Summary
여기, 우리 골 adipocytes에 흑색 종 세포 유래 요인의 이중 효과 보여준다 종양 세포와 골 adipocytes, 사이 상호 작용을 공부 하기 위한 안정적이 고 간단한 2 차원 (2D) coculture 시스템 제시 차별화 및 뼈 전이의 기계 론 적인 연구에 대 한 전통적인 방법 포즈.
Abstract
골 adipocytes와 종양 세포 사이 누화 뼈 전이 하는 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 다양 한 방법 공부 하는 중요 한 누화; 사용할 수 있습니다. 그러나, coculture에 대 한 2 차원 transwell 시스템은 고전적인, 신뢰할 수 있는, 그리고이 누화 연구에 대 한 쉬운 방법 남아 있다. 여기, 우리 골 adipocytes 및 흑색 종 세포의 coculture을 보여 주는 자세한 프로토콜을 제시. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 coculture 시스템 수 골 adipocytes에 의해 유도 된 암 세포의 세포 신호 transductions의 연구에 기여할 뿐만 아니라 또한 기계적으로 뼈에 대 한 새로운 치료 목표를 드러낼 수 있는 뼈 전이의 연구 전이입니다.
Introduction
뼈 전이 고급 암 환자 중 광범위 하지만 치료 치료는 아직 사용할 수 없습니다. 지방으로 에너지를 저장 전문, 넘어 adipocytes 골 수 및 다른 장기1,2,,34,,56에서 종양 성장 및 전이 지원할 수 있습니다. 또한, adipocytes 암 세포 생물학7,,89,10 및 대사4,11,12 조절에 필수적인 역할을 재생 ,13,14,,1516, 잘에서 뼈 전이1,,412로. 골 틈새, adipocytes도 암 세포4,,617의 생물 학적 행동을 달라질 수 있습니다. 골 adipocytes osteotropism와 암 세포 사이 상호 작용에 대 한 뼈 전이의 이해 중요 하다. 그러나, 약간은 알려진 다.
현재 연구를 바탕으로, 다양 한 방법은 adipocytes, 2 또는 3 차원 (2/3 차원)와 비보 전 문화17,,1819,20,21을 포함 하 여 적용 됩니다. 최근, Herroon 그 외 여러분 암 세포22골 adipocytes의 상호 작용을 공부 하는 새로운 3D 문화 접근 방식을 설계 되었습니다. 3D coculture는 생리를 흉내 낸 위한 최적의 adipocytes와 암 사이 상호 작용 세포 vivo에서, 그것은 가난한 재현성22,23에서 고통. 2D coculture 시스템에 비해 3D coculture 시스템 셀 형태학21,22,,2425,26같은 다른 세포질 고기를 제공할 수 있습니다. 또한, 고립 된 수가 뼈 조직 파편의 비보 전 문화 adipocytes의 강력한 파생물 교양된 골 셀17에서 발생할 수 있습니다.
그러나 이러한 이전 모델과 달리, 2D 셀 문화 모델 남아 있다 고전, 안정적이 고 쉽게 기술 생체 외에서1, 세포를 신속 하 게 스캔 후보 분자와 고기 adipocytes 또는 암에 변경에 대 한 4,6,12,,1527. 더 잘 이해 하려면 골 adipocytes와 흑색 종 세포 사이 누화, 우리 흑색 종 세포와 골 adipocytes의 2D coculture 시스템에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
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Protocol
참고:이 프로토콜에서 사용 하는 모든 셀 냉동된 재고 셀에서 녹고 후 적어도 3 세대에 대 한 성장 해야 합니다.
1. 수확 흑색 종 세포 파생 요소
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준비
- B16F10 세포 및 마우스 흑색 종 세포 라인을 얻을.
참고:이 프로토콜에 대 한 마우스 흑색 종 세포 선 과학의 중국 아카데미의 줄기 세포 은행에서 얻은 했다. - B16F10 세포 배양 (100 mL)에 대 한 완벽 한 매체를 확인 합니다. Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린, 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스 보충을 사용 합니다.
- 혈 청 무료 매체 B16F10 세포 (50 mL)의 기아에 대 한 확인 합니다. DMEM 매체 FBS 없이, 페니실린, 50 U/mL 및 50 µ g/mL 스 사용 합니다.
- B16F10 세포 및 마우스 흑색 종 세포 라인을 얻을.
-
흑색 종 조절 매체 (CM)를 준비
- 100 m m에서 씨 2.0 x 105 B16F10 세포 10%의 10 mL와 FBS DMEM 요리. 다음 24 h에 대 한 5% CO2 의 분위기 속에서 37 ° C 배양 기에서 세포를 품 어.
- 셀 합류의 약 80%에 도달, 문화 매체를 제거, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (1x, pH 7.4)의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 10 mL 혈 청 무료 매체는 기아에 대 한 매체를 바꿉니다.
- 18-24 h에 대 한 보육을 셀을 반환 합니다.
- 기아, 후 한 피 펫과 바른된 매체 (CM)를 수집 하 고 신선한 50 mL 원심 분리기 튜브에 그것을 전송.
참고: 조절된 매체 B16F10 세포 배양의 상쾌한입니다. B16F10 세포 CM를 수집 하기 전에 좋은 조건에는 다는 것을 확인 하십시오. - 1000 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 CM을 원심
- 플라스틱은 상쾌한 하 고 신선한 무 균 튜브 또는 병에 그것을 전송.
참고: 아래쪽 튜브의 펠 릿에서 pipetting 하지 마십시오. - 셀 파편 제거, 살 균 병 또는 튜브 주사기 연결 0.45 μ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 CM을 필터링.
참고: 0.22 μ m 필터는 CM을 필터링 하는 데 적합 합니다. - -20 ° C에서 필터링 된 상쾌한 사용까지 저장 합니다.
참고: 그것은-20 ° C에서 상쾌한 1 달 이상에 대 한 저장 하지 것이 좋습니다. 또는, 체형의 분화에 대 한 시간 더 연장된 기간에 대 한-80 ° C에서 CM을 저장 합니다.
2. 흑색 종 세포에서 파생 된 요소에 의해 골 Adipocytes의 유도
-
준비
- Adipogenic 유도 중간28의 100 mL를 확인 합니다. 완전 한 DMEM 인슐린, 0.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 µ M dexamethasone의 5 µ g/mL와 보완을 사용 합니다. 4 ° c.에 2 주까지 저장하시오
- Adipogenic 유지 보수 매체의 100 mL를 준비 합니다. 완전 한 DMEM 사용 또는 50%의 흑색 종 5 µ g/mL의 인슐린으로 보충 하는 CM와 혼합.
- 기름 빨간 O 재고 솔루션을 확인 합니다. 소 프로 파 놀 (≥ 99.5%)의 10 mL에 기름 빨간 O 가루 30 mg을 녹이 고 소용돌이 의해 잘 그들을 믹스.
참고: 4 ° c.에서 1 년 저장 - 기름 빨간 O 작업 솔루션을 확인 합니다. 증기 두건에서 3: 2의 비율에 있는 이온된 수로 (2.1.3 단계)에서 기름 빨간 O 재고 솔루션을 희석. 실 온에서 15 분 동안 혼합물을 품 어 하 고 사용 하기 전에 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
참고:만 2 시간 안에 신선한 작업 솔루션을 사용 합니다.
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체형 차별화
- 문화 stromal 세포 5% CO2의 분위기 속에서 37 ° C 배양 기에서 80 %confluency 완전 한 DMEM와 60 mm 접시에 마우스 골 수29 에서 14F1.1 라인.
참고:은 주 골 수 유래 중간 엽 세포3014F1.1를 또는 바꿉니다. - 1-2 분 동안 인큐베이터에 0.25 %trypsin 솔루션의 1.5 mL와 셀 trypsinize
- 셀에 10 %FBS 매체의 5 mL을 추가 하 고 유리 hemocytometer;와 셀 숫자의 개수 계산 다음 1-2 105/mL x 약 셀 밀도 조정 합니다.
- 씨앗 5 x 104 24-잘 접시에 잘 당 14F1.1 세포의 adipogenic 유도 매체의 0.5 mL와 함께. 2 일 후 부 화, 셀 합류의 약 90%에 도달.
참고:이 단계는 매우 중요 한입니다. 골 수 기질 세포 adipogenic 유도 매체 없이 adipocytes에 유도 될 수 없습니다. - 유도 매체를 제거 하 고 씻어 1 mL의 PBS로 두 번 셀 때마다.
- Adipogenic 유지 보수 매체의 1 mL를 변경 하 고 adipocyte 성숙까지 셀 문화 계속.
참고: 현미경, adipocytes 소형 또는 대형 비누 방울 처럼 모양과 아주 쉽게 인식할 수 있습니다. 일반적으로, 성숙 adipocytes 6번째 또는 8번째 날에는. - 기름 빨간 O와 성숙한 adipocytes 얼룩 또는 adipocytes 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 분석을 위해 수집.
- 문화 stromal 세포 5% CO2의 분위기 속에서 37 ° C 배양 기에서 80 %confluency 완전 한 DMEM와 60 mm 접시에 마우스 골 수29 에서 14F1.1 라인.
-
체형 얼룩
- 워시 차별화 된 14F1.1 세포를 PBS로 2 배 및 1 h 3.7% 포름알데히드에 그들을 수정.
- 60% 소 프로 파 놀 셀 린스를 완전히 건조 하도록 허용 합니다.
- 우물에 기름 빨간 O 작업 솔루션의 0.2 mL를 추가 하 고 0.5 ~ 2 h에 대 한 실 온에서 품 어.
- 셀 언바운드 염료를 제거 하는 물으로 씻는 다.
- 가벼운 현미경 염색된 adipocytes 사진.
3. 흑색 종 세포와 골 Adipocytes의 coculture
-
준비
- 성숙한 뼈 골 수 adipocytes 준비: 2 일, adipogenic 유도 매체와 24-잘 접시에 성숙한 BM adipocytes에 14F1.1 세포를 유발 하 고 다음 추가 6-8 일에 대 한 adipogenic 유지 보수 매체에서 그들을 유지.
- B16F10 세포 준비: DMEM 매체의 5 mL와 60mm 요리에서 B16F10 세포 문화.
- 축 축 하 게 막 삽입 (예: transwell): 0.4 µ m 기 공 크기 막 삽입을 FBS 무료 DMEM 매체의 150 µ L을 추가 하 고 24-잘 접시 가득 FBS 무료 DMEM 매체의 500 µ L의 우물에 그들을 담가.
-
Coculture 설정
- 천천히 각 삽입의 매체에서 피 펫입니다.
주: 매체를 분리할 때 막을 삭제 하지 마십시오. - 3.2.1 단계에서 시드 B16F10 세포 (0/103/105/106) 0.4 µ m 기 공에 삽입합니다.
- 3.1.1 단계에서 성숙 골 adipocytes에 우물에 adipogenic 유지 보수 매체를 바꿉니다. 완전 한 DMEM 매체의 600 µ L와.
- Coculture 실험 (3.2.3 단계)에서 성숙 골 adipocytes와 우물에 (에서 단계 3.2.2) B16F10 세포로 가득 삽입 전송.
- 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 cocultures를 품 어.
- 외피의 48 h 후는 coculture의 삽입을 제거 하 고 다음 씻어 adipocytes 2 x 1 x PBS의 500 µ L.
참고: 필요한 경우 필요에 따라 분석에 대 한 삽입에서 B16F10 세포를 수집 합니다. - 기름 빨간 O 작업 솔루션 adipocytes 얼룩 또는 정량 분석을 위한 adipocytes 수집.
주: 단계 2.3에서에서 착 절차를 참조 하십시오. - 가벼운 현미경 염색된 adipocytes 사진.
- 천천히 각 삽입의 매체에서 피 펫입니다.
4. 정량 분석 체형 관련 유전자 서명의
- 24-잘 접시에서의 준비에 사용 RNA 격리 시 약 잘 당 0.5 mL를 추가 성숙한 체형에 검색할 준비가 되어.
- RNA 추출 및 cDNA 합성31에 대 한 표준 프로토콜을 따릅니다.
- 18S와 GAPDH 뇌관을 사용 하 여 컨트롤 및 CEBPα/β, 가진, FABP4, leptin, Pref-1, 또는 adiponectin 체형 관련 유전자 서명 (표 1)에 대 한.
- 다음 반응 열 cycler에서 실행: 20 95 ° C s 1에 대 한 95 ° C의 40 주기 다음 s 및 20 60 ° C s.
- 2-ΔΔCt 메서드를 사용 하 여 배32변경 계산 하.
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Representative Results
골 수에서 adipocytes 녹는 요인을 통해 종양 진행을 지원 하기 위한 초기 단계에서 종양 microenvironment1,13,33,,3435 에 나타날 수 있습니다 또는 osteoclastogenesis6,,1236, 특히 비만6,12 노화37의 컨텍스트에서 활성화. 우리의 이전 연구1 골 체형의 수1뼈에 흑색 종 전이의 초기 단계 동안 극적으로 변화를 지적 했다. 실제로, adipocytes 양의 종양 영역에서 축적 하 고 쥐 먹이는 높은 지방 다이어트6, 골 adipocytes 전이성 뼈에서 중요 한 역할을 할 수 있습니다 제안 하는 때 골 수 종양 세포의 성장을 지원합니다 골 수37틈새. 그러나, 종양 세포와 골 체형의 동적 누화 불분명 남아 있습니다. 따라서, 우리 골 체형과 흑색 종 세포의 2D coculture 시스템에서이 문제를 해결에 전념 했다.
종양에서 파생 된 요소 골 adipocytes의 차별화 홍보:
그림 1 종양 조절 매체 (TCM)와 골 adipocytes 유도 대 한 일반적인 워크플로 를 나타냅니다. 대표적인 실험 14F1.1 셀, 첫번째 2 일에는 adipogenic 유도 매체 존재 잘 당 5 x 104 셀의 밀도에 단일 셀으로 도금 고 다음 adipogenic 유지 보수 매체 내의 유지 나타냅니다 (로 또는 TCM) 없이 6-8 일. 성숙한 체형 포함 지질 작은 물방울; 따라서, 차별화 된 adipocytes 쉽게 기름 빨간 O 얼룩 (그림 1b)로 식별 되 고 체형 관련 유전자 서명그림 1(c)으로 정량으로 계량.
오버 로드 흑색 종 세포의 골 adipocytes에서 탈 분화 유도:
종양 세포는 특히 hypoxic 조건1,,46에서 살아남으려면 환경을 수정할 수 있습니다. 골 체형에 종양 부담 보조 효과 모방, 우리는 상단 삽입 (그림 2는)에 흑색 종 세포 수의 지속적인된 증가 함께 2D coculture 시스템 수행. 그림 2b 는 adipocytes의 지질 저장 흑색 종 세포의 낮은 주파수 부족에 비해 흑색 종 세포 (106 셀/잘)의 가장 높은 조밀도에 더 큰 범위를 박탈은 보여준다 (103 셀 / 음). 그림 2 c 는 유전자는 coculture에서 adipocytes에서 이러한 adipocytes의 프로 파일링을 제공 합니다. 흑색 종 세포의 낮은 밀도와 coculture와 비교해, pref-1 레벨 증가 명백 하 게, 그리고 Leptin, adiponectin, FABP4, CEBPβ, 및 가진 표현 했다 감소, 종양 부담 보조 효과에 표시 될 수 있습니다 제안 adipocytes에서 탈 분화 과정입니다. 게다가, 종양 세포의 오버 로드 수 adipocytes38괴 사를 유도 하 고 있다.
요약, 우리는 성 요인에 의해 골 adipocytes에 반대 흑색 종 세포 기반 효과 관찰. 높은 관심, 제안 하는 골 수 adipocytes는 동적 골 adipocytes에 반대 효과 종양 세포의 레 귤 레이 터는 골 수에 전이.
그림 1 : 종양에서 파생 된 요소는 체형 차별화 홍보. (한)이이 창에 표시를 사용 하 여 14F1.1 셀 라인 및 흑색 종에서 파생 된 바른된 매체 실험 설정의 도식 보기. (b)이이 패널 차별화 된 골 체형의 이미지를 보여줍니다. (c)이이 패널 정량에 의해 체형 관련 유전자 서명의 분석을 보여줍니다. 한 의학 = 종양 조절 매체. 정량 Pcr: 양적 연쇄 반응. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 체형에 종양 부담 효과. (한)이이 패널 표시 실험 설정의 도식 보기: 14F1.1 셀 라인 및 흑색 종 세포의 coculture. (b)이이 패널 coculture 시스템에서 골 체형의 이미지를 보여줍니다. (c)이이 패널 유전자 프로 파일링 adipocytes의 정량에 의해 표시 됩니다. 정량 Pcr: 양적 연쇄 반응. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림에서 왕 외. 수정 되었습니다. 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 | ||
| 유전자 이름 | 전달 시퀀스 (5' 3') | 역방향 시퀀스 (5' 3') |
| 가진 | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPΑ | 아 그 AGC CGC GAC 아 그 GC | GTC AGC TCC AGC ACC TTG 안내 |
| CEBPΒ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| Leptin | ATC TGA AGC 아 그 CCA TCA GC | CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC |
| Pref-1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| Adiponectin | GCG ATA 고양이 ATA AGC GGC TTC T | GCA GGC ATC CCA GGA 고양이 C |
표 1: 정량에 사용 되는 뇌관의 테이블.
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Discussion
Cocultures 삽입과 셀 상호 작용을 공부 하 널리 사용 되었습니다. 2D coculture 시스템 어떻게 두는 우리가 여기 골 adipocytes에 두 개의 다른 암 세포 기반 효과 보여주는 누화에서 생체 외에서부품을 관찰 하는 효과적인 방법입니다. 많은 연구소는 adipocytes 및 암 세포6,12,,2739사이 누화를 조사 하기 위해이 방법을 활용 하 고 있다.
일반적으로, 따라서, 2D coculture 셀 누화 연구에 가장 간단 접근 이다. 그러나, 그것에 올 때 undifferentiated 셀 라인 추가 연구에 대 한 준비, 몇 가지 독특한 도전 있다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 골 수 기질 세포의 기능 상태를이 adipocytes 차별화에 대 한 매우 중요 합니다. 프로토콜 기본 골 수 간 엽 줄기 세포 14F1.1 세포를 대체 하 수정 될 수 있습니다. 또한, 몇 일 동안 adipogenic 유도 매체에서 14F1.1 셀의 사전 부 화 또 다른 중요 한 단계입니다. 이 전 부이 화 없이 골 수 기질 세포 못합니다 adipocytes로 분화 하는에서 발견 되었습니다 우리의 다른 사람의 연구40. 이러한 현상 또한 설명 왜 일부 유사한 프로토콜 수 있습니다 다른 또는 반대 효과 귀 착될 같은, 반복, 쉽고 자세한 프로토콜의 종양 세포와 골 adipocytes의 누화 연구에 대 한 중요성을 강조 합니다.
2D coculture 3D 나 ex vivo 문화에 비해 몇 가지 중요 한 정보가 손실 될 수 있습니다, 그것을 표준화 하 고, 모니터링 하 고, 결국 추가 사용20,,2141조작할 쉽게 남아 있다. 기술의 미래 응용 프로그램은 osteoblast 때 암 세포와 cocultured는 그것을 변경 하는 방법을 결정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
우리 Dov Zipori (바이 츠만 과학 연구소, Rehovot, 이스라엘) 친절 하 게 제공에 감사 우리 murine 골 수 기질 세포 라인 14F1.1. 이 연구는 중국 국가 자연과학 기초 (81771729 번)과 충칭 의료 Yongchuan 병원 대학 (개에서 교부 금에 의해 지원 되었다 YJQN201330; YJZQN201527)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
References
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