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Cancer Research

मेलेनोमा कोशिका के दोहरे प्रभाव-अस्थि मज्जा Adipocytes भेदभाव पर व्युत्पंन कारकों

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/57329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Rheumatology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 2Department of Nephrology and Rheumatology, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University

Summary

यहां, हम एक विश्वसनीय और सरल दो आयामी (2d) coculture प्रणाली ट्यूमर कोशिकाओं और अस्थि मज्जा adipocytes, जो मेलेनोमा कोशिका की एक दोहरी प्रभाव-अस्थि मज्जा पर व्युत्पंन कारकों का पता चलता है के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए प्रस्तुत adipocytes भेदभाव और भी हड्डी मेटास्टेसिस के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक क्लासिक विधि बन गया है ।

Abstract

अस्थि मज्जा adipocytes और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच crosstalk हड्डी मेटास्टेसिस की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । महत्वपूर्ण crosstalk के अध्ययन के लिए विभिंन प्रकार के तरीके उपलब्ध हैं; हालांकि, coculture के लिए एक दो आयामी transwell प्रणाली इस crosstalk अध्ययन के लिए एक क्लासिक, विश्वसनीय, और आसान तरीका रहता है । यहाँ, हम अस्थि मज्जा adipocytes और मेलेनोमा कोशिकाओं के coculture से पता चलता है कि एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । फिर भी, इस तरह के एक coculture प्रणाली न केवल कैंसर अस्थि मज्जा adipocytes द्वारा प्रेरित कोशिकाओं की सेल संकेत transductions के अध्ययन के लिए योगदान कर सकता है, लेकिन हड्डी मेटास्टेसिस के भविष्य यंत्रवत अध्ययन करने के लिए जो हड्डी के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर कर सकते हैं मेटास्टेसिस.

Introduction

अस्थि मेटास्टेसिस उन्नत कैंसर रोगियों के बीच व्यापक हैं, लेकिन एक उपचारात्मक उपचार अभी भी अनुपलब्ध है । वसा के रूप में ऊर्जा भंडारण में विशेषज्ञता के अलावा, adipocytes अस्थि मज्जा और अन्य अंगों में ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस का समर्थन कर सकते हैं1,2,3,4,5,6. इसके अलावा, adipocytes कैंसर कोशिका जीवविज्ञान7,8,9,10 और चयापचय4,11,12 को विनियमित करने में एक आवश्यक भूमिका निभा ,13,14,15,16, साथ ही अस्थि मेटास्टेसिस1,4,12में । अस्थि मज्जा आला में, adipocytes भी कैंसर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं4,6,17. अस्थि मज्जा adipocytes और osteotropism के साथ कैंसर कोशिकाओं के बीच एक साथ खेलना हड्डी मेटास्टेसिस की समझ के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, थोड़ा जाना जाता है ।

वर्तमान अध्ययन के आधार पर, विभिन्न तरीकों adipocytes करने के लिए लागू कर रहे हैं, दो या तीन आयामी सहित (2/3d) और पूर्व vivo संस्कृतियों17,18,19,20,21. हाल ही में, Herroon एट अल । 22कैंसर कोशिकाओं के साथ अस्थि मज्जा adipocytes की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक नया 3d संस्कृति दृष्टिकोण बनाया. हालांकि 3 डी coculture vivo मेंadipocytes और कैंसर कोशिकाओं के बीच शारीरिक बातचीत नकल उतार के लिए इष्टतम है, यह गरीब reproducibility22,23से ग्रस्त है । एक 2d coculture प्रणाली की तुलना में, एक 3d coculture सिस्टम विभिन्न सेलुलर phenotypes प्रदान कर सकता है, जैसे कक्ष आकृति विज्ञान21,22,24,25,26. इसके अलावा, अलग रद्द हड्डी ऊतक टुकड़े के पूर्व vivo संस्कृति adipocytes की एक मजबूत वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते है संस्कृतिपूर्ण अस्थि मज्जा17कोशिकाओं से ।

इन पिछले मॉडल के विपरीत, तथापि, 2d सेल संस्कृति मॉडल एक क्लासिक, विश्वसनीय, और आसान तकनीक के लिए जल्दी से उंमीदवार अणुओं स्कैनिंग और phenotypes में या तो adipocytes या इन विट्रो मेंकैंसर की कोशिकाओं में बदल गया रहता है1, 4,6,12,15,27. बेहतर अस्थि मज्जा adipocytes और मेलेनोमा कोशिकाओं के बीच crosstalk को समझने के लिए, हम adipocytes कोशिकाओं के साथ अस्थि मज्जा मेलेनोमा के एक 2d coculture प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाली सभी कोशिकाएं फ्रोजन स्टॉक सेल से गल जाने के बाद कम से तीन पीढ़ियों के लिए उगाई जानी चाहिए ।

1. फसल मेलेनोमा कोशिका व्युत्पंन कारकों

  1. तैयारी
    1. B16F10 कक्ष और कोई माउस मेलेनोमा कक्ष पंक्ति प्राप्त करें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, एक माउस मेलेनोमा सेल लाइन चीनी विज्ञान अकादमी के स्टेम सेल बैंक से प्राप्त किया गया था ।
    2. B16F10 सेल संस्कृति (१०० एमएल) के लिए एक पूर्ण माध्यम बनाओ । Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम का उपयोग करें (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ५० U/एमएल पेनिसिलिन का, और ५० µ g/streptomycin के एमएल के साथ पूरक ।
    3. B16F10 कोशिकाओं (५० मिलीलीटर) के भुखमरी के लिए एक सीरम मुक्त माध्यम बनाओ । FBS के बिना DMEM मध्यम का उपयोग करें, ५० यू/एमएल पेनिसिलिन के, और ५० µ जी/एमएल streptomycin के ।
  2. तैयार मेलेनोमा-वातानुकूलित मध्यम (सेमी)
    1. बीज २.० x 105 B16F10 कोशिकाओं में 10 मिलीलीटर 10% FBS DMEM के साथ एक १०० मिमी डिश । तो 5% सह2 के एक वातावरण में एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कोशिकाओं की मशीन 24 घंटे के लिए ।
    2. जब कोशिकाओं संगम के बारे में ८०% तक पहुँचने, संस्कृति माध्यम को हटाने, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 5 मिलीलीटर (1x, पीएच ७.४) के साथ दो बार कोशिकाओं को धोने, और भुखमरी के लिए एक 10 मिलीलीटर सीरम मुक्त माध्यम से मध्यम की जगह ।
    3. 18-24 एच के लिए मशीन के लिए कोशिकाओं को लौटें ।
    4. भुखमरी के बाद, एक पिपेट के साथ वातानुकूलित मध्यम (सेमी) इकट्ठा करने और एक ताजा ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: वातानुकूलित माध्यम B16F10 कोशिका संस्कृतियों का supernatant होता है. सुनिश्चित करें कि B16F10 कोशिकाओं सेमी इकट्ठा करने से पहले अच्छी हालत में हैं ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर १,००० x g पर 5 मिनट के लिए मुख्यमंत्री के केंद्रापसारक ।
    6. पिपेट supernatant और यह एक ताजा बाँझ ट्यूब या बोतल के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: ट्यूब के तल पर गोली बंद pipetting से बचें ।
    7. सेल मलबे को हटाने के लिए, एक बाँझ बोतल या ट्यूब के शीर्ष पर एक सिरिंज से जुड़े ०.४५ µm फिल्टर के माध्यम से इसे पारित करके मुख्यमंत्री फिल्टर.
      नोट: ०.२२ µm फ़िल्टर CM को फ़िल्टर करने के लिए इष्टतम हैं ।
    8. उपयोग करने तक-20 ° c पर फ़िल्टर्ड supernatant संग्रहीत करें ।
      नोट: यह एक महीने से अधिक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर supernatant स्टोर करने के लिए सबसे अच्छा नहीं है । वैकल्पिक रूप से, adipocyte के भेदभाव के लिए समय की अधिक विस्तारित अवधि के लिए सेमी-८० ° c में स्टोर ।

2. मेलेनोमा कोशिका द्वारा अस्थि मज्जा Adipocytes की प्रेरण-व्युत्पंन कारकों

  1. तैयारी
    1. adipogenic प्रेरण मध्यम28के १०० मिलीलीटर बनाओ । 5 µ g/एमएल ऑफ इंसुलिन, ०.५ mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, और 1 µ m डेक्समेतएसॉनी के साथ पूरक एक पूर्ण DMEM का उपयोग करें । इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर दो सप्ताह तक स्टोर करें ।
    2. adipogenic रखरखाव माध्यम के १०० मिलीलीटर तैयार करें । एक पूर्ण DMEM का प्रयोग करें या ५०% मेलेनोमा सेमी के साथ मिश्रित 5 µ जी/
    3. एक तेल लाल हे शेयर समाधान बनाओ । isopropanol के 10 मिलीलीटर में तेल लाल ओ पाउडर की 30 मिलीग्राम भंग (≥ ९९.५%) और उंहें अच्छी तरह से भंवर से मिश्रण ।
      नोट: इसे 1 साल तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    4. एक तेल लाल हे समाधान काम कर । धुएं डाकू में, तेल लाल हे शेयर समाधान (कदम 2.1.3 से) 3:2 के अनुपात में पानी के साथ जल के साथ पतला । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी और उपयोग करने से पहले एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से यह फिल्टर ।
      नोट: केवल 2 घंटे के भीतर नए सिरे से काम समाधान का उपयोग करें ।
  2. Adipocyte विभेद
    1. संस्कृति एक stromal सेल लाइन 14f 1.1 माउस अस्थि मज्जा29 से एक ६० मिमी डिश में ८०% पर एक पूरा DMEM के साथ में एक वातावरण में एक ३७ डिग्री सेल्सियस में प्रवाह 5% CO2।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक अस्थि मज्जा के साथ 14f 1.1 बदलें-व्युत्पंन mesenchymal कोशिकाओं30।
    2. Trypsinize 1 के लिए एक मशीन में ०.२५% trypsin समाधान की १.५ मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं-2 मिनट ।
    3. कोशिकाओं के लिए 10% FBS मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक गिलास hemocytometer के साथ सेल संख्या गिनती; तो के बारे में 1 के लिए सेल घनत्व समायोजित-2 x 105/mL.
    4. बीज 5 14f 1.1 कोशिकाओं के 104 adipogenic प्रेरण माध्यम की ०.५ मिलीलीटर के साथ एक 24-अच्छी तरह से थाली में प्रति । दो दिन की मशीन के बाद, कोशिकाओं संगम के बारे में ९०% तक पहुंच ।
      नोट: यह चरण बहुत महत्वपूर्ण है । अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं को एक adipogenic प्रेरण माध्यम के बिना adipocytes के लिए प्रेरित नहीं किया जा सकता ।
    5. प्रेरण माध्यम निकालें और हर बार पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो दो ।
    6. adipogenic रखरखाव माध्यम के 1 मिलीलीटर में बदलें और संस्कृति adipocyte परिपक्वता तक कोशिकाओं को जारी है ।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत, adipocytes छोटे या बड़े साबुन के बुलबुले की तरह दिखते हैं और पहचान करने के लिए बहुत आसान हैं । आमतौर पर, परिपक्व adipocytes 6वें या 8वें दिन पर मौजूद हैं ।
    7. तेल लाल हे या एक मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विश्लेषण के लिए adipocytes इकट्ठा के साथ परिपक्व adipocytes दाग ।
  3. Adipocyte धुंधला
    1. 14f के साथ विभेदित 1.1 कोशिकाओं को धो लें और उंहें 1 घंटे के लिए ३.७% formaldehyde में ठीक करें ।
    2. ६०% isopropanol में कोशिकाओं कुल्ला और उंहें पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. कुओं के लिए तेल लाल ओ काम समाधान के ०.२ मिलीलीटर जोड़ें और ०.५ के लिए 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन ।
    4. असीम रंजकों को दूर करने के लिए कोशिकाओं को पानी से धोएं ।
    5. फोटो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत रंगे adipocytes ।

3. मेलेनोमा कोशिकाओं के साथ अस्थि मज्जा Adipocytes के Coculture

  1. तैयारी
    1. परिपक्व अस्थि मज्जा adipocytes तैयार: 2 दिनों के लिए adipogenic प्रेरण माध्यम के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटों में परिपक्व बीएम adipocytes में 14f 1.1 कोशिकाओं को प्रेरित, और फिर उंहें एक अतिरिक्त 6 के लिए adipogenic रखरखाव माध्यम में बनाए रखने-8 दिन ।
    2. B16F10 कोशिकाओं को तैयार: संस्कृति DMEM मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ ६० mm व्यंजन में B16F10 कोशिकाओं ।
    3. झिल्ली डालने गीला (उदा. transwell): १५० µ l के FBS-free DMEM मीडियम के ०.४ µm ताकना-आकार झिल्ली आवेषण और उंहें 24 के कुओं पर विसर्जित-अच्छी तरह से µ-मुक्त FBS मध्यम के ५०० DMEM एल से भरा प्लेटें ।
  2. Coculture सेटिंग
    1. धीरे से प्रत्येक डालने के माध्यम बंद पिपेट ।
      नोट: मध्यम निकालते समय झिल्ली को नष्ट न करें ।
    2. बीज B16F10 कोशिकाओं (0/103/105/106) में ०.४ µm ताकना आवेषण से कदम 3.2.1 ।
    3. adipogenic रखरखाव माध्यम कुओं में कदम 3.1.1 से परिपक्व अस्थि मज्जा adipocytes के साथ बदलें । के साथ ६०० µ l को पूरा DMEM माध्यम ।
    4. coculture प्रयोगों के लिए (कदम 3.2.3 से) परिपक्व अस्थि मज्जा adipocytes के साथ कुओं पर B16F10 कोशिकाओं (कदम 3.2.2 से) से भरा आवेषण स्थानांतरण ।
    5. ३७ ° c और 5% 2 दिन के लिए2 सह पर cocultures मशीन ।
    6. ४८ मशीन के एच के बाद, coculture के आवेषण निकालें और फिर adipocytes 2x धो ५०० 1x पंजाबियों के µ एल के साथ ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण के लिए सम्मिलन में B16F10 कक्षों को एकत्रित करें.
    7. तेल लाल ओ काम समाधान के साथ adipocytes दाग या qPCR विश्लेषण के लिए adipocytes इकट्ठा ।
      नोट: चरण २.३ में धुंधला हो रहा है कार्यविधि देखें ।
    8. फोटो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत रंगे adipocytes ।

4. Adipocyte-विशिष्ट जीन हस्ताक्षर का qPCR विश्लेषण

  1. ०.५ मिलीलीटर में तैयार करने के लिए उपयोग आरएनए आइसोलेशन एजेंट के लिए एक 24-well थाली में जोड़ें जिसमें परिपक्व adipocyte का पता लगाने के लिए तैयार है ।
  2. आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करें31.
  3. नियंत्रण के रूप में 18S और GAPDH के लिए प्राइमर का प्रयोग करें, और FABP4-विशिष्ट जीन हस्ताक्षर (तालिका 1) के लिए CEBPα/β, PPARγ, लेप्टिन, प्राथमिकता, adiponectin-1, या adipocyte ।
  4. एक थर्मल साइकिल चालक में निंनलिखित प्रतिक्रिया भागो: ९५ ° c 20 एस के लिए, ९५ डिग्री सेल्सियस के ४० चक्र के बाद 1 एस के लिए, और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 20 एस ।
  5. ३२गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए 2-ΔΔCt विधि का उपयोग करें ।

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Representative Results

अस्थि मज्जा में, adipocytes ट्यूमर microenvironment1,13,३३,३४,३५ में घुलनशील कारकों के माध्यम से ट्यूमर प्रगति का समर्थन करने के लिए एक प्रारंभिक चरण में दिखाई दे सकते हैं या 6,12,३६, विशेष रूप से मोटापा6,12 और/या३७एजिंग के संदर्भ में osteoclastogenesis सक्रिय । हमारे पिछले अध्ययन1 उल्लेखनीय है कि अस्थि मज्जा adipocyte परिवर्तन की संख्या मेलेनोमा मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरण के दौरान नाटकीय रूप से1हड्डी के लिए । वास्तव में, adipocytes की मात्रा ट्यूमर क्षेत्र में जमा और अस्थि मज्जा में ट्यूमर ' कोशिकाओं के विकास का समर्थन जब चूहों एक उच्च वसा आहार6के साथ खिलाया, सुझाव है कि अस्थि मज्जा adipocytes मेटास्टेटिक हड्डी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है मज्जा आला३७। हालांकि, ट्यूमर कोशिकाओं और अस्थि मज्जा adipocyte के गतिशील crosstalk अस्पष्ट बनी हुई है । इसलिए, हम अस्थि मज्जा adipocyte और मेलेनोमा कोशिकाओं के 2d coculture प्रणाली द्वारा इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए समर्पित किया गया ।

ट्यूमर व्युत्पंन कारकों अस्थि मज्जा adipocytes के भेदभाव को बढ़ावा देने:
चित्रा 1 एक ट्यूमर के साथ अस्थि मज्जा adipocytes उत्प्रेरण के लिए एक ठेठ कार्यप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है, मध्यम (TCM) वातानुकूलित । एक प्रतिनिधि प्रयोग 14f 1.1 कोशिकाओं को इंगित करता है, 5 एक्स 104 कोशिकाओं के एक घनत्व पर एक adipogenic प्रेरण मध्यम की उपस्थिति में पहले 2 दिनों में एकल कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया, और फिर adipogenic रखरखाव माध्यम के भीतर बनाए रखा (या TCM बिना) 6 के लिए-8 दिन । परिपक्व adipocyte लिपिड बूंदों शामिल हैं; इसलिए, विभेदित adipocytes आसानी से तेल लाल ओ धुंधला (चित्रा 1बी) और एक adipocyte विशिष्ट जीन हस्ताक्षर (चित्रा 1सी) के साथ qPCR द्वारा quantified द्वारा पहचाना जा सकता है ।

मेलेनोमा कोशिकाओं के अधिभार अस्थि मज्जा adipocytes में de-भेदभाव लाती है:
ट्यूमर कोशिकाओं को जीवित करने के लिए पर्यावरण को संशोधित कर सकते हैं, विशेष रूप से hypoxic शर्तों के तहत1,4,6. एक अस्थि मज्जा adipocyte पर एक ट्यूमर बोझ माध्यमिक प्रभाव की नकल करने के लिए, हम ऊपरी आवेषण (चित्रा 2ए) में मेलेनोमा सेल संख्या की एक निरंतर वृद्धि के साथ 2d coculture प्रणाली प्रदर्शन किया । चित्रा बी 2 से पता चलता है कि adipocytes में लिपिड भंडारण मेलेनोमा कोशिकाओं के उच्चतम घनत्व पर एक अधिक से अधिक हद तक वंचित है (106 कोशिकाओं/मेलेनोमा कोशिकाओं की सबसे कम आवृत्ति पर अभाव के साथ तुलना में (103 कोशिकाओं/ ठीक है) । चित्रा 2 सी coculture में adipocytes में इन adipocytes के एक जीन रूपरेखा प्रस्तुत करता है । मेलेनोमा कोशिकाओं की सबसे कम घनत्व के साथ coculture के साथ तुलना में, प्राथमिकता-1 स्तर में वृद्धि जाहिर है, और लेप्टिन, adiponectin, FABP4, CEBPβ, और PPARγ की अभिव्यक्ति में कमी आई थी, जो पता चलता है कि ट्यूमर बोझ माध्यमिक प्रभाव को जिंमेदार ठहराया जा सकता है adipocytes में de-भिंनता प्रक्रिया । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के एक अधिभार adipocytes३८में परिगलन पैदा कर सकता है ।

संक्षेप में, हम एक विपरीत मेलेनोमा कोशिका में घुलनशील कारकों द्वारा अस्थि मज्जा adipocytes पर प्रभाव संचालित मनाया । अस्थि मज्जा adipocytes पर विपरीत प्रभाव उच्च ब्याज की है, सुझाव है कि अस्थि मज्जा adipocytes अस्थि मज्जा के लिए ट्यूमर कोशिका metastasize के गतिशील नियामकों हैं.

Figure 1
चित्रा 1 : ट्यूमर व्युत्पंन कारकों एक adipocyte भेदभाव को बढ़ावा देने के । (क) इस पैनल प्रयोगात्मक सेटिंग जो 14f 1.1 सेल लाइनों और एक मेलेनोमा-व्युत्पंन वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करता है की एक योजनाबद्ध दृश्य से पता चलता है । (ख) यह पैनल एक विभेदित अस्थि मज्जा adipocyte की इमेजिंग से पता चलता है । (ग) यह पैनल qPCR द्वारा एक adipocyte-विशिष्ट जीन हस्ताक्षर के विश्लेषण से पता चलता है. TCM = ट्यूमर वातानुकूलित माध्यम । qPCR: मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन. स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को वांग एट अल से संशोधित किया गया है । 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : adipocyte पर ट्यूमर-बोझ प्रभाव । (क) इस पैनल प्रयोगात्मक सेटिंग के एक योजनाबद्ध दृश्य: 14f 1.1 सेल लाइनों और मेलेनोमा कोशिकाओं के एक coculture दिखाता है । (ख) इस पैनल coculture प्रणाली में एक अस्थि मज्जा adipocyte की इमेजिंग से पता चलता है । (ग) यह पैनल qPCR द्वारा adipocytes का एक जीन profile दिखाता है. qPCR: मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन. स्केल बार = ५० µm । इस आंकड़े को वांग एट अल से संशोधित किया गया है । 1. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

प्राइमरों
जीन नाम आगे अनुक्रम (5 ' से 3 ') अनुक्रम रिवर्स (5 ' से 3 ')
PPARγ CTGATGCACTGCCTATGAGC GGGTCAGCTCTTGTGAATGG
CEBPα AAG AGC CGC GAC AAG जीसी गोरखा AGC टीसीसी AGC एसीसी TTG टीजी
CEBPβ CAACCTGGAGACGCAGCACAAG GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT
FABP4 TGAAATCACCGCAGACGACAGG GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC
लेप्टिन एटीसी TGA AGC AAG सीसीएल टीसीए जीसी सीसीएल गोरखा प्रशिक्षण एसीसी आगा GGT CAA जीसी
प्राथमिकता-1 GACACTCGAAGCTCACCTGG GGAAGGCTGGGACGGGAAAT
Adiponectin GCG अता बिल्ली अता AGC GGC टीटीसी T जीसीए GGC एटीसी सीसीए GGA कैट सी

तालिका 1: qPCR के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की तालिका ।

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Discussion

सम्मिलन के साथ Cocultures सेल-टू-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है. 2d coculture प्रणाली एक प्रभावी तरीका है निरीक्षण कैसे दो इन विट्रो मेंcrosstalk भागों, जिसके द्वारा हम यहां दो अलग कैंसर कोशिका अस्थि मज्जा adipocytes पर प्रभाव संचालित दिखाया । कई प्रयोगशालाओं adipocytes और कैंसर कोशिकाओं के बीच crosstalk की जांच करने के लिए इस विधि का उपयोग किया है6,12,27,३९.

सामांय में, इसलिए, एक 2d coculture सेल करने वाली सेल crosstalk अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा सीधा दृष्टिकोण है । हालांकि, जब यह आगे अनुसंधान के लिए एक विभेदित सेल लाइन की तैयारी की बात आती है, वहां कुछ अद्वितीय चुनौतियों का सामना कर रहे हैं । प्रोटोकॉल में यहां वर्णित है, अस्थि मज्जा stromal सेल के स्वास्थ्य और कार्यात्मक स्थिति adipocytes भेदभाव के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । प्रोटोकॉल प्राथमिक अस्थि मज्जा mesenchymal स्टेम सेल के साथ 14f 1.1 कोशिकाओं को बदलने के लिए संशोधित किया जा सकता है । इसके अलावा, कई दिनों के लिए adipogenic प्रेरण माध्यम में 14f 1.1 कोशिकाओं की पूर्व मशीन एक और महत्वपूर्ण कदम है । इस पूर्व मशीन के बिना, अस्थि मज्जा stromal कोशिकाओं adipocytes, जो हमारे और दूसरों की पढ़ाई४०में पाया गया है में अंतर करने के लिए असफल हो जाएगा । इन घटनाओं को भी समझा क्यों कुछ इसी तरह के प्रोटोकॉल में परिणाम हो सकता है अलग या भी विपरीत प्रभाव और ट्यूमर कोशिकाओं और अस्थि मज्जा adipocytes के crosstalk अध्ययन के लिए इस तरह के एक आसान, दोहराने, और विस्तृत प्रोटोकॉल के महत्व पर प्रकाश डाला.

हालांकि 2d coculture 3 डी या पूर्व vivo संस्कृतियों की तुलना में कुछ महत्वपूर्ण जानकारी खो सकते हैं, यह मानकीकृत किया जा करने के लिए आसान रहता है, पर नजर रखी है, और अंततः आगे उपयोग के लिए हेरफेर20,21,४१। तकनीक के भविष्य के आवेदन कैसे एक osteoblast परिवर्तन जब यह कैंसर की कोशिकाओं के साथ cocultured है तय कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

हम Dov Zipori (विज्ञान के Weizmann संस्थान, Rehovot, इज़राइल) कृपया हमें murine अस्थि मज्जा stromal सेल लाइन 1.1 14f प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस अध्ययन से अनुदान द्वारा समर्थित चीनी राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१७७१७२९) और चोंगकिंग चिकित्सा विश्वविद्यालय के Yongchuan अस्पताल (नग. YJQN201330; YJZQN201527) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen Inc. 11965092
Fetal Bovine Serum Invitrogen Inc. 16000–044
Phosphate Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144
Insulin Sigma-Aldrich 91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
Oil Red o Sigma-Aldrich O0625
24-well plate Corning CLS3527
Transwell insert Millipore MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
isopropanol Sigma-Aldrich I9516
0.25% trypsin Thermo Scientific 25200056
hemocytometer Bio-Rad 1450016
Culture incubator Thermo Scientific
50 mL falcon Corning CLS430828
Clean Bench Thermo Scientific -
Microscopy Olympus -
200 μL pipet tips BeyoGold FTIP620
1,000 mL pipet tips BeyoGold FTIP628

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J., et al. Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow. Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).
  2. Trotter, T. N., et al. Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone. The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).
  3. Morris, E. V., Edwards, C. M. The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).
  4. Diedrich, J. D., et al. Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation. Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).
  5. Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression. Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).
  6. Chen, G. L., et al. High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6. Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).
  7. Balaban, S., et al. Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration. Cancer & Metabolism. 5, 1 (2017).
  8. Huang, C. K., et al. Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate. Nature Communications. 8, 14706 (2017).
  9. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI Insight. 2 (4), 87489 (2017).
  10. Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2. PLoS One. 10 (3), 0119348 (2015).
  11. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).
  12. Herroon, M. K., et al. Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms. Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).
  13. Tabe, Y., et al. Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells. Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).
  14. Wen, Y. A., et al. Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer. Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593 (2017).
  15. Liu, Z., et al. Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation. Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).
  16. Ye, H., et al. Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche. Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).
  17. Templeton, Z. S., et al. Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche. Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).
  18. Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
  19. Emont, M. P., et al. Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro. Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).
  20. Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
  21. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  22. Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84 (2016).
  23. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).
  24. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  25. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  26. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  27. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  28. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  29. Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells. Blood. 66 (2), 447-455 (1985).
  30. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
  31. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. Journal of Visualized Experiments. (132), e56850 (2018).
  32. Bozec, A., Hannemann, N. Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis. Journal of Visualized Experiments. (112), e53822 (2016).
  33. Shafat, M. S., et al. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).
  34. Gazi, E., et al. Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy. The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).
  35. Brown, M. D., et al. Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer. British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).
  36. Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer. Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).
  37. Aebi, M. Spinal metastasis in the elderly. European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).
  38. Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation. Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).
  39. Bochet, L., et al. Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance. Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).
  40. Hirano, T., et al. Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells. Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).
  41. Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures. Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).

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कर्कट अनुसन्धान अंक १३८ अस्थि मज्जा adipocyte बोन मेटास्टेसिस मेलेनोमा coculture विभेद झिल्ली सम्म
मेलेनोमा कोशिका के दोहरे प्रभाव-अस्थि मज्जा Adipocytes भेदभाव पर व्युत्पंन कारकों
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Wang, J., Wen, J., Chen, X. X., Chen, G. L. Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation. J. Vis. Exp. (138), e57329, doi:10.3791/57329 (2018).

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