。 - 制作一个完整的培养基为 B16F10 细胞培养 (100 毫升)。使用 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充10% 胎牛血清 (血清), 50 毫升青霉素和50µg/毫升链霉素。
- 为 B16F10 细胞 (50 毫升) 的饥饿做无血清培养基。使用 DMEM 培养基, 不加血清, 50 毫升青霉素和50µg/毫升链霉素。
- 获得 B16F10 细胞和小鼠黑色素瘤细胞系。
-
制备黑色素瘤条件培养基 (厘米)
- 种子 2.0 x 105 B16F10 细胞在100毫米盘与10毫升10% 血清 DMEM。然后在 5% CO2 24 小时的大气层中孵化出37摄氏度孵化器中的细胞。
- 当细胞达到80% 的汇合, 移除培养基, 用5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (1x, pH 7.4) 清洗细胞, 并用10毫升无血清培养基替代培养基, 以使饥饿。
- 将细胞归还给 18–24 h 的孵化器。
- 饥饿后, 收集条件培养基 (CM) 与吸管和转移到一个新鲜的50毫升离心管。
注: 条件培养基为 B16F10 细胞培养的上清液。确保 B16F10 细胞在收集 CM 之前状态良好。 - 离心机 CM 为5分钟在 1000 x g在4°c。
- 将上清液吸管移到新鲜的无菌管或瓶中。
注意: 避免吹打在管子底部的颗粒。 - 要去除细胞碎片, 过滤 CM 通过通过注射器连接0.45 µm 过滤器在无菌瓶或管子之上。
注: 0.22 µm 过滤器是最佳的过滤 CM。 - 将过滤后的上清液贮存在摄氏-20 摄氏度, 直至使用。
注: 最好不要将上清液贮存在摄氏-20 摄氏度以上的一个月以上。或者, 将 CM 保存在-80 摄氏度以上, 以延长脂肪细胞的分化时间。
2. 黑色素瘤细胞衍生因子诱导骨髓脂肪组织的研究
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准备
- 使100毫升的脂肪感应介质28。使用完整的 DMEM 补充5µg/毫升胰岛素, 0.5 毫米3异丁基 1-甲基黄嘌呤和1µM 地塞米松。存储在4摄氏度的两个星期。
- 准备100毫升的脂肪维护培养基。使用完整的 DMEM 或混合50% 黑色素瘤 CM 补充5µg/毫升胰岛素。
- 做油红色 O 库存解决方案。将30毫克的油红 O 粉溶于10毫升异丙醇 (≥ 99.5%), 并将其与涡流混合均匀。
注: 储存1年在4摄氏度。 - 做一个油红色 O 工作解决方案。在油烟机中, 稀释油红色 O 型股票溶液 (从步骤 2.1.3) 与去离子水的比例为3:2。在室温下孵化混合物15分钟, 并在使用前通过0.22 µm 过滤器进行过滤。
注: 仅在2小时内使用新的工作解决方案。
-
脂肪细胞分化
- 培养一个基质细胞线14F1.1 从小鼠骨髓29在60毫米菜与一个完全 DMEM 在80% 融合在37°c 孵化器在 5% CO2的大气中。
注: 或者, 用原发骨髓间充质细胞取代 14F1.130。 - 胰蛋白酶处理细胞与1.5 毫升的0.25% 胰蛋白酶溶液在一个孵化器中的最小。
- 在细胞中加入5毫升10% 的血清, 用玻璃 hemocytometer 计数细胞数;然后调整细胞密度约 105/毫升。
- 种子 5 x 104的14F1.1 细胞每井在24井板与0.5 毫升的脂肪诱导培养基。经过两天的孵化, 细胞达到90% 的汇合。
注意: 这一步非常关键。骨髓基质细胞在没有脂肪诱导培养基的情况下不能诱导为脂肪组织。 - 每次取出感应介质, 用1毫升的 PBS 清洗两次细胞。
- 改变到1毫升的脂肪维持培养基, 并继续培养细胞直到脂肪成熟。
注: 在显微镜下, 脂肪细胞看起来像小或大肥皂泡, 很容易辨认。通常, 成熟的脂肪细胞存在于 6日或 8天。 - 用油红色 O 染色成熟脂肪细胞或收集脂肪细胞进行定量聚合酶链反应 (qPCR) 分析。
- 培养一个基质细胞线14F1.1 从小鼠骨髓29在60毫米菜与一个完全 DMEM 在80% 融合在37°c 孵化器在 5% CO2的大气中。
-
脂肪细胞染色
- 用 PBS 清洗分化的14F1.1 细胞 2x, 并将其固定在3.7% 甲醛中1小时。
- 冲洗60% 异丙醇的细胞, 使其完全干燥。
- 在油井中加入0.2 毫升油红色 O 工作溶液, 在室温下孵化0.5 至2小时。
- 用清水冲洗细胞, 除去未粘合的染料。
- 在光显微镜下拍摄染色脂肪细胞。
3. 骨髓脂肪细胞与黑色素瘤共培养的研究
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准备
- 制备成熟的骨髓脂肪细胞: 用脂肪诱导培养基在24井板中诱导14F1.1 干细胞成成熟的 BM 脂肪, 2 天, 然后在脂肪维持培养基中维持6–8天。
- 准备 B16F10 细胞: 培养5毫升 DMEM 培养基的60毫米菜肴中的 B16F10 细胞。
- 滋润膜插入物 (如transwell): 添加150µL 的无血清 DMEM 培养基到0.4 µm 孔大小膜插入, 并浸泡在24井板的水井, 填充500µL 的无血清 DMEM 培养基。
-
共培养设置
- 慢慢地把每个插入物的培养基吸走。
注意: 去除介质时不要破坏膜。 - 种子的 B16F10 细胞 (0/103/105/106) 在0.4 µm 孔插入从步骤3.2.1。
- 用步骤3.1.1 中的成熟骨髓脂肪细胞取代脂肪的维持培养基。与600µL 完全 DMEM 培养基。
- 将填充有 B16F10 细胞的插入物 (从步骤 3.2.2) 转移到与成熟的骨髓脂肪脂 (从步骤 3.2.3) 的水井上共培养实验。
- 孵化的 cocultures 在37摄氏度和 5% CO2 2 天。
- 48小时的孵化后, 取出共培养的插入物, 然后用500µL 1x PBS 清洗脂肪细胞2x。
注意: 如果需要, 可以选择在插入中收集 B16F10 单元格进行分析。 - 用油红 O 工作溶液染色脂肪细胞, 或收集脂肪细胞进行 qPCR 分析。
注: 请参阅步骤2.3 中的染色过程。 - 在光显微镜下拍摄染色脂肪细胞。
- 慢慢地把每个插入物的培养基吸走。
4. 脂肪细胞特异基因特征的 qPCR 分析
- 在成熟脂肪细胞准备检测的24井板中, 每井添加0.5 毫升的可随时使用的 RNA 隔离试剂。
- 遵循一个标准协议的 RNA 提取和 cDNA 合成31。
- 使用18S 和 GAPDH 的底漆作为对照, CEBPα/β, PPARγ, FABP4, 瘦素, Pref-1, 或脂联素为脂肪细胞特异基因签名 (表 1)。
- 在热循环仪中运行以下反应:95 °c 二十年代, 其次40周期95°c 为 1 s 和60°c 为二十年代。
- 使用 2-ΔΔCt方法计算褶皱变化32。
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Representative Results
在骨髓, 脂肪细胞可以出现在肿瘤微环境1,13,33,34,35在早期阶段支持肿瘤进展通过可溶性因素或激活 osteoclastogenesis6,12,36, 特别是在肥胖6,12和/或衰老37的情况下。我们以前的研究1已经指出, 骨髓脂肪细胞的数量在黑色素瘤转移到骨1的早期发生了显著变化。事实上, 脂肪细胞在肿瘤区积聚, 并支持当小鼠以高脂肪饮食喂养6时骨髓中的癌细胞生长, 表明骨髓脂肪细胞可能在转移骨中起重要作用。骨髓利基37。然而, 肿瘤细胞和骨髓脂肪瘤的动态串扰仍不清楚。因此, 我们致力于解决这一问题的2D 共培养系统的骨髓脂肪细胞和黑色素瘤。
肿瘤衍生因子促进骨髓脂肪细胞分化:
图 1一个典型的工作流诱导骨髓脂肪细胞与肿瘤条件培养基 (中医)。有代表性的实验表明, 14F1.1 细胞在第一2天脂肪诱导介质存在时, 在密度为 5 x 104细胞的单个细胞中被镀成单细胞, 然后在脂肪维护介质中保持 (有或没有中医) 6–8天。成熟的脂肪细胞含有脂滴;因此, 区分脂肪细胞可以很容易地识别出油红色 O 染色 (图 1b) 和量化的 qPCR 与脂肪细胞特异基因签名 (图 1c)。
黑色素瘤细胞超载诱导骨髓脂肪组织的脱分化:
肿瘤细胞可以改变环境生存, 特别是在缺氧条件下1,4,6。为了模拟骨髓脂肪细胞的肿瘤负担次生效应, 我们执行了2D 共培养系统, 在上部插入物中继续增加黑色素瘤单元数 (图 2a)。图 2b显示脂肪细胞的脂质贮存在黑色素瘤 (106细胞/井) 的最高密度范围内被剥夺, 与黑色素瘤细胞最低频率的剥夺相比 (103细胞/好吧)。图 2c给出了共培养脂肪细胞中这些脂肪细胞的基因分析。与黑色素瘤细胞密度最低的共培养相比, pref-1 水平明显增加, 瘦素、脂联素、FABP4、CEBPβ和 PPARγ的表达减少, 这表明肿瘤负担次生效应可归因于脂肪细胞的脱分化过程。此外, 肿瘤细胞超载可诱发脂肪瘤38的坏死。
总之, 我们观察到一个相反的黑色素瘤细胞驱动的影响骨髓脂肪组的可溶性因素。对骨髓脂肪细胞的相反作用是很高的兴趣, 这表明骨髓脂肪瘤是癌细胞转移骨髓的动态调节因子。
图 1:肿瘤衍生因子促进脂肪细胞分化.(a) 本小组展示了使用14F1.1 细胞系和黑色素瘤衍生条件培养基的实验设置的示意图。(b) 本小组显示分化的骨髓脂肪细胞的影像学。(c) 本小组显示了 qPCR 对脂肪细胞特异基因签名的分析。中医 = 肿瘤条件培养基。qPCR: 定量聚合酶链反应。刻度条 = 50 µm。这一数字已由王等修改。1.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2:肿瘤负担对脂肪细胞的影响.(a) 本小组展示了实验性环境的示意图: 共培养14F1.1 细胞系和黑色素瘤细胞。(b) 本小组显示共培养系统中骨髓脂肪细胞的影像学。(c) 本小组显示了 qPCR 对脂肪细胞的基因分析。qPCR: 定量聚合酶链反应。刻度条 = 50 µm。这一数字已由王等修改。1.请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 引 | ||
| 基因名称 | 向前序列 (5 ' 到 3 ') | 反向序列 (5 ' 到 3 ') |
| PPARγ | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPα | AAG AGC CGC GAC AAG GC | agc |
| CEBPβ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| 瘦 素 | AAG 的 TCA gc | GGT 民航局 GC |
| Pref-1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| 脂 联 素 | GCG ata AGC GGC | GGC GGA 猫 C |
表 1: 用于 qPCR 的引物表。
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Discussion
Cocultures 与插入物已被广泛用于研究细胞间的相互作用。2D 共培养系统是观察两个部位在体外进行串扰的有效方法, 我们在这里显示了两种不同的癌细胞驱动对骨髓脂肪细胞的影响。许多实验室利用这种方法来研究脂肪细胞与癌细胞6、12、27、39之间的串扰。
因此, 一般而言, 2D 共培养是细胞间串扰研究中最直接的方法。然而, 在为进一步研究准备一个未分化的细胞系时, 有一些独特的挑战。在这里描述的协议中, 骨髓基质细胞的健康和功能状态对脂肪的分化是至关重要的。该协议可以修改, 以取代14F1.1 细胞与原发骨髓间充质干细胞。此外, 14F1.1 细胞在脂肪诱导培养基中的预孵化数天是另一个关键步骤。没有这种预孵化, 骨髓基质细胞将无法分化成脂肪, 这已经被发现在我们和其他的研究40。这些现象也解释了为什么一些类似的协议可能导致不同的或甚至相反的效果, 并强调了这样一个简单的, 可重复的, 详细的协议的重要性, 对肿瘤细胞和骨髓细胞的串扰研究。
虽然 2D 共培养可能会丢失一些关键信息与 3D 或前体文化相比 , 它仍然很容易被标准化 , 监测 , 并最终纵进一步使用20,21,41。技术的未来应用可能决定成骨细胞在与癌细胞共培养时如何改变。
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Disclosures
作者没有什么要申报的。
Acknowledgments
我们感谢 Dov Zipori (魏茨曼科学研究所, 雷霍沃特, 以色列) 亲切地为我们提供小鼠骨髓基质细胞线14F1.1。这项研究得到了中国国家自然科学基金 (81771729 号) 和重庆医科大学永川医院的资助。YJQN201330;YJZQN201527)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
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