Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige und einfache zweidimensionale (2D) Coculture-System für das Studium der Interaktion zwischen Tumorzellen und Knochenmark Adipozyten, die eine doppelte Wirkung von Melanom Zelle abgeleitet Faktoren auf das Knochenmark Adipozyten enthüllt Differenzierung und stellt auch eine klassische Methode für die mechanistischen Studie von Knochenmetastasen.
Abstract
Das Übersprechen zwischen dem Knochenmark Adipozyten und Tumorzellen kann eine entscheidende Rolle im Prozess der Knochenmetastasen. Eine Vielzahl von Methoden stehen zur Verfügung für das bedeutende Übersprechen zu studieren; ein zweidimensionales Transwell-System für die Coculture bleibt jedoch ein Klassiker, zuverlässig, und einfache Möglichkeit für diese Studie Übersprechen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, das die Coculture von Knochenmark Adipozyten und Melanomzellen zeigt. Dennoch könnte ein solches Coculture System nicht nur einen Beitrag zur Erforschung der Zelle Signal Transductions von Krebszellen durch Knochenmark Adipozyten induziert, sondern auch in die Zukunft mechanistischen Studie von Knochenmetastasen die neue therapeutische Zielstrukturen für Knochen zeigen kann Metastasierung.
Introduction
Knochenmetastasen sind weit verbreitet bei fortgeschrittenem Krebs-Patienten, aber eine kurative Behandlung ist noch nicht verfügbar. Darüber hinaus spezialisiert auf Energie als Fett zu speichern, unterstützen Adipozyten Tumorwachstum und Metastasierung im Knochenmark und anderen Organen1,2,3,4,5,6. Darüber hinaus spielen Adipozyten eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Krebs Zelle Biologie7,8,9,10 und Stoffwechsel4,11,12 ,13,14,15,16, so gut wie in Knochen Metastasen1,4,12. In der Nische des Knochenmarks können Adipozyten auch Auswirkungen auf das biologische Verhalten von Krebs Zellen4,6,17. Das Zusammenspiel von Knochenmark Adipozyten und Krebszellen mit Osteotropism ist bedeutsam für das Verständnis von Knochenmetastasen. Jedoch ist wenig bekannt.
Basierend auf aktuellen Studien, werden verschiedene Methoden auf Adipozyten, einschließlich zwei- oder dreidimensionale (2/3D) und ex-Vivo Kulturen17,18,19,20,21angewendet. Vor kurzem, Herroon Et Al. entwickelt ein neues 3D-Kultur-Konzept für Interaktionen von Knochenmark Adipozyten mit Krebs Zellen22zu untersuchen. Obwohl die 3D Coculture ist optimal für die Nachahmung physiologischen Wechselwirkungen zwischen Adipozyten und Krebs-Zellen in Vivo, es leidet unter schlechten Reproduzierbarkeit22,23. Im Vergleich zu einem 2D Coculture System kann ein 3D Coculture System verschiedene zelluläre Phänotypen, wie Zelle Morphologie21,22,24,25,26vorsehen. Darüber hinaus kann die ex-Vivo -Kultur der isolierten Spongiosa gewebefragmente zu einer robusten Auswuchs der Adipozyten aus kultivierten Knochenmark Zellen17führen.
Im Gegensatz zu diesen früheren Modellen bleibt jedoch das 2D zellenmodell Kultur eine klassisch, zuverlässige und einfache Technik für schnell scannen Kandidat Moleküle und die Phänotypen verändert in Adipozyten oder Krebs in Vitro1Zellen, 4,6,12,15,27. Um das Übersprechen zwischen dem Knochenmark Adipozyten und Melanomzellen besser verstehen zu können, bieten wir ein detailliertes Protokoll für ein 2D Coculture Knochenmark Adipozyten mit Melanomzellen.
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Protocol
Hinweis: Alle Zellen, die in diesem Protokoll verwendeten sollte für mindestens drei Generationen nach dem Auftauen von gefrorenem Lager Zellen angebaut werden.
1. Ernte Melanom Zelle abgeleitet Faktoren
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Vorbereitungen
- Erhalten Sie B16F10 Zellen und eine Maus-Melanom-Zell-Linie.
Hinweis: Für dieses Protokoll war eine Maus Melanom-Zelllinie Stammzellenbank der chinesischen Akademie der Wissenschaften entnommen. - Machen Sie einen kompletten Medium für die B16F10-Zellkultur (100 mL). Verwenden Sie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt.
- Machen Sie einem serumfreien Medium für den Hungertod von B16F10 Zellen (50 mL). Verwenden Sie DMEM Medium ohne FBS, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.
- Erhalten Sie B16F10 Zellen und eine Maus-Melanom-Zell-Linie.
-
Bereiten Sie Melanom konditioniertes Medium (CM)
- 2.0 x 105 B16F10 Samenzellen in einem 100 mm Schale FBS DMEM mit 10 mL 10 %. Inkubieren Sie dann die Zellen in einem Inkubator 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 24 h.
- Wenn die Zellen etwa 80 % der Zusammenfluss erreichen, entnehmen Sie das Kulturmedium waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1 X, pH 7,4) und ersetzen Sie das Medium mit einer 10 mL serumfreien Medium für den Hungertod.
- Die Zellen in den Inkubator für 18 – 24 h zurück.
- Nach dem Hunger der konditionierte Medium (CM) mit einer Pipette zu sammeln und überträgt es auf eine frische 50 mL Zentrifugenröhrchen.
Hinweis: Die konditionierte Medium ist der Überstand des B16F10-Zellkulturen. Stellen Sie sicher, dass die B16F10 Zellen in einem guten Zustand sind, vor der Erhebung der CM. - Zentrifugieren der CM für 5 min bei 1000 X g bei 4 ° C.
- Pipette überstand und überträgt es auf ein frisches steriles Röhrchen oder eine Flasche.
Hinweis: Vermeiden Sie aus das Pellet am Boden des Röhrchens pipettieren. - Um die Zelle Ablagerungen zu entfernen, Filtern Sie die CM nach Durchlaufen eines Spritze verbunden 0,45 µm-Filters auf eine sterile Flasche oder Tube.
Hinweis: 0,22 µm Filter sind optimal für die Filterung der CM. - Speichern Sie die gefilterten Überstand bei-20 ° C bis zur Verwendung.
Hinweis: Es empfiehlt sich nicht, den Überstand bei-20 ° C für mehr als einen Monat zu speichern. Alternativ speichern Sie die CM bei-80 ° C für mehr längere Zeit für die Differenzierung von Adipocyte.
(2) Induktion von Knochenmark Adipozyten durch Melanom Zelle abgeleitet Faktoren
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Vorbereitungen
- 100 mL adipogenen Induktion mittlere28zu machen. Verwenden Sie eine komplette DMEM mit 5 µg/mL Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin und 1 µM Dexamethason ergänzt. Bis zu zwei Wochen bei 4 ° c speichern
- 100 mL adipogenen Wartung Medium vorzubereiten. Verwenden Sie eine komplette DMEM oder gemischt mit 50 % Melanom CM ergänzt mit 5 µg/mL Insulin.
- Machen Sie ein Öl Rot O-Stammlösung. Lösen Sie 30 mg Öl Rot O Pulver in 10 mL Isopropanol (≥ 99.5 % auf) und mischen sie gut durch Wirbel.
Hinweis: Bewahren Sie es bis zu 1 Jahr bei 4 ° C. - Machen Sie eine Öl Rot O funktionierende Lösung. In der Dunstabzugshaube verdünnt das Öl Rot O-Stammlösung (aus Schritt 2.1.3) mit entionisiertem Wasser in einem Verhältnis von 3:2. Inkubieren Sie die Mischung für 15 min bei Raumtemperatur und Filtern Sie es durch einen 0,22 µm-Filter vor der Verwendung.
Hinweis: Verwenden Sie nur frische Arbeitslösung innerhalb von 2 h.
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Adipocyte Unterscheidung
- Kultur eine Stromale Zelle Linie 14F1.1 aus Maus Knochenmark29 in einer 60 mm Schale mit einer kompletten DMEM bei 80 % Konfluenz in einem Inkubator 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2.
Hinweis: Alternativ ersetzen Sie 14F1.1 mit primären Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Zellen30. - Die Zellen mit 1,5 mL einer 0,25 %-Trypsin-Lösung in einem Inkubator für 1 – 2 min. trypsinize.
- Die Zellen 5 mL 10 % FBS Medium hinzu und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Glas Hemocytometer; passen Sie dann die Zelldichte auf etwa 1 – 2 x 105/mL.
- Samen 5 x 104 14F1.1 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte mit 0,5 mL adipogenen Induktion Medium. Nach zwei Tagen Inkubation erreichen die Zellen etwa 90 % der Zusammenfluss.
Hinweis: Dieser Schritt ist sehr wichtig. Knochenmark-Stromazellen Zellen können nicht zu Adipozyten ohne ein adipogenen Induktion Medium induziert werden. - Die Induktion-Medium entfernen und Waschen der Zellen zweimal mit 1 mL PBS jedes Mal.
- Ändern Sie in 1 mL adipogenen Wartung Medium und weiterhin die Zellen bis Adipocyte Reifung Kultur.
Hinweis: Unter dem Mikroskop Adipozyten sehen aus wie kleine oder große Seifenblasen und sind sehr leicht zu erkennen. In der Regel sind Reifen Adipozyten auf 6th oder 8th Tag vorhanden. - Flecken auf die Reifen Adipozyten mit Öl Rot O oder sammeln die Adipozyten für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse.
- Kultur eine Stromale Zelle Linie 14F1.1 aus Maus Knochenmark29 in einer 60 mm Schale mit einer kompletten DMEM bei 80 % Konfluenz in einem Inkubator 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2.
-
Adipocyte Färbung
- Waschen der differenzierten 14F1.1 Zellen 2 X mit PBS und in 3,7 % Formaldehyd für 1 h zu beheben.
- Spülen Sie die Zellen in 60 % Isopropanol und vollständig trocknen lassen.
- Die Brunnen 0,2 mL Öl Rot O funktionierende Lösung hinzu und bei 0,5 bis 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen mit Wasser um die ungebundene Farbstoffe entfernen.
- Foto der gefärbten Adipozyten unter einem Lichtmikroskop.
3. Coculture des Knochenmarks Adipozyten mit Melanomzellen
-
Vorbereitungen
- Bereiten Sie Reifen Knochen Knochenmark Adipozyten: induzieren der 14F1.1 Zellen in Reife BM Adipozyten in 24-Well-Platten mit dem adipogenen Induktion Medium für 2 Tage, und dann behaupten sie mittelfristig adipogenen Wartung für weitere 6 – 8 Tage.
- Vorbereiten der B16F10 Zellen: die B16F10 in 60 mm Schalen mit 5 mL DMEM Medium Kulturzellen.
- Befeuchten Sie die Membran einfügen (z.B. Transwell): 0,4 µm Porengröße Membran Einsätze 150 µL des FBS-freie DMEM Medium hinzu und Tauchen sie auf den Brunnen 24-Well-Platten mit 500 µL FBS-freie DMEM Medium gefüllt.
-
Coculture Einstellung
- Langsam Pipette aus dem Medium jeder Einsatz.
Hinweis: Zerstören Sie die Membran nicht, wenn das Medium zu entfernen. - Samen der B16F10 Zellen (0/103105106) in die Pore 0,4 µm fügt aus Schritt 3.2.1.
- Ersetzen Sie die adipogenen Wartung Medium in den Vertiefungen mit Reifen Knochenmark Adipozyten aus Schritt 3.1.1. mit 600 µL kompletten DMEM Medium.
- Übertragen Sie die Einsätze, gefüllt mit den B16F10 Zellen (aus Schritt 3.2.2) auf den Brunnen mit der Reife des Knochenmarks Adipozyten (aus Schritt 3.2.3) für die Coculture Experimente.
- 2 Tage inkubieren Sie Kokulturen bei 37 ° C und 5 % CO2 .
- Nach 48 h Inkubation, entfernen Sie die Einsätze der Coculture und dann waschen Sie die Fettzellen 2 X mit 500 µL 1 X PBS.
Hinweis: Optional, kassieren Sie die B16F10 Zellen in den Einschüben für die Analyse benötigt. - Färben Sie die Adipozyten mit Öl Rot O funktionierende Lösung oder sammeln Sie die Adipozyten für qPCR-Analyse.
Hinweis: Siehe Färbeverfahren in Schritt 2.3. - Foto der gefärbten Adipozyten unter einem Lichtmikroskop.
- Langsam Pipette aus dem Medium jeder Einsatz.
4. qPCR Analyse des Adipocyte-spezifischen Gene Signature
- Hinzufügen von 0,5 mL der Ready-to-Use RNA Isolierung Reagenz pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte in die Reife Adipocyte bereit zu erkennen ist.
- Folgen Sie ein Standardprotokoll für die RNA-Gewinnung und die cDNA Synthese31.
- Verwenden Sie die Grundierung für 18 und GAPDH als Kontrolle und CEBPα/β, PPARγ, FABP4, Leptin, Pref-1 oder Adiponectin für die Adipocyte-spezifischen gen-Signatur (Tabelle 1).
- Führen Sie die folgende Reaktion in einem Thermocycler: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 1 s und 60 ° C für 20 s.
- Verwenden Sie die 2–ΔΔCt Methode zur Berechnung die Falte32ändert.
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Representative Results
Im Knochenmark, Adipozyten können in den Tumor Mikroumgebung1,13,33,34,35 in einem frühen Stadium zur Unterstützung der Tumorprogression durch lösliche Faktoren erscheinen oder Osteoclastogenesis6,12,36, vor allem im Zusammenhang mit Fettleibigkeit6,12 und/oder Alterung37aktivieren. Unsere bisherigen Studien1 haben festgestellt, dass die Anzahl der Knochenmark Adipocyte drastisch während der frühen Phase der Melanom-Metastasen zu1Knochen ändert. In der Tat, die Mengen an Fettzellen im Bereich Tumor ansammeln und Wachstum der Tumorzellen im Knochenmark zu unterstützen, wenn die Mäuse gefüttert mit einer fettreichen Diät6, was darauf hindeutet, dass Knochenmark Adipozyten im metastasierten Knochen eine wichtige Rolle spielen könnte Knochenmark Nische37. Das dynamische Übersprechen von Tumorzellen und Knochenmark Adipocyte bleibt jedoch unklar. Daher waren wir mit diesem Thema durch das 2D Coculture System der Knochenmarkzellen Adipocyte und Melanom gewidmet.
Tumor-abgeleitete Faktoren fördern die Differenzierung der Adipozyten Knochenmark:
Abbildung 1 eine stellt einen typischen Workflow zur Induktion des Knochenmarks Adipozyten mit Tumor konditioniertes Medium (TCM). Eine repräsentativere Experiment zeigt 14F1.1 Zellen, vernickelt als Einzelzellen bei einer Dichte von 5 x 10-4 -Zellen pro Bohrloch im Beisein einer adipogenen Induktion Medium in den ersten 2 Tagen, und dann innerhalb des adipogenen Wartung Mediums beibehalten (mit oder ohne TCM) für 6 – 8 Tage. Reife Adipocyte enthält Lipid Tröpfchen; Daher können die differenzierte Adipozyten leicht durch Öl Rot O Färbung (Abbildung 1b) identifiziert und quantifiziert durch qPCR mit einer Adipocyte-spezifischen gen-Signatur (Abbildung 1c).
Überlastung der Melanomzellen induziert de-Differenzierung im Knochenmark Adipozyten:
Tumorzellen können die Umgebung zu überleben, vor allem unter hypoxischen Bedingungen1,4,6ändern. Tumorlast Nebeneffekt auf eine Knochenmark Adipocyte imitieren, führten wir das 2D Coculture System mit einem weiteren Anstieg der Melanom-Zellzahl in der oberen Einsätze (Abbildung 2eine). Abbildung 2 b zeigt, dass die Lipid-Speicherung in den Fettzellen in größerem Umfang auf die höchste Dichte an Melanomzellen (106 Zellen/na) im Vergleich zu den Entzug mit der niedrigsten Frequenz von Melanomzellen vorenthalten wird (103 Zellen / (na ja). Abbildung 2 c stellt ein Gen Profilierung der diese Fettzellen in den Adipozyten in der Coculture. Verglichen mit der Coculture mit der geringsten Dichte von Melanomzellen, Pref-1-Ebene erhöht offensichtlich, und der Ausdruck von Leptin, Adiponektin, FABP4, CEBPβ und PPARγ wurde verringert, was darauf hindeutet, dass die tumorlast sekundäre Wirkung zugeschrieben werden kann die de-Differenzierungsprozess in den Adipozyten. Außerdem könnte eine Überlastung der Tumorzellen Nekrose in Adipozyten38induzieren.
Zusammenfassend haben wir einen gegenläufigen Melanom Zelle-angetrieben Effekt auf Knochenmark Adipozyten durch lösliche Faktoren beobachtet. Der gegenteiligen Effekt auf Knochenmark Adipozyten ist von großem Interesse, was darauf hindeutet, dass Knochenmark Adipozyten dynamisch sind Regulatoren der Tumorzellen metastasize Knochenmark.
Abbildung 1 : Tumor-abgeleitete Faktoren fördern eine Adipocyte Unterscheidung. (ein) zeigt dieses Panel eine schematische Ansicht der die experimentelle Einstellung, welche Verwendungen 14F1.1-Zell-Linien und ein Melanom abgeleitet konditionierten Medium. (b) dieses Panel zeigt die Bildgebung eine differenzierte Knochenmark Adipocyte. (c) dieses Panel zeigt die Analyse einer Adipocyte-spezifischen gen-Signatur von qPCR. TCM = Tumor konditioniertes Medium. qPCR: quantitative Polymerase-Kettenreaktion. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von Wang Et Al. modifiziert 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : -Tumorlast Auswirkungen auf Adipocyte. (ein) dieses Panel zeigt eine schematische Ansicht der experimentellen Einstellung: eine Coculture der 14F1.1-Zell-Linien und Melanomzellen. (b) dieses Panel zeigt die Bildgebung eine Knochenmark Adipocyte im Coculture System. (c) zeigt dieses Fenster eine gen-Profilierung der Adipozyten durch qPCR. qPCR: quantitative Polymerase-Kettenreaktion. Maßstabsleiste = 50 µm. Diese Zahl wurde von Wang Et Al. modifiziert 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Primer | ||
| Gen Namen | Sequenz (5' 3') zu übermitteln | Umgekehrte Sequenz (5' 3') |
| PPARΓ | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPΑ | AAG AGC CGC GAC AAG GC | GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG |
| CEBPΒ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| Leptin | ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC | CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC |
| Pref-1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| Adiponectin | GCG ATA ATA CAT AGC GGC TTC T | GCA GGC ATC CCA GGA CAT C |
Tabelle 1: Tabelle der Zündkapseln für qPCR verwendet.
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Discussion
Kokulturen mit Einsätzen wurden weithin zur Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Das 2D Coculture System ist eine effektive Möglichkeit zu beobachten, wie die beiden Teile durch die zeigten wir hier zwei verschiedene Krebs Zelle-angetrieben Auswirkungen auf Knochenmark Adipozyten, Übersprechen in Vitro. Viele Labore haben diese Methode, um das Übersprechen zwischen Adipozyten und Krebs Zellen6,12,27,39untersuchen genutzt.
Im Allgemeinen ist daher ein 2D Coculture der einfache Ansatz der Zell-Zell-Übersprechen Studie. Allerdings geht es um Vorbereitung einer undifferenzierten Zelllinie für die weitere Forschung, gibt es einige einzigartigen Herausforderungen. In dem hier beschriebenen Protokoll ist Gesundheit und Funktionsstatus der Knochenmark Stromazellen Zelle sehr wichtig für die Differenzierung der Adipozyten. Das Protokoll könnte geändert werden, um die 14F1.1 Zellen durch primäre Knochenmark mesenchymale Stammzellen zu ersetzen. Darüber hinaus ist die Vorinkubation der 14F1.1 Zellen im adipogenen Induktion Medium für mehrere Tage einen weiteren wichtigen Schritt. Ohne diese Vorinkubation Stromazellen Knochenmarkzellen fehl in Adipozyten differenzieren die aufgetreten in unserer und anderer Studien40. Diese Phänomene erklären auch, warum einige ähnliche Protokolle führen zu unterschiedlichen oder sogar gegenläufige Effekte und betonen, wie wichtig eine solche einfache, wiederholbare und ausführliche Protokoll für das Übersprechen Studium der Tumorzellen und Knochenmark Adipozyten können.
Obwohl die 2D Coculture einige wichtige Informationen im Vergleich zu 3D oder ex Vivo Kulturen verlieren kann, bleibt es einfach standardisiert, überwacht und schließlich für die weitere Verwendung20,21,41manipuliert werden. Eine zukünftige Anwendung der Technik beschließen wie ein Osteoblasten ändert, wenn es mit Krebszellen cocultured ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verzollen.
Acknowledgments
Wir danken Dov Zipori (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) freundlicherweise für das Bereitstellen der murinen Knochenmark Stromazellen Zelle Linie 14F1.1. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von der chinesischen National Natural Science Foundation (Nr. 81771729) und der Tropical Hospital von Chongqing Medical University (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
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