Summary
ここでは、提案する、信頼性が高く、簡単な二次元 (2 D) 共培養系における骨髄脂肪細胞の悪性黒色腫細胞由来因子の二重効果を明らかにする腫瘍細胞と骨髄脂肪細胞間の相互作用の分化と骨転移機構の解明のための古典的な方法をまたポーズします。
Abstract
骨髄脂肪細胞と腫瘍細胞間クロストークは、骨転移の過程において重要な役割を再生可能性があります。さまざまな方法があります; 重要なクロストークを勉強ただし、共の二次元 transwell システムは古典的な信頼性の高い、このクロストークの研究のための簡単な方法。ここでは、骨髄の脂肪細胞と悪性黒色腫細胞の培養を示す詳細なプロトコルを提案する.それにもかかわらず、このような培養システム可能性がありますだけでなく骨髄脂肪細胞によるがん細胞の細胞シグナル伝達の研究に貢献、骨の新しい治療上のターゲットを明らかにすることが骨転移の研究機構の将来にも転移。
Introduction
骨転移は進行癌患者の間で広まっているが、根治療法はまだ使用できません。脂肪としてエネルギーを格納することに特化したを超えて脂肪細胞は骨髄や他臓器1,2,3,4,5,6で腫瘍の成長と転移をサポートできます。また、脂肪細胞はがん細胞生物学7,8,9,10と代謝4,11,12 の調節に重要な役割を果たしてください。 ,13,14,15,16、よくように骨転移1,4,12として。骨髄ニッチで脂肪細胞は癌細胞4,6,17の生物学的態度も影響します。骨髄脂肪細胞と癌 osteotropism 細胞間の相互作用は骨転移の理解のために重要です。しかし、少しは知られています。
現在の研究に基づいて、さまざまな方法は、2 または 3 次元 (2 D)/前のヴィヴォ文化17,18,19,20,21を含む脂肪細胞に適用されます。最近、Herroonらは、癌細胞22骨髄脂肪細胞の相互作用を研究する新しい 3 D 文化のアプローチを設計されています。3 D 共が生理学的な模倣するため最適な脂肪細胞と癌との間の相互作用が生体内で細胞、それは再現性に乏しく22,23から苦しんでいます。2次元培養システムと比較して、3 D の共培養系細胞形態21,22,24,25,26などの別の細胞表現型があります。さらに、孤立した海綿骨の組織片の前のヴィヴォ文化は、培養した骨髄細胞17から脂肪細胞の堅牢な副産物につながります。
これらの以前のモデルとは対照的しかし、2次元細胞培養モデル古典的な信頼性、および簡単な手法のままさっと候補分子と表現型の脂肪細胞やがんの変更細胞の in vitro1、 4,6,12,15,27.骨髄脂肪細胞と悪性黒色腫細胞間クロストークを理解、悪性黒色腫細胞の骨髄脂肪細胞の 2次元培養システムの詳細なプロトコルを提供します。
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Protocol
注: このプロトコルで使用されているすべてのセルは冷凍ストック細胞から解凍後少なくとも 3 世代にわたる栽培にする必要があります。
1. 悪性黒色腫細胞由来因子を収穫します。
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準備
- B16F10 細胞およびマウスのメラノーマ細胞株を取得します。
注: このプロトコル マウス黒色腫細胞株は中国科学院の幹細胞バンクから得られました。 - B16F10 細胞培養 (100 mL) のための完全な媒体を作る。ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 50 U/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL を添加したを使用します。
- B16F10 細胞 (50 mL) の飢餓の無血清培地を作る。DMEM FBS なし中、50 U/mL、ペニシリンとストレプトマイシンの 50 μ g/mL を使用します。
- B16F10 細胞およびマウスのメラノーマ細胞株を取得します。
-
悪性黒色腫エアコン メディア (CM) の準備します。
- 100 mm の種子 2.0 × 105 B16F10 細胞皿 10 %10 mL FBS DMEM。その後、24 時間 5% CO2の雰囲気の中で 37 ° C の定温器で細胞を孵化させなさい。
- セルが合流の約 80% に達したら、培養培地を削除、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1 x, pH 7.4) の 5 mL で 2 回洗浄し、10 ml の無血清培地、飢餓の媒体を置き換えます。
- 18-24 h のためのインキュベーターにセルを返します。
- 飢餓後、ピペットと馴化培地 (CM) を収集し、新鮮な 50 mL の遠心管にそれを転送します。
注: 馴化培地は B16F10 細胞培養上清です。B16F10 細胞が CM を収集する前に良好な状態であることを確認します。 - 遠心分離機の 4 ° C で 1,000 x gで 5 分間 CM
- 上澄みをピペットし、新鮮な滅菌チューブやボトルにそれを転送します。
メモ: は、管の下部にペレットをピペッティングしないでください。 - 細胞の残骸を削除するには、滅菌ボトルやチューブの上に注射器に接続された 0.45 μ m フィルターを通過して CM をフィルターします。
注: 0.22 μ m のフィルターは、CM を濾過に最適。 - -20 ° C でフィルター処理された上澄みを使用するまで保存します。
注: 1 ヶ月以上の-20 ° C で培養上清に格納しないことお勧めします。また、脂肪細胞の分化のための時間のより長期間にわたって-80 ° C で CM を格納します。
2. 悪性黒色腫細胞由来因子による骨髄脂肪細胞の誘導
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準備
- 脂肪分化誘導培地28の 100 mL を作る。5 μ g/ml の 1 μ M デキサメタゾン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、インスリンの完全な DMEM を使用します。4 ° C で 2 週間にそれを蓄える
- 脂肪細胞培養用培地の 100 mL を準備します。完全な DMEM を使用または 50% 黒色 CM インスリンの 5 μ G/ml を添加した混合します。
- オイル赤 O 原液を作る。オイル赤 O 10 mL のイソプロパノール (≥ 99.5%) の粉の 30 mg を溶解し、渦によってよく混ぜます。
注: が 4 ° C で 1 年間保存します。 - オイル赤 O 作業ソリューションを確認します。発煙のフードを 3:2 の比率で脱イオン水 (ステップ 2.1.3) からオイル赤い O 原液を希釈します。室温で 15 分間混合物を孵化させなさいし、使用前に 0.22 μ m のフィルターをフィルター処理します。
注: のみ、2 時間以内の新鮮な作業ソリューションを使用します。
-
脂肪細胞分化
- 文化間質細胞は、マウス骨髄29 5% CO2の雰囲気の中で 37 ° C の定温器で 80% の confluency に完全な DMEM に 60 mm ディッシュから 14F1.1 をラインします。
注: または、プライマリの骨髄由来の間葉系細胞3014F1.1 に置換します。 - 1-2 分のインキュベーターで 0.25% トリプシン溶液 1.5 mL でセルを trypsinize します。
- セルに 10 %fbs 培地 5 mL を追加し、ガラス検定; とセル数をカウント1-2 105/mL x 約細胞密度を調整します。
- 5 × 104 /24 ウェル プレートのウェル 14F1.1 細胞の脂肪分化誘導培地の 0.5 mL の種子します。孵化の 2 日後、電池が合流の約 90% に達する。
注: この手順は非常に重要です。骨髄間質細胞は、脂肪細胞脂肪分化誘導培地なしに誘導することはできません。 - 誘導培地を取り外して、洗浄をするたびに 1 mL の PBS で 2 回。
- 脂肪細胞培養用培地 1 mL に変更し、脂肪細胞の成熟まで、細胞の培養を続行します。
注: 顕微鏡の下では、脂肪細胞が大小のシャボン玉のように見えるし、認識し非常に易い。通常、成熟脂肪細胞は 6番目または 8番目の日であります。 - オイル赤 O と成熟脂肪細胞を染色または量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 分析のため脂肪細胞を収集します。
- 文化間質細胞は、マウス骨髄29 5% CO2の雰囲気の中で 37 ° C の定温器で 80% の confluency に完全な DMEM に 60 mm ディッシュから 14F1.1 をラインします。
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脂肪細胞の染色
- 洗って差別化された 14F1.1 は細胞の PBS で 2 倍、1 h の 3.7% のホルムアルデヒドでそれらを修正します。
- 60% イソプロパノールで細胞を洗い、完全に乾かします。
- 井戸にオイル赤い O 作業溶液 0.2 mL を追加し、0.5 ~ 2 時間室温でインキュベートします。
- 非連結の色素を削除する水で細胞を洗浄します。
- 光学顕微鏡の下で染められた脂肪細胞を写真します。
3. 悪性黒色腫細胞の骨髄脂肪細胞の共培養
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準備
- 成熟した骨の骨髄脂肪細胞を準備: 2 日間成熟した BM 脂肪脂肪分化誘導培地で 24 ウェル プレートに 14F1.1 細胞を誘導し、さらに 6-8 日間脂肪細胞維持培地でそれらを維持します。
- B16F10 細胞を準備: DMEM 培地 5 mL を 60 mm 料理 B16F10 細胞の培養します。
- 膜挿入 (例えばtranswell) を湿らせて: 0.4 μ m 孔サイズの膜挿入に FBS 無料 DMEM 培地の 150 μ L を追加し、FBS 無料 DMEM 培地 500 μ L でいっぱい 24 ウェルの井戸にそれらを浸します。
-
共設定
- 各挿入の中をゆっくりとピペット。
メモ: メディアを削除する場合は、膜を破壊しません。 - 3.2.1 のステップからシード 0.4 μ m の細孔内 B16F10 細胞 (0/103105106) を挿入します。
- 3.1.1 のステップから成熟した骨髄脂肪細胞脂肪細胞維持培地の井戸に置き換えます。完全 DMEM 培地の 600 μ L。
- (ステップ 3.2.2) から (ステップ 3.2.3) から成熟した骨髄脂肪細胞培養実験の井戸に B16F10 細胞でいっぱい挿入を転送します。
- 2 日間の 37 ° C および 5% の CO2の共培養系を孵化させなさい。
- 培養 48 時間後、共のドライブベイ カバーを取り外すし、2 脂肪細胞を洗う 500 μ L の 1x PBS で x。
注: 必要な場合必要に応じて、分析用インサートの B16F10 細胞を収集します。 - オイル赤 O 作業ソリューションと脂肪細胞を染色または qPCR 分析のため脂肪細胞を収集します。
注: は、2.3 の手順で染色の手順を参照してください。 - 光学顕微鏡の下で染められた脂肪細胞を写真します。
- 各挿入の中をゆっくりとピペット。
4. qPCR 脂肪細胞特異遺伝子の署名の分析
- 24 ウェル プレートのウェルあたり使える - RNA 分離試薬 0.5 mL を追加、どの成熟脂肪細胞を検出する準備ができています。
- RNA の抽出および cDNA 合成31の標準的なプロトコルに従います。
- コントロール、CEBPα/β、ppar γ、FABP4、レプチン、県 1、アディポネクチンは脂肪細胞特異的遺伝子の署名 (表 1) のため、18 歳未満と GAPDH のプライマーを使用します。
- サーマルサイクラーに次の反作用を実行: 95 ° C、20 s、95 ° C の 1 のための 40 のサイクルに続いて s、および 60 ° C、20 s。
- 2-ΔΔCtメソッドを使用して、折り目変更32を計算します。
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Representative Results
骨髄、脂肪細胞が腫瘍微小環境1,13,33,34,35に可溶性因子を介して腫瘍の進行をサポートするための初期段階で表示できるか破骨細胞形成6,12,36, 特に肥満6,12および/または加齢37のコンテキストをアクティブにします。私たちの以前の研究1では、骨髄の脂肪細胞の数が1を骨に悪性黒色腫の転移の初期段階で劇的に変化することを指摘しています。確かに、脂肪細胞の量は腫瘍領域で蓄積し、高脂肪食6、骨髄脂肪細胞が骨転移の重要な役割を果たすことを示唆しているにうんざりしたマウス骨髄で腫瘍細胞の成長をサポート骨髄ニッチ37。ただし、腫瘍細胞と骨髄の脂肪細胞のクロストークは不明のまま。したがって、我々 は、2 D の共培養系における骨髄脂肪細胞と悪性黒色腫細胞ので、この問題に対処するために専用されていた。
腫瘍由来因子は骨髄の脂肪細胞の分化を促進します。
図 1腫瘍条件培地 (TCM) で骨髄脂肪細胞を誘導するための典型的なワークフローを表します。代表的な実験を示します 14F1.1 セル、最初の 2 日間で脂肪分化誘導培地の存在下でウェルあたり 5 x 10 の4セルの密度にある単一セルとしてメッキし脂肪細胞維持培地の内で維持される (でまたはTCM) なしの 6-8 日間。成熟した脂肪細胞に脂質液滴; が含まれていますしたがって、分化した脂肪細胞とが簡単オイル赤 O 染色 (図 1b) によって識別される脂肪細胞特異的遺伝子の署名 (図 1c) と qPCR による定量化します。
オーバー ロード メラノーマ細胞の骨髄脂肪細胞に分化させる解消。
腫瘍細胞は、特に低酸素の条件1,4,6の下で生き残るために環境を変更できます。骨髄の脂肪細胞に腫瘍負荷の二次的効果を模倣するには、上部の挿入 (図 2、) の悪性黒色腫細胞数の増加と 2次元培養システムを実行しました。図 2 bはメラノーマ細胞の最も低い周波数剥奪と比較して悪性黒色腫細胞 (106細胞/ウェル) の最も高い密度で大きい程度に脂肪細胞内脂質の記憶域を奪われたことを示しています (10 の3セル/まあ)。図 2cは、共に脂肪細胞でこれらの脂肪細胞の遺伝子プロファイルを示します。最も密度の低い悪性黒色腫細胞の培養と比較して、県 1 レベルは明らかに、増加し、レプチン、アディポネクチン、FABP4、CEBPβ、および ppar γ の発現は減少した、腫瘍負荷の二次的効果に起因することを示唆しています。脂肪細胞の分化の解消。その上、腫瘍細胞のオーバー ロードは、壊死脂肪細胞38を引き起こすことができます。
要約すると、液性因子による骨髄の脂肪細胞に反対黒色セル駆動効果を観察しました。骨髄脂肪細胞の反対の効果は高金利、骨髄脂肪細胞が動的であることを示唆しているの腫瘍細胞のレギュレータは、骨髄に転移。
図 1:腫瘍由来因子は、脂肪細胞の分化を促進する。(、) このパネルに表示されますを使用して 14F1.1 細胞株および悪性黒色腫由来の馴化培地、実験的設定の概略図。(b) このパネルは分化型骨髄脂肪細胞のイメージングを示しています。(c) このパネルは qPCR による脂肪細胞特異的遺伝子の署名の分析を示しています。TCM 腫瘍調整培を =。qPCR: 量的なポリメラーゼの連鎖反応。スケールバー = 50 μ m。この図は、王らから変更されています。1この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2:脂肪細胞に腫瘍負荷影響します。実験的設定の概略図を示しています (、) のこのパネル: 14F1.1 細胞と悪性黒色腫細胞の培養。(b) このパネルは、共培養系における骨髄脂肪細胞のイメージングを示しています。(c) このパネルは、qPCR による脂肪細胞の遺伝子プロファイルを示しています。qPCR: 量的なポリメラーゼの連鎖反応。スケールバー = 50 μ m。この図は、王らから変更されています。1この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
| プライマー | ||
| 遺伝子名 | 転送シーケンス (5' 3') | 逆にシーケンス (5' 3') |
| PPAR Γ | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPΑ | AAG AGC シージーシー GAC AAG GC | GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG |
| CEBPΒ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| レプチン | ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC | CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC |
| 県 1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| アディポネクチン | GCG ATA 猫 ATA AGC GGC TTC T | GCA GGC ATC CCA GGA 猫 C |
QPCR 用プライマーのテーブル 1: テーブル。
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Discussion
挿入して共培養系は、細胞間相互作用の研究に広く使用されています。2次元培養システムは、どのように二つの我々 はここで骨髄脂肪細胞の 2 つの異なった癌セル駆動の効果を示した生体外クロストーク、部分を観察する効果的な方法です。多くのラボでは、脂肪細胞と癌細胞6,12,27,39間のクロストークを調査するこのメソッドを活用しています。
一般に、したがって、2次元培養の細胞間クロストークの検討に直球です。しかし、さらなる研究の未分化細胞ラインの準備に関しては、いくつかのユニークな課題があります。ここで説明したプロトコルで骨髄間質細胞の機能状態は脂肪細胞分化の非常に重要です。プロトコルは、プライマリの骨髄間葉系幹細胞 14F1.1 細胞を置き換えるに修正できます。さらに、数日間 14F1.1 セル脂肪分化誘導培地での前培養は別の重要なステップです。この前の培養骨髄間質細胞が必ず脂肪細胞に分化するが検出されている私たちと他の人の研究40。これらの現象は、なぜいくつかの類似したプロトコル可能性があります異なるあるいは反対の作用の結果、骨髄脂肪細胞と腫瘍細胞のクロストーク研究のような簡単、再現性、および詳細なプロトコルの重要性を強調もについて説明します。
2 D の共は、3 D または前のヴィヴォの文化と比較していくつかの重要な情報を失う可能性がありますが、簡単に標準化、監視、および最終的にさらに使用20,21,41操作まま。それは癌細胞の遊走はときに、骨芽細胞がどのように変化するか、技術の将来のアプリケーションがあります。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
我々 は骨髄間質細胞をご提供するため親切ドヴ ・ Zipori (ワイツマン科学研究所、レホヴォト、イスラエル) に感謝 14F1.1 ラインします。本研究は、中国国家自然科学基金 (第 81771729)、永川病院の重慶医科大学 (Nos からの補助金によって支えられました。YJQN201330;YJZQN201527)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
References
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