Summary
Aquí, presentamos un sistema de cocultivo (2D) bidimensional sencillo y confiable para el estudio de la interacción entre las células del tumor y adipocitos de médula ósea, que revela un doble efecto de factores derivados de células de melanoma en los adipocitos de la médula ósea diferenciación y también representa un método clásico para el estudio mecanístico de la metástasis del hueso.
Abstract
La diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del tumor puede jugar un papel fundamental en el proceso de metástasis del hueso. Una variedad de métodos están disponibles para el estudio de la interferencia significativa; sin embargo, un sistema de dos dimensiones transwell cocultivo sigue siendo un clásico, fiable y fácil para este estudio de la diafonía. Aquí, presentamos un protocolo detallado que muestra el cocultivo de los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma. Sin embargo, un sistema de cocultivo podría no sólo contribuir al estudio de transducciones de señales celulares de las células de cáncer inducidas por adipocitos de médula ósea, pero también al futuro mecanicista estudio de metástasis de hueso que puede revelar nuevas dianas terapéuticas para el hueso metástasis.
Introduction
Las metástasis óseas son frecuentes entre pacientes con cáncer avanzado, pero un tratamiento curativo no está todavía disponible. Más allá de especializado en almacenar energía como grasa, adipocitos pueden apoyar el crecimiento del tumor y metástasis en médula ósea y otros órganos1,2,3,4,5,6. Por otra parte, adipocitos desempeñan un papel esencial en la regulación del cáncer celular biología7,8,9,10 y metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, como así como en hueso metástasis1,4,12. En el nicho de la médula ósea, los adipocitos también pueden afectar el comportamiento biológico del cáncer las células4,6,17. La interacción entre los adipocitos de la médula ósea y las células cancerosas con osteotropism es importante para entender la metástasis del hueso. Sin embargo, poco se sabe.
Basado en los estudios actuales, diversos métodos se aplican a los adipocitos, incluyendo dos o tres dimensiones (2/3D) y ex vivo culturas17,18,19,20,21. Recientemente, Herroon et al. diseñado un nuevo enfoque de la cultura de 3D para el estudio de las interacciones de los adipocitos de la médula ósea con células de cáncer22. Aunque el cocultivo 3D es óptimo para mímico fisiológica interacciones entre adipocitos y el cáncer de células en vivo, sufre una pobre reproducibilidad22,23. En comparación con un sistema de cocultivo 2D, un sistema de cocultivo 3D puede proporcionar diferentes fenotipos celulares, como células morfología21,22,24,25,26. Además, el cultivo ex vivo de fragmentos de tejido aislado de hueso esponjoso puede conducir a un resultado robusto de adipocitos cultivados médula células17.
En contraste con los modelos anteriores, sin embargo, el modelo de cultivo celular 2D sigue siendo una técnica clásica, fiable y fácil para escanear rápidamente moléculas de candidato y los fenotipos cambiados en adipocitos o cáncer células in vitro1, 4,6,12,15,27. Para entender mejor la diafonía entre los adipocitos de la médula ósea y las células del melanoma, proporcionamos un protocolo detallado para un sistema de cocultivo 2D de los adipocitos de la médula ósea con células de melanoma.
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Protocol
Nota: Todas las células utilizadas este protocolo deben ser crecidas durante al menos tres generaciones después de la descongelación de las células comunes.
1. factores derivados de células de Melanoma de la cosecha
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Preparaciones
- Obtener células B16F10 y una línea de células de melanoma de ratón.
Nota: Para este protocolo, se obtuvo una línea de células de melanoma de ratón desde el Banco de células madre de la Academia China de Ciencias. - Hacer un medio completo para cultivo celular B16F10 (100 mL). Uso medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.
- Hacer un medio libre de suero para la inanición de las células de B16F10 (50 mL). Uso de medio sin SFB DMEM, 50 U/mL de penicilina y 50 μg/mL de estreptomicina.
- Obtener células B16F10 y una línea de células de melanoma de ratón.
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Preparar medio condicionado melanoma (CM)
- Las células5 B16F10 semilla 2.0 x 10 100 mm plato con 10 mL de 10% FBS DMEM. Luego incubar las células en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 durante 24 h.
- Cuando las células alcanzan alrededor del 80% de confluencia, eliminar el medio de cultivo, lavan las células dos veces con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1 x, pH 7,4) y reemplazar el medio con 10 mL de medio libre de suero para el hambre.
- Volver las células a la incubadora durante 18 – 24 h.
- Después de la inanición, recoge el medio condicionado (CM) con una pipeta y transferir a un tubo de centrífuga de 50 mL fresco.
Nota: El medio condicionado es el sobrenadante de las culturas de célula B16F10. Asegúrese de que las células B16F10 están en buenas condiciones antes de recoger el CM. - Centrifugue la CM durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C.
- Pipeta el sobrenadante y transferir a un tubo estéril fresca o botella.
Nota: Evite el pipeteo de la pelotilla en la parte inferior del tubo. - Para eliminar los restos celulares, filtro de la CM pasando a través de un filtro de 0.45 μm jeringa conectada en la parte superior un tubo o frasco estéril.
Nota: 0,22 μm filtros son óptimos para el filtrado de la CM. - Guarde el sobrenadante filtrado a-20 ° C hasta su uso.
Nota: Es mejor no almacenar el sobrenadante a-20 ° C durante más de un mes. Alternativamente, guarde el CM a-80 ° C por más largos períodos de tiempo para la diferenciación del adipocito.
2. inducción de los adipocitos de la médula ósea por factores derivados de células de Melanoma
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Preparaciones
- Hacer 100 mL de medio de inducción de adipogenic28. Utilizar un completo DMEM suplementado con 5 μg/mL de insulina, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina y dexametasona μm 1. Almacenar hasta dos semanas a 4 ° C.
- Preparar 100 mL de medio de mantenimiento de adipogenic. Utilizar un DMEM completo o mixto con 50% melanoma CM suplementado con 5 μg/mL de insulina.
- Preparar una solución stock de aceite rojo O. Disolver 30 mg de polvo de aceite rojo O en 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) y mezclar por vortex.
Nota: Almacenar hasta 1 año a 4 ° C. - Hacer una solución de aceite rojo O de trabajo. En la capilla del humo, diluya la solución stock de aceite rojo O (en el paso 2.1.3) con agua desionizada en la proporción 3:2. Incubar la mezcla por 15 min a temperatura ambiente y filtrar con un filtro de 0,22 μm antes de su uso.
Nota: Sólo use la solución de trabajo fresca dentro de 2 h.
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Diferenciación del adipocito
- Cultura una célula stromal línea 14F1.1 de médula ósea de ratón29 en un plato de 60 mm con un DMEM completo en el 80% de confluencia en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2.
Nota: Como alternativa, cambie 14F1.1 con células mesenquimales derivadas de médula ósea primaria30. - Trypsinize las células con 1,5 mL de una solución de tripsina 0,25% en una incubadora durante 1 – 2 minutos.
- Añadir 5 mL de 10% FBS medio a las células y contar el número de células con un hemocitómetro de vidrio; Luego, ajustar la densidad celular a cerca de 1 – 2 x 105/ml.
- Semilla 5 x 104 de 14F1.1 células por pocillo en una placa de 24 pozos con 0,5 mL de medio de inducción de adipogenic. Después de dos días de incubación, las células alcanzan alrededor del 90% de confluencia.
Nota: Este paso es muy importante. Células estromales de médula ósea no pueden ser inducidas a adipocitos sin un medio de inducción de adipogenic. - Retire el medio de inducción y lavan las células dos veces con 1 mL de PBS cada vez.
- Cambie a 1 mL de medio de mantenimiento de adipogenic y siga a las células de la cultura hasta la maduración del adipocito.
Nota: Bajo el microscopio, adipocitos como pompas de jabón pequeñas o grandes y son muy fáciles de reconocer. Generalmente, adipocytes maduros están presentes en la 6th odía 8 . - Los adipocitos maduros con aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para un análisis de polimerasa cuantitativa (qPCR) la reacción en cadena.
- Cultura una célula stromal línea 14F1.1 de médula ósea de ratón29 en un plato de 60 mm con un DMEM completo en el 80% de confluencia en una incubadora de 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2.
-
Tinción de adipocito
- Lavado 14F1.1 diferenciadas las células x 2 con PBS y fijar en formol de 3,7% durante 1 hora.
- Enjuague las células en isopropanol al 60% y deje que se sequen completamente.
- Añadir 0,2 mL de la solución de trabajo de aceite rojo O a los pocillos e incubar a temperatura de 0.5 a 2 h.
- Lavar las células con agua para remover los tintes no consolidados.
- Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.
3. cocultivo de los adipocitos de la médula ósea con células de Melanoma
-
Preparaciones
- Preparación de hueso maduro adipocitos médula: inducir a las células 14F1.1 en adipocytes maduros de BM en placas de 24 pocillos con el medio de inducción de adipogenic durante 2 días y mantenerlas en el medio de mantenimiento de adipogenic para 6 – 8 días adicionales.
- Preparar las células B16F10: cultura las células B16F10 en platos de 60 mm con 5 mL de medio DMEM.
- Humedecer la inserción de la membrana (e.g. transwell): Añadir 150 μL de medio DMEM libre de FBS a los 0,4 μm tamaño de poro de membrana insertos y sumergirlos en los pocillos de las placas de 24 pocillos con 500 μl de medio DMEM libre de FBS.
-
Ajuste de cocultivo
- Lentamente pipeta fuera el medio de cada inserto.
Nota: No destruyen la membrana al quitar el medio. - Semillas las células B16F10 (0/103105106) en los poros de 0.4 μm rellenos de paso 3.2.1.
- Reemplazar el medio de mantenimiento de adipogenic en los pozos con los adipocitos maduros de la médula del paso 3.1.1. con 600 μl de medio DMEM completo.
- La transferencia de los insertos con las células B16F10 (del paso 3.2.2) en los pozos con los adipocitos maduros de la médula (en el paso 3.2.3) para los experimentos de cocultivo.
- Incubar cocultures a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 días.
- Después de 48 h de incubación, quite los insertos del cocultivo y luego lavar los adipocitos 2 x con 500 μl de PBS 1 x.
Nota: Opcionalmente, recoger las células B16F10 en los insertos para el análisis si es necesario. - Los adipocitos con la solución de trabajo de aceite rojo O la mancha o recoger los adipocitos para análisis de qPCR.
Nota: Consulte el procedimiento de tinción en el paso 2.3. - Foto los adipocitos teñidos bajo el microscopio de luz.
- Lentamente pipeta fuera el medio de cada inserto.
4. Análisis de la Gene Signature Adipocyte-específico de qPCR
- Agregar 0,5 mL de reactivo de aislamiento de RNA listo para su uso por pozo en una placa de 24 pocillos que adipocito maduro está listo para detectar.
- Seguir un protocolo estándar para la extracción de RNA y la síntesis del cDNA del31.
- Utilice la cartilla para 18S y GAPDH como control y CEBPα/β, PPARy, FABP4, leptina, Pref-1 o la adiponectina para la firma de gene adipocyte-específico (tabla 1).
- Ejecute la siguiente reacción en un termociclador: 95 ° C por 20 s, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 1 s y 60 ° C por 20 s.
- Utilice el método 2 deΔΔCt de–para calcular que el pliegue cambia32.
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Representative Results
En la médula ósea, pueden aparecer adipocitos en el microambiente de tumor de13,1,33,34,35 en una etapa temprana para apoyar la progresión del tumor a través de factores solubles o activación de osteoclastogénesis6,12,36, especialmente en el contexto de obesidad6,12 o envejecimiento37. Nuestros anteriores estudios1 han señalado que el número de adipocitos de médula ósea cambia dramáticamente durante la etapa temprana de metástasis de melanoma al hueso1. De hecho, las cantidades de los adipocitos se acumulan en el área del tumor y apoyan el crecimiento de las células tumorales en la médula ósea cuando los ratones alimentaron con una dieta alta en grasas6, sugiriendo que adipocitos de médula ósea podrían desempeñar un papel significativo en el hueso metastásico médula del lugar37. Sin embargo, la interferencia dinámica de las células del tumor y la médula adipocito sigue siendo confuso. Por lo tanto, nos dedicamos a abordar esta cuestión por el sistema 2D de cocultivo de células de médula ósea adipocito y melanoma.
Tumor derivado de factores promueven la diferenciación de los adipocitos de la médula ósea:
Figura 1 una representa un flujo de trabajo típico para la inducción de adipocitos de médula ósea con medio condicionado por el tumor (TCM). Un experimento representativo indica 14F1.1 células, plateado como las células con una densidad de 5 x 104 células por pocillo en presencia de un medio de inducción de adipogenic en los primeros 2 días y luego mantenerse en el medio de mantenimiento de adipogenic (con o sin TCM) durante 6 a 8 días. Adipocito maduro contiene gotitas del lípido; por lo tanto, los adipocitos diferenciados pueden ser fácilmente identificados por aceite rojo O manchas (figura 1b) y cuantificados por qPCR con una firma de gene adipocyte-específico (figura 1c).
Sobrecarga de células de melanoma induce la diferenciación de adipocitos de médula ósea:
Las células tumorales pueden modificar el ambiente para sobrevivir, especialmente bajo condiciones hipóxicas1,4,6. Para imitar un efecto secundario de la carga tumoral en un adipocito de la médula ósea, se realizó el sistema de cocultivo 2D con un continuo aumento del número de células de melanoma en las inserciones superiores (figura 2a). Figura 2b muestra que el almacenamiento de lípidos en los adipocitos es privado en mayor medida a la mayor densidad de células de melanoma (106 células/pocillo) en comparación con la privación en la frecuencia más baja de células de melanoma (103 células / bien). Figura 2 c presenta un perfil de génica de estos adipocitos en adipocitos en el cocultivo. Comparado con el cocultivo con menor densidad de células de melanoma, pref-1 nivel obviamente aumentó y disminuyó la expresión de la leptina, adiponectina, FABP4, CEBPβ y PPARy, que sugiere que el efecto secundario de la carga del tumor puede ser atribuido a el proceso de la diferenciación de los adipocitos. Además, una sobrecarga de las células tumorales podría inducir necrosis de adipocitos38.
En Resumen, se observó un efecto basada en células de melanoma opuesto en los adipocitos de la médula ósea por factores solubles. El efecto contrario en los adipocitos de la médula ósea es de gran interés, lo que sugiere que los adipocitos de la médula ósea son dinámicos reguladores de la célula del tumor metastatizan a médula ósea.
Figura 1 : Tumor derivado de factores promueven una diferenciación del adipocyte. (a) este panel muestra una vista esquemática de la configuración experimental que utiliza 14F1.1 célula líneas y un medio condicionado melanoma derivado. (b) este panel muestra la proyección de imagen de un adipocito diferenciado de la médula. (c) este panel muestra el análisis de una firma de gene adipocyte-específico por qPCR. TCM = medio condicionado por el tumor. qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Barra de escala = 50 μm. Esta figura ha sido modificada de Wang et al. 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Efectos de la carga tumoral en adipocito. (a) este panel muestra una vista esquemática de la configuración experimental: un cocultivo de células de melanoma y 14F1.1 líneas de celulares. (b) este panel muestra la proyección de imagen de un adipocito de médula ósea en el sistema de cocultivo. (c) este panel muestra un perfil de génica de los adipocitos por qPCR. qPCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Barra de escala = 50 μm. Esta figura ha sido modificada de Wang et al. 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cartillas de | ||
| Nombre gen | Adelante la secuencia (5' a 3') | Invertir secuencia (5' a 3') |
| PPARY | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPΑ | AAG AGC CGC GAC AAG GC | GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG |
| CEBPΒ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| Leptina | ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC | CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC |
| Pref-1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| Adiponectina | GCG ATA ATA GATO AGC GGC TTC T | GCA CGG ATC CCA GGA CAT C |
Tabla 1: Tabla de los primers utilizados para qPCR.
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Discussion
Cocultures con inserciones han sido ampliamente utilizados para el estudio de las interacciones célula a célula. El sistema de cocultivo 2D es un modo eficaz de observar cómo las dos piezas diafonía en vitro, por la que aquí mostramos dos diferentes basados en celular efectos en los adipocitos de la médula ósea. Muchos laboratorios han utilizado este método para investigar la diafonía entre los adipocitos y cáncer células6,12,27,39.
En general, por lo tanto, un cocultivo 2D es el mejor acercamiento sencillo para el estudio de la interferencia de célula a célula. Sin embargo, cuando se trata de preparar una línea de células indiferenciadas para futuras investigaciones, hay algunos desafíos únicos. En el protocolo descrito aquí, la salud y el estado funcional de las células estromales de la médula ósea es muy crítico para la diferenciación de adipocitos. El protocolo podría ser modificado para reemplazar las células 14F1.1 con células madre mesenquimales de médula ósea primaria. Además, la preincubación de las células 14F1.1 en el medio de inducción de adipogenic durante varios días es un paso crítico. Sin este pre-incubación, las células del estroma de la médula ósea no diferenciarse en adipocitos, que se ha detectado en nuestro y otros estudios40. Estos fenómenos también explican por qué algunos protocolos similares pueden provocar diferentes o incluso enfrente de efectos y destacar la importancia de un protocolo detallado, repetible y fácil para el estudio de la interferencia de las células del tumor y la médula adipocitos.
Aunque el cocultivo 2D puede perder cierta información crítica en comparación con cultivos 3D o ex vivo , sigue siendo fácil de ser estandarizado, supervisar y eventualmente manipular para más uso20,21,41. Una futura aplicación de la técnica puede decidir cómo un osteoblasto cambia cuando es morfología con las células cancerosas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dov Zipori (el Instituto Científico Weizmann, Rehovot, Israel) amablemente nos proporciona las células estromales de médula ósea murina línea 14F1.1. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (Nº 81771729) China y la Universidad Hospital de Yongchuan de Chongqing médica (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
References
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