Cancer Research

השפעות כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על בידול Adipocytes מח עצם

Published: August 23, 2018 doi: 10.3791/57329

Juan Wang¹, Jin Wen², Xiao-Xiang Chen¹, Guang-Liang Chen³

¹Department of Rheumatology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, ²Department of Nephrology and Rheumatology, Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, ³Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University

Summary

כאן, אנו מציגים את מערכת אמינה וישירה דו-ממדית (2D) coculture ללמוד את האינטראקציה בין תאים סרטניים adipocytes מח עצם, אשר חושף את אפקט כפול של מלנומה נגזר תא גורמים על adipocytes מח העצם בידול גם מהווה שיטה קלאסי לצורך המחקר מכניסטית של עצם גרורות.

Abstract

Crosstalk בין מח עצם adipocytes תאים סרטניים עשוי לשחק תפקיד קריטי בתהליך של עצם גרורות. מגוון שיטות זמינות עבור הלומדים crosstalk משמעותי; עם זאת, מערכת transwell דו-ממדי עבור coculture נשאר קלאסי, אמינה, בעלת דרך קלה עבור מחקר crosstalk זה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המציג את coculture של מח עצם adipocytes, בתאי מלנומה. למרות זאת, מערכת כזו coculture יכול לתרום המחקר של תא transductions אות של תאים סרטניים המושרה על ידי מח העצם adipocytes אלא גם לעתיד מכניסטית ללמוד על עצם גרורות אשר עלול לגלות מטרות טיפוליות חדשות עבור עצם גרורות.

Introduction

גרורות בעצמות נפוץ בקרב חולי סרטן מתקדם, אך טיפול המרפא אינו זמין עדיין. מעבר המתמחה באחסון אנרגיה כשומן, adipocytes יכול לתמוך הגידול, גרורות במח העצם, שאר האיברים¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. יתר על כן, adipocytes ממלאות תפקיד חיוני בוויסות סרטן התא ביולוגיה⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰ ואת חילוף החומרים⁴^,¹¹^,¹² ^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, כמו גם כמו ב עצם גרורות¹^,⁴^,¹². בנישה מח עצם, adipocytes יכולים להשפיע גם על ההתנהגות הביולוגית של סרטן תאים⁴^,⁶^,¹⁷. יחסי הגומלין בין מח עצם adipocytes תאים סרטניים עם osteotropism היא משמעותית להבנת עצם גרורות. עם זאת, מעט מאוד ידוע.

על סמך המחקרים הנוכחי, שיטות שונות חלות adipocytes, כולל שני - או תלת ממדית (2) / 3יח ו- ex-vivo תרבויות¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. לאחרונה, Herroon. ואח עיצב גישה 3D-תרבות חדשה ללמוד אינטראקציות של מח עצם adipocytes עם סרטן תאים²². אמנם coculture 3D אופטימלי מחקה פיזיולוגיים אינטראקציות בין adipocytes לבין סרטן תאים ויוו, זה סובל מסכן הפארמצבטית²²^,²³. לעומת מערכת 2D coculture, מערכת 3D coculture עשויה לספק פנוטיפים הסלולר שונים, כגון תא מורפולוגיה²¹^,²²^,²⁴^,²⁵^,²⁶. יתר על כן, התרבות שמחוץ שברי רקמת עצם ספוגית מבודד יכול להוביל המוצלח חזקים adipocytes מ מח עצם בתרבית תאים¹⁷.

לעומת דגמים קודמים אלה, עם זאת, המודל התרבות התא 2D נשאר טכניקה קלאסית, אמין וקל עבור במהירות הסריקה מולקולות המועמד, על הפנוטיפים השתנה adipocytes או סרטן תאי במבחנה¹^, ⁴^,⁶^,¹²^,¹⁵^,²⁷. כדי להבין טוב יותר crosstalk בין מח עצם adipocytes בתאי מלנומה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מערכת coculture דו-מימדית של מח עצם adipocytes עם תאי מלנומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל התאים המשמשים פרוטוקול זה צריך להיות בוגר לפחות שלושה דורות לאחר מפשיר מתאי מניות קפוא.

1. הקציר גורמים נגזר תא מלנומה

ההכנות
1. להשיג B16F10 תאים וקו תא מלנומה העכבר.
  הערה: עבור פרוטוקול זה, קו תא מלנומה העכבר הושג מהבנק תאי גזע של האקדמיה הסינית למדעים.
2. להפוך למדיום מלאה לתרבות תא B16F10 (100 מ"ל). השתמש בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 50 U/mL פנצילין ולאחר 50 µg/mL של סטרפטומיצין.
3. להפוך מדיום ללא סרום עבור הרעב של תאי B16F10 (50 מ"ל). השתמש DMEM הבינונית ללא FBS U/mL 50 של פניצילין, µg 50/mL של סטרפטומיצין.
להכין בינוני ממוזגים מלנומה (ס מ)
1. זרע 2.0 x 10⁵ B16F10 בתאים 100 מ מ מגישים עם 10 מ"ל של 10% FBS DMEM. ואז דגירה התאים 37 ° C חממה באווירה של 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
2. כאשר התאים מגיעים כ- 80% של זרימה, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) (1 x, ה-pH 7.4), והחלף המדיום 10 מ"ל ללא סרום בינונית עבור הרעב.
3. להחזיר את התאים החממה במשך 18 – 24 שעות.
4. לאחר הרעב, לאסוף את המדיום ממוזגים (ס מ) עם פיפטה, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה מ"ל.
  הערה: המדיום ממוזגים הוא תגובת שיקוע של התרבויות תא B16F10. ודא כי התאים B16F10 הם במצב טוב לפני איסוף של ס מ.
5. Centrifuge את ס"מ על 5 דקות ב x 1000 גרם -4 מעלות צלזיוס.
6. Pipette את תגובת שיקוע והעבר אותו צינור סטרילי טריים או בקבוק.
  הערה: יש להימנע pipetting את בגדר בתחתית הצינורית.
7. כדי להסיר את שאריות תאים, לסנן את ס מ על ידי העברתו דרך מסנן מיקרומטר 0.45 מזרק המחובר על גבי בקבוק סטרילי או צינור.
  הערה: 0.22 מיקרומטר מסננים הם אופטימליים עבור סינון של ס מ.
8. לאחסן את תגובת שיקוע המסוננות ב-20 ° C עד השימוש.
  הערה: מומלץ לא לאחסן את תגובת שיקוע ב-20 מעלות צלזיוס במשך יותר מחודש. לחלופין, לאחסן את ס"מ ב-80 מעלות צלזיוס לתקופות ממושכות יותר של זמן הבידול של adipocyte.

2. אינדוקציה של מח עצם Adipocytes על ידי גורמים נגזר תא מלנומה

ההכנות
1. להפוך 100 מ של adipogenic אינדוקציה בינונית²⁸. השתמש DMEM מלאה בתוספת 5 µg/mL של אינסולין, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine 1 מיקרומטר דקסמתזון. לאחסן אותו עד שבועיים, 4 מעלות צלזיוס.
2. הכן 100 מ של adipogenic תחזוקה בינוני. השתמש DMEM מלאה או מעורבב עם מלנומה 50% ס מ בתוספת 5 µg/mL של אינסולין.
3. להפוך את פתרון מניות הנפט אדום O. לפזר 30 מ ג של אבקת שמן אדום O ב- 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל (≥ 99.5%) ומערבבים אותם היטב על ידי מערבולת.
  הערה: לאחסן אותו עד 1 שנה-4 מעלות צלזיוס.
4. להפוך את פתרון עובד שמן אדום O. בשכונה fume, לדלל את שמן אדום O מניות הפתרון (מתוך שלב 2.1.3) עם מים יונים על יחס של 3:2. דגירה את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולסנן אותו דרך מסנן מיקרומטר 0.22 לפני השימוש.
  הערה: השתמש רק את הפתרון עובד טריים בתוך שעתיים.
בידול adipocyte
1. תרבות תא סטרומה קו 14F1.1 מן העכבר מח עצם²⁹ בצלחת 60 מ מ עם DMEM מלאה ב- 80% confluency ב חממה 37 ° C באווירה של 5% CO₂.
  הערה: לחלופין, להחליף 14F1.1 תאים mesenchymal הנגזרות מח העצם העיקרי³⁰.
2. Trypsinize התאים עם 1.5 מ של פתרון טריפסין 0.25% באינקובטור למשך 1-2 דקות.
3. הוסף 5 מ של 10% FBS בינוני לתאים ולספור את מספרי הטלפון הנייד עם hemocytometer זכוכית; ואז להתאים את צפיפות התאים עד כ 1-2 x 10⁵/mL.
4. זרע 5 x 10⁴ תאי 14F1.1 לכל טוב לתוך צלחת 24-ובכן עם 0.5 מ של adipogenic אינדוקציה בינוני. אחרי שני ימי דגירה, התאים להגיע כ- 90% של הנהרות.
  הערה: השלב זה קריטי מאוד. תאי סטרומה מח העצם לא יכול להיגרם כדי adipocytes ללא בינוני אינדוקציה adipogenic.
5. להסיר את המדיום אינדוקציה ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS בכל פעם.
6. לשנות ל 1 מ"ל adipogenic תחזוקה בינוני ולהמשיך התרבות התאים עד ההבשלה adipocyte.
  הערה: תחת מיקרוסקופ, adipocytes נראה כמו בועות סבון קטן או גדול, קל מאוד לזהות. בדרך כלל, adipocytes בוגר נוכחים את 6^th או ביום^ה 8.
7. כתם על adipocytes בוגרת עם שמן אדום O או לאסוף את adipocytes עבור ניתוח (qPCR), תגובת שרשרת של פולימראז כמותית.
Adipocyte מכתים
1. לשטוף 14F1.1 הבדיל תאים 2 x עם PBS ותקן אותן בפורמלין 3.7% לשעה.
2. לשטוף את התאים ב- 60% אלכוהול איזופרופיל ולאפשר להם להתייבש לגמרי.
3. הוספת 0.2 מ"ל של הפתרון עובד שמן אדום O הבארות, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 0.5 עד 2 h.
4. לשטוף את התאים עם מים כדי להסיר את צבע לא מאוגד.
5. תמונה של adipocytes צבוע תחת מיקרוסקופ אור.

3. coculture של מח עצם Adipocytes עם תאי מלנומה

ההכנות
1. להכין adipocytes מח עצם בוגרת: זירוז התאים 14F1.1 לתוך adipocytes מוניטור בוגרים ב- 24-ובכן צלחות עם המדיום אינדוקציה adipogenic 2 ימים, ולאחר מכן לשמור אותם בתוך המדיום תחזוקה adipogenic עבור 6-8 ימים נוספים.
2. להכין את התאים B16F10: התרבות התאים B16F10 במנות 60 מ מ עם 5 מ של DMEM בינונית.
3. להרטיב את תותב ממברנה (למשל transwell): להוסיף 150 µL בינוני DMEM נטולת FBS 0.4 µm גודל הנקבוביות ממברנה התוספות, לטבול אותם על הבארות של לוחות 24-ובכן מלא 500 µL של DMEM FBS ללא מדיום.
הגדרת coculture
1. פיפטה לאט את המדיום של כל הוספה.
  הערה: לא מחריבים את הקרום בעת הסרת המדיום.
2. זרע תאי B16F10 (0/10³/10⁵/10⁶) הנקבובית מיקרומטר 0.4 מוסיף מהשלב 3.2.1.
3. החלף המדיום תחזוקה adipogenic ב הבארות adipocytes מח עצם בוגרת מהשלב 3.1.1. עם 600 µL בינוני DMEM מלאה.
4. להעביר את הכיסויים מלא עם תאי B16F10 (מתוך שלב 3.2.2) על הבארות עם adipocytes מח עצם בוגרת (מתוך שלב 3.2.3) עבור הניסויים coculture.
5. תקופת דגירה של cocultures-CO 37 ° C ו-5%₂ של 2 ימים.
6. לאחר 48 שעות של דגירה, הסר את המכסים של coculture ולאחר מכן לשטוף את adipocytes 2 x עם 500 µL ל- 1 x PBS.
  הערה: לחלופין, איסוף התאים B16F10 הכיסויים לניתוח במידת הצורך.
7. מכתים את adipocytes עם הפתרון עובד שמן אדום O או לאסוף את adipocytes לניתוח qPCR.
  הערה: עיין בהליך מכתימים בשלב 2.3.
8. תמונה של adipocytes צבוע תחת מיקרוסקופ אור.

4. qPCR ניתוח של החתימה גנים ספציפיים Adipocyte

להוסיף 0.5 מיליליטר מוכן לשימוש RNA בידוד מגיב לכל טוב לתוך צלחת 24-ובכן adipocyte בוגר אשר הוא מוכן לזהות.
בצע את פרוטוקול תקני עבור החילוץ RNA ו- סינתזה cDNA³¹.
להשתמש ומהצמיגים 18S, GAPDH שליטה, ו CEBPα/β, PPARγ, FABP4, לפטין, לבחירות-1 או אדיפונקטין לחתימה ג'ין adipocyte ספציפי (טבלה 1).
להפעיל את התגובה הבאה הצנטרפוגה תרמי: 95 ° C עבור 20 s, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 1 s ו- C ° 60 20 s.
השתמש בשיטת^ΔΔCt ^–2 כדי לחשב שהקיפול שינויים³².

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במח העצם, adipocytes יכול להופיע גידול microenvironment¹^,¹³^,³³^,³⁴^,³⁵ בשלב מוקדם לתמיכה התקדמות הגידול דרך גורמים מסיסים או הפעלת osteoclastogenesis⁶^,¹²^,³⁶, במיוחד בהקשר של השמנה⁶^,¹² ו/או הזדקנות³⁷. מחקרים קודמים שלנו¹ ציינו כי מספר מח עצם adipocyte משתנה באופן דרמטי במהלך השלב המוקדם של מלנומה גרורות בעצמות¹. ואכן, הכמויות של adipocytes באזור הגידול ולצבור תומך הצמיחה של תאי גידול במח העצם כאשר העכברים נמאס תזונה עתירת שומן⁶, רומז adipocytes מח העצם יכול לשחק תפקיד משמעותי בתוך העצם גרורתי מח נישה³⁷. עם זאת, crosstalk דינמי של תאים סרטניים, מח עצם adipocyte עדיין לא ברור. לכן, אנו מוקדש המטפל בבעיה זו על ידי מערכת coculture דו-מימדית של תאים במח העצם adipocyte, מלנומה.

גורמי גידול, נגזר לקדם את הבידול של מח עצם adipocytes:
איור 1 מייצג רצף עבודה אופייני להשראת מח עצם adipocytes ממוזגים הגידול בינונית (TCM). ניסוי נציג מציין 14F1.1 תאים, מצופה כמו תאים בודדים על צפיפות של תאים⁴ 5 x 10 לכל טוב במעמד בינוני אינדוקציה adipogenic 2 בימים הראשונים ולאחר מכן ויתוחזקו המדיום תחזוקה adipogenic (עם או בלי TCM) 6-8 ימים. Adipocyte בוגר מכיל שומנים בדם טיפות; לכן, adipocytes הבדיל יכול להיות בקלות המזוהה על-ידי שמן אדום O צביעת (איור 1b), לכמת על-ידי qPCR עם חתימה גנים ספציפיים adipocyte (איור 1c).

עומס יתר של תאי מלנומה המניע דה-בידול ב adipocytes מח עצם:
תאים סרטניים יכולים לשנות את הסביבה כדי לשרוד, במיוחד תחת תנאים ובשפתיים¹^,⁴^,⁶. לחקות אפקט משני הגידול-הנטל על adipocyte מח עצם, אנחנו הופיעה המערכת 2D coculture עם עלייה מתמשכת של מלנומה המספר הכיסויים העליונה (איור 2). איור 2b מראה כי האחסון השומנים ב adipocytes שללו במידה רבה יותר על הצפיפות הגבוהה בתאי מלנומה (10⁶ תאים/טוב) לעומת שלילת על התדר הנמוך ביותר של תאי מלנומה (10 תאים³ / טוב). איור 2 ג מציג של ג'ין בניית פרופיל של אלה adipocytes, adipocytes, coculture. בהשוואה של coculture עם הצפיפות הנמוכה בתאי מלנומה, לבחירות-1 רמת גדל כמובן, הביטוי של לפטין אדיפונקטין, FABP4, CEBPβ, PPARγ היה ירד, אשר טוען כי ההשפעה המשני נטל הגידול ניתן לייחס תהליך דה-בידול adipocytes. חוץ מזה, עומס יתר של תאים סרטניים יכולים לגרום נמק adipocytes³⁸.

לסיכום, הבחנו מול מלנומה מונחה תא השפעה על מח עצם adipocytes על ידי גורמים מסיסים. הפוכות על מח עצם adipocytes הוא בעל ריבית גבוהה, רומז כי adipocytes מח העצם הם דינמיים הרגולטורים של התא הגידול גרורות במח העצם.

איור 1 : נגזר הגידול גורמים מקדמים של בידול adipocyte. () בלוח זה מראה סכימטי תצוגה של הגדרת ניסיוני שורות תאים אילו שימושים 14F1.1, מדיום ממוזגים נגזר מלנומה. (b) חלונית זו מציגה ההדמיה של adipocyte מח העצם הבדיל. (ג) לוח זה מציג הניתוח של חתימה גנים ספציפיים adipocyte לפי qPCR. TCM = מיזוג-גידול בינוני. qPCR: תגובת שרשרת פולימראזית כמותית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מוואנג. et al. ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : השפעות הגידול-הנטל על adipocyte. לוח זה () מראה תצוגה סכמטי של הגדרת ניסיוני: coculture של שורות תאים 14F1.1, בתאי מלנומה. (b) לוח זה מציג ההדמיה של adipocyte מח העצם המערכת coculture. (ג) לוח זה מראה של גנים פרופילים של adipocytes על ידי qPCR. qPCR: תגובת שרשרת פולימראזית כמותית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. איור זה שונה מוואנג. et al. ¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תחל
שם הגן	להעביר את רצף (5' ל 3')	הפוך רצף (5' ל 3')
PPARΓ	CTGATGCACTGCCTATGAGC	GGGTCAGCTCTTGTGAATGG
CEBPΑ	AAG AGC CGC GAC AAG GC	GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG
CEBPΒ	CAACCTGGAGACGCAGCACAAG	GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT
FABP4	TGAAATCACCGCAGACGACAGG	GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC
לפטין	ATC TGA AGC AAG המרכז לאמנות עכשווית TCA GC	המרכז לאמנות עכשווית GTC ACC אגא GGT לפנות לסוכנות GC
לבחירות-1	GACACTCGAAGCTCACCTGG	GGAAGGCTGGGACGGGAAAT
אדיפונקטין	GCG אתא החתול אתא AGC GGC TTC T	C חתול לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה של המרכז לאמנות עכשווית GCA GGC-ATC

טבלה 1: עניינים תחל המשמש qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cocultures עם מוסיף היה בשימוש נרחב ללמוד אינטראקציות מתא לתא. מערכת 2D coculture היא דרך יעילה כדי לבחון איך שני חלקים crosstalk במבחנה, שלפיו שהצגנו כאן שני סרטן שונים מונחה תא אפקטים על מח עצם adipocytes. מעבדות רבות השתמשו בשיטה זו כדי לחקור crosstalk בין adipocytes לבין סרטן תאים⁶^,¹²^,²⁷^,³⁹.

באופן כללי, לכן, coculture דו-מימדית הוא הגישה פשוטה בצורה הטובה ביותר ללימוד crosstalk מתא לתא. עם זאת, כשמדובר הכנת קו מובחן תא למחקר נוסף, יש כמה אתגרים ייחודיים. פרוטוקול המתוארים כאן, בריאותם של המצב התפקודי של התא סטרומה מח עצם הוא מאוד קריטי עבור הבידול adipocytes. הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להחליף את התאים 14F1.1 מח העצם העיקרי בתאי גזע mesenchymal. יתר על כן, הדגירה מראש של התאים 14F1.1 של המדיום אינדוקציה adipogenic במשך מספר ימים הוא עוד צעד קריטי. ללא דגירה מראש זו, תאי סטרומה מח עצם ייכשל להתמיין adipocytes, אשר זוהה שלנו ולא של אחרים מחקרים⁴⁰. תופעות אלו גם להסביר למה פרוטוקולים מסוימים דומים עשויים לגרום שונים או אפילו מול תופעות, להדגיש את חשיבות כזו פרוטוקול קל, הדיר, מפורט לצורך המחקר crosstalk של תאים סרטניים, מח עצם adipocytes.

אמנם coculture 2D עלול לאבד מידע חיוני לעומת תרבויות 3D או ex-vivo , שנותר קל להיות סטנדרטית, פיקוח, בסופו של דבר מניפולציה על עוד שימוש²⁰^,²¹^,⁴¹. יישום העתידי של הטכניקה עלולים להחליט כיצד אוסטאובלסט משתנה כאשר זה הוא cocultured עם תאים סרטניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש ריהצהל.

Acknowledgments

אנו מודים דב צפורי (מכון ויצמן למדע, רחובות) חביב על לספק לנו את התא סטרומה של מח העצם מאתר קו 14F1.1. מחקר זה נתמך על ידי מענקים סינית טבעית הקרן הלאומית למדע (' קט ' 81771729) ואוניברסיטת Yongchuan חולים של צ'ונגצ'ינג רפואי (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen Inc.	11965092
Fetal Bovine Serum	Invitrogen Inc.	16000–044
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
3-isobutyl-1-methyl-xanthine	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Oil Red o	Sigma-Aldrich	O0625
24-well plate	Corning	CLS3527
Transwell insert	Millipore	MCHT24H48
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
0.25% trypsin	Thermo Scientific	25200056
hemocytometer	Bio-Rad	1450016
Culture incubator	Thermo Scientific
50 mL falcon	Corning	CLS430828
Clean Bench	Thermo Scientific	-
Microscopy	Olympus	-
200 μL pipet tips	BeyoGold	FTIP620
1,000 mL pipet tips	BeyoGold	FTIP628