Summary
Aqui, apresentamos um sistema confiável e simples bidimensional coculture (2D) para estudar a interação entre as células do tumor e da medula óssea de adipócitos, que revela um duplo efeito de fatores derivado de células de melanoma em adipócitos a medula óssea diferenciação e também coloca um método clássico para o estudo mecanicista da metástase óssea.
Abstract
O crosstalk entre adipócitos de medula óssea e células tumorais pode desempenhar um papel crítico no processo de metástase óssea. Uma variedade de métodos estão disponíveis para estudar a interferência significativa; no entanto, um sistema bidimensional transwell para coculture continua a ser um clássico, confiável e fácil caminho para este estudo de interferência. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que mostra o coculture de adipócitos de medula óssea e células de melanoma. No entanto, tal sistema coculture poderia não só contribuir para o estudo da transductions de sinal de celular das células cancerosas induzidas pela medula óssea adipócitos, mas também para o futuro mecanicista estudo de metástase óssea, que pode revelar novos alvos terapêuticos para o osso metástase.
Introduction
Metástases ósseas são comuns entre pacientes com câncer avançado, mas um tratamento curativo é ainda não está disponível. Além de especializada em armazenamento de energia como gordura, adipócitos podem suportar o crescimento do tumor e metástases em medula óssea e outros órgãos1,2,3,4,5,6. Além disso, adipócitos desempenham um papel essencial na regulação câncer célula biologia7,8,9,10 e metabolismo4,11,12 ,13,14,15,16, como bem como em osso metástase1,4,12. No nicho de medula óssea, adipócitos também podem afetar o comportamento biológico do câncer células4,6,17. A interacção entre a medula óssea adipócitos e células de câncer com osteotropism é significativa para a compreensão da metástase óssea. No entanto, pouco se sabe.
Baseado nos estudos atuais, vários métodos são aplicados a adipócitos, incluindo duas ou três dimensões (2/3D) e ex vivo culturas17,18,19,20,21. Recentemente, Herroon et al desenhou uma nova abordagem de 3D-cultura para estudar as interações dos adipócitos de medula óssea com células de câncer22. Embora o coculture 3D é ideal para imitar fisiológicas interações entre adipócitos e câncer células na vivo, sofre pobre reprodutibilidade22,23. Em comparação com um sistema de coculture 2D, um sistema 3D coculture pode fornecer diferentes fenótipos celulares, tais como célula morfologia21,22,24,25,26. Além disso, a cultura ex vivo de fragmentos de tecido ósseo esponjoso isolado pode levar a uma consequência robusta de adipócitos de células de medula culta17.
Em contraste com os modelos anteriores, no entanto, o modelo de cultura celular 2D continua a ser uma técnica clássica, confiável e fácil para digitalização rapidamente as moléculas do candidato e os fenótipos mudados em adipócitos ou câncer células in vitro1, 4,6,12,15,27. Para entender melhor o crosstalk entre adipócitos de medula óssea e as células de melanoma, nós fornecemos um protocolo detalhado para um sistema 2D coculture dos adipócitos de medula óssea com células de melanoma.
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Protocol
Nota: Todas as células, usadas no presente protocolo devem ser adultos pelo menos três gerações após o descongelamento de células congeladas de estoque.
1. colheita fatores de derivado de células de Melanoma
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Preparações
- Obter células B16F10 e uma linhagem de células de melanoma de rato.
Nota: Para este protocolo, uma linhagem de células de melanoma de rato foi obtida do banco de células-tronco da Academia Chinesa de Ciências. - Fazer um meio completo para a cultura de células B16F10 (100 mL). Uso suplementado modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% fetal de soro bovino (FBS), 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.
- Fazer um meio livre de soro pela fome das células B16F10 (50 mL). Use DMEM meio sem FBS, 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.
- Obter células B16F10 e uma linhagem de células de melanoma de rato.
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Preparar o melanoma-condicionado médio (CM)
- Semente de 2,0 x 105 B16F10 células em um 100 mm prato com 10 mL de 10% FBS DMEM. Então Incube as células em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 por 24 h.
- Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, remover o meio de cultura, lavar as células duas vezes com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) (1 x, pH 7,4) e substituir o medium com um 10 mL soro livre médio pela fome.
- Retorno das células para a incubadora para 18-24 h.
- Após a fome, recolher o meio condicionado (CM) com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de centrífuga 50 mL.
Nota: O meio condicionado é o sobrenadante das culturas de células B16F10. Certifique-se que as células B16F10 estão em boas condições antes de coletar o CM. - Centrifugue o CM por 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
- Pipetar o sobrenadante e transferir para um tubo estéril de fresco ou garrafa.
Nota: Evite pipetagem fora o sedimento no fundo do tubo. - Para remover os detritos de célula, filtre o CM por passagem através de um filtro de 0,45 µm seringa conectada em cima de um frasco estéril ou tubo.
Nota: 0,22 µm de filtros são ideais para a CM de filtragem. - Armazene o sobrenadante filtrado a-20 ° C até o uso.
Nota: É melhor não armazenar o sobrenadante a-20 ° C por mais de um mês. Alternativamente, armazene o CM a-80 ° C por mais longos períodos de tempo para a diferenciação dos adipócitos.
2. indução de adipócitos de medula óssea por fatores de derivado de células de Melanoma
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Preparações
- Fazer 100 mL de adipogenic indução média28. Use um DMEM completo suplementado com 5 µ g/mL de insulina, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine e 1 µM de dexametasona. Armazená-lo para duas semanas a 4 ° C.
- Prepare 100 mL de meio de manutenção de adipogenic. Usar um DMEM completa ou misturado com melanoma 50% CM suplementado com 5 µ g/mL de insulina.
- Fazer uma solução de óleo vermelho O estoque. Dissolver 30 mg de pó O vermelho de óleo em 10 mL de isopropanol (≥ 99.5%) e misturá-los bem pelo vórtice.
Nota: Armazená-lo para 1 ano a 4 ° C. - Fazer uma solução de óleo vermelho O trabalho. Na coifa, dilua a solução de estoque de óleo vermelho O (da etapa 2.1.3) com água deionizada na proporção de 3:2. Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente e filtrar através de um filtro de 0,22 µm antes da utilização.
Nota: Utilize apenas a solução fresca de trabalho até 2 horas.
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Diferenciação dos adipócitos
- Cultura uma célula do estroma linha 14F1.1 de medula óssea de rato29 em um prato de 60 mm com uma completa DMEM na confluência de 80% em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
Nota: Como alternativa, substitua 14F1.1 primário de células mesenquimais derivadas da medula óssea de30. - Trypsinize as células com 1,5 mL de uma solução de tripsina 0,25% na incubadora para 1 a 2 min.
- Adicionar 5 mL de meio FBS de 10% para as células e contar o número de células com um hemocytometer de vidro; em seguida, ajuste a densidade de célula a aproximadamente 1 – 2 x 105/mL.
- Semente de 5 x 104 de 14F1.1 células por poço em uma placa de 24 com 0,5 mL de meio de indução de adipogenic. Após dois dias de incubação, as células atingir cerca de 90% de confluência.
Nota: Este passo é muito crítico. Células do estroma da medula óssea não podem ser induzidas a adipócitos sem um meio de indução de adipogenic. - Remover o meio de indução e lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS cada vez.
- Mude para 1 mL de meio de manutenção de adipogenic e continuar a cultura das células até a maturação dos adipócitos.
Nota: Sob um microscópio, adipócitos parecem pequenas ou grandes bolhas de sabão e são muito fáceis de reconhecer. Geralmente, adipócitos maduros estão presentes em 6th ou 8° dia. - Mancha os adipócitos maduros com óleo vermelho ou coletar os adipócitos para análise quantitativa do polymerase reação em cadeia (qPCR).
- Cultura uma célula do estroma linha 14F1.1 de medula óssea de rato29 em um prato de 60 mm com uma completa DMEM na confluência de 80% em uma incubadora de 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2.
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A coloração dos adipócitos
- Lavagem a 14F1.1 diferenciadas células 2x com PBS e corrigi-los em 3,7% formaldeído por 1h.
- Enxagúe as células em 60% de isopropanol e deixe-os secar completamente.
- Adicionar 0,2 mL da solução de trabalho de óleo vermelho O nos poços e incube-lo à temperatura de 0,5 a 2 h.
- Lave as células com água para remover os corantes não acoplados.
- Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.
3. coculture dos adipócitos de medula óssea com células de Melanoma
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Preparações
- Prepare o osso maduro adipócitos medula: induzir as células 14F1.1 em adipócitos maduros do BM em placas de 24 poços com o meio de indução de adipogenic por 2 dias e depois mantê-las em meio de manutenção de adipogenic por mais 6 a 8 dias.
- Preparar as células B16F10: cultura de células B16F10 em pratos de 60 mm com 5 mL de meio DMEM.
- Umedeça a inserção de membrana (por exemplo, transwell): Adicionar 150 µ l de meio DMEM FBS-livre para as 0,4 µm a inserções de tamanho dos poros da membrana e mergulhe-os em cima dos poços das placas 24-bem preenchidos com 500 µ l de meio DMEM FBS-livre.
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Configuração de coculture
- Lentamente a pipeta fora o médio de cada inserção.
Nota: Não destrua a membrana ao remover o meio. - As células B16F10 (0/103105106) a 0,4 µm poro insere de passo 3.2.1 de semente.
- Substitua o meio de manutenção de adipogenic dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea da etapa 3.1.1. com 600 µ l de meio DMEM completo.
- Transferi as inserções preenchidas com as células B16F10 (da etapa 3.2.2) em cima dos poços com os adipócitos maduros da medula óssea (da etapa 3.2.3) para os experimentos de coculture.
- Incube as cocultures a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 dias.
- Após 48 h de incubação, remover as inserções do coculture e depois lavar os adipócitos 2 x com 500 µ l de PBS 1x.
Nota: Opcionalmente, colete as células B16F10 nas bulas para análise, se necessário. - Mancha os adipócitos com a solução de óleo vermelho O trabalho ou coletar os adipócitos para análise de qPCR.
Nota: Consulte o procedimento de coloração na etapa 2.3. - Fotografia os adipócitos tingidos sob um microscópio de luz.
- Lentamente a pipeta fora o médio de cada inserção.
4. análise do Gene Signature específicas dos adipócitos de qPCR
- Adicionar 0,5 mL de reagente de isolamento de RNA de ready-to-use por alvéolo em uma placa de 24 na qual adipócito maduro está pronto para detectar.
- Siga um protocolo padrão para a extração de RNA e a síntese de cDNA31.
- Use o primer para 18S e GAPDH como o controle e CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptina, Pref-1 ou Adiponectina para a assinatura do gene específico dos adipócitos (tabela 1).
- Execute a seguinte reação em um termociclador: 95 ° C por 20 s, seguida de 40 ciclos de 95 ° C por 1 s e 60 ° C durante 20 s.
- Use o método deΔΔCt de–2 para calcular que a dobra altera32.
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Representative Results
Na medula óssea, adipócitos podem aparecer no tumor microambiente1,13,33,34,35 numa fase precoce para apoiar a progressão do tumor através de fatores solúveis ou Ativando a12,osteoclastogenesis6,36, especialmente no contexto da obesidade6,12 e/ou envelhecimento37. Nossos anteriores estudos1 notaram que o número de adipócitos medula óssea muda drasticamente durante a fase precoce de metástases de melanoma ao osso1. Com efeito, os montantes dos adipócitos acumulam-se na área do tumor e apoiar o crescimento das células do tumor na medula óssea quando os ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica6, sugerindo que a medula óssea adipócitos podem desempenhar um papel significativo na metástase óssea nicho de medula37. No entanto, o crosstalk dinâmico de células tumorais e medula óssea dos adipócitos permanece obscuro. Portanto, nós foram dedicados a abordar esta questão pelo sistema de células de medula óssea dos adipócitos e melanoma coculture 2D.
Tumor derivado de fatores promovem a diferenciação de adipócitos de medula óssea:
Figura 1 um representa um fluxo de trabalho típico para indução de adipócitos de medula óssea com tumor-condicionado médio (TCM). Uma experiência representativa indica as células 14F1.1, chapeado como células únicas, com uma densidade de 5 x 104 células por poço na presença de um meio de indução de adipogenic nos primeiros 2 dias e então mantida dentro do meio de manutenção de adipogenic (com ou sem TCM) por 6-8 dias. Adipócito maduro contém gotículas lipídicas; Portanto, os adipócitos diferenciados podem ser facilmente identificados pelo óleo vermelho O mancha (Figura 1b) e quantificados por qPCR com uma assinatura do gene específico dos adipócitos (Figura 1c).
Sobrecarga de células de melanoma induz a diferenciação em adipócitos de medula óssea:
As células do tumor podem modificar o ambiente para sobreviver, especialmente sob condições de hipoxia1,4,6. Para imitar um efeito secundário de tumor-fardo sobre um adipócito de medula óssea, realizamos o sistema coculture 2D com um contínuo aumento do número de células de melanoma nas inserções superiores (Figura 2a). Figura 2b mostra que o armazenamento de lipídios nos adipócitos a é privado em maior medida a maior densidade de células de melanoma (106 células/poço) em comparação com a privação na frequência mais baixa de células de melanoma (103 células / Bem). Figura 2 c apresenta um perfil de gene desses adipócitos nos adipócitos no coculture. Comparado com o coculture com a menor densidade de células de melanoma, pref-1 nível aumentado, obviamente, e a expressão de leptina, adiponectina, FABP4, CEBPβ e PPARγ foi diminuída, o que sugere que o efeito secundário de tumor-fardo pode ser atribuído ao o processo de diferenciação nos adipócitos. Além disso, uma sobrecarga de células tumorais pode induzir necrose em adipócitos38.
Em resumo, observamos um efeito de orientado a célula de melanoma oposto na medula óssea adipócitos por fatores solúveis. O efeito contrário em adipócitos de medula óssea é de grande interesse, sugerindo que a medula óssea adipócitos são dinâmicos reguladores da célula de tumor metastatizam para medula óssea.
Figura 1 : Tumor derivado de fatores promovem uma diferenciação dos adipócitos. (um) este painel mostra uma vista esquemática da configuração experimental que usa linhas de célula 14F1.1 e um meio condicionado derivado de melanoma. (b) este painel mostra a imagem dos adipócitos diferenciados da medula óssea. (c) este painel mostra a análise de uma assinatura do gene específico dos adipócitos por qPCR. TCM = tumor-condicionado médio. qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Wang et al . 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Efeitos do tumor-fardo no adipócito. (um) este painel mostra uma vista esquemática da configuração experimental: um coculture de linhas de células 14F1.1 e células de melanoma. (b) este painel mostra a imagem de um adipócito de medula óssea no sistema coculture. (c) este painel mostra um gene de perfil dos adipócitos por qPCR. qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa. Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de Wang et al . 1. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Primeiras demão | ||
| Nome do gene | Encaminhar a sequência (5' para 3') | Inverter a sequência (5' para 3') |
| PPARΓ | CTGATGCACTGCCTATGAGC | GGGTCAGCTCTTGTGAATGG |
| CEBPΑ | AAG AGC CGC GAC AAG GC | GTC AGC TCC AGC ACC TTG TG |
| CEBPΒ | CAACCTGGAGACGCAGCACAAG | GCTTGAACAAGTTCCGCAGGGT |
| FABP4 | TGAAATCACCGCAGACGACAGG | GCTTGTCACCATCTCGTTTTCTC |
| Leptina | ATC TGA AGC AAG CCA TCA GC | CCA GTC ACC AGA GGT CAA GC |
| Pref-1 | GACACTCGAAGCTCACCTGG | GGAAGGCTGGGACGGGAAAT |
| Adiponectina | GCG ATA ATA CAT AGC GGC TTC T | GCA GGC ATC CCA GGA CAT C |
Tabela 1: Tabela de primers utilizados para qPCR.
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Discussion
Cocultures com inserções foram amplamente utilizados para estudar as interações de célula para célula. O sistema coculture 2D é uma maneira eficaz de observar como as duas partes crosstalk em vitro, pelo qual mostramos aqui dois efeitos diferentes de câncer orientado a célula na medula óssea de adipócitos. Muitos laboratórios têm utilizado este método para investigar o crosstalk entre adipócitos e câncer células6,12,,27,39.
Em geral, portanto, um coculture 2D é a melhor abordagem direta para o estudo do diagrama de célula para célula. No entanto, quando se trata de preparar uma linha de células indiferenciadas para futuras pesquisas, existem alguns desafios únicos. O protocolo descrito aqui, a saúde e o estado funcional da célula do estroma da medula óssea é muito crítica para a diferenciação de adipócitos. O protocolo pode ser modificado para substituir as células 14F1.1 com células-tronco mesenquimais primárias da medula óssea. Além disso, a pré-incubação das células 14F1.1 no meio de indução de adipogenic por vários dias é outro passo fundamental. Sem este pré-incubação, as células do estroma da medula óssea falhará diferenciar em adipócitos, que foi detectado em nossos e dos outros estudos40. Esses fenômenos também explicam por que alguns protocolos semelhantes podem resultar em diferentes ou até mesmo em frente de efeitos e destacar a importância de um protocolo fácil, repetível e detalhado para o estudo de interferência de células tumorais e adipócitos de medula óssea.
Embora o coculture 2D pode perder algumas informações essenciais em comparação com culturas 3D ou ex vivo , continua a ser fácil de ser padronizados, monitorados e eventualmente manipulados para mais uso20,21,41. Uma futura aplicação da técnica pode decidir como um osteoblasto muda quando ele é cocultured com as células cancerosas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos Dov Zipori (Instituto de Ciência Weizmann, Rehovot, Israel) gentilmente para nos fornecer a célula do estroma murino medula óssea linha 14F1.1. Este estudo foi suportado por concessões do chinês Fundação Nacional da ciência Natural (n º 81771729) e a Universidade Yongchuan Hospital de Chongqing médica (n º s. YJQN201330; YJZQN201527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen Inc. | 16000–044 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | |
| 3-isobutyl-1-methyl-xanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Oil Red o | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 24-well plate | Corning | CLS3527 | |
| Transwell insert | Millipore | MCHT24H48 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 0.25% trypsin | Thermo Scientific | 25200056 | |
| hemocytometer | Bio-Rad | 1450016 | |
| Culture incubator | Thermo Scientific | ||
| 50 mL falcon | Corning | CLS430828 | |
| Clean Bench | Thermo Scientific | - | |
| Microscopy | Olympus | - | |
| 200 μL pipet tips | BeyoGold | FTIP620 | |
| 1,000 mL pipet tips | BeyoGold | FTIP628 |
References
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