Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57354
Automatic Translation
*1, *1, 1
1College of Life Sciences, South China Agricultural University
* These authors contributed equally

Summary

قمنا بتطوير طريقة جديدة للتعبير عن المشترك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات للتغلب على صعوبات الطرق التقليدية. ويستفيد من استخدام بلازميد تعبير واحد يحتوي على بروتين مستقلة وظيفيا متعددة معربا عن أشرطة الكاسيت لتحقيق التعبير البروتين المشارك.

Abstract

معلومات حول localization(s) سوبسيلولار الزمانية المكانية للبروتين أمر بالغ الأهمية لفهم وظائفها الفيزيولوجية في الخلايا. البروتينات الفلورية وجيل من البروتينات الفلورية الانصهار بعنف استخدمت كأداة فعالة لتصور مباشرة التعريب البروتين والديناميات في الخلايا. أنها مفيدة بشكل خاص لمقارنتها مع علامات عضية المعروفة بعد التعبير المشترك مع البروتين للفائدة. ومع ذلك، النهج الكلاسيكي للتعبير البروتين المشارك في النباتات عادة ما تنطوي على عدة التعبير المستقل والبلازميدات، وبالتالي السلبيات التي تشمل التعبير المشارك منخفضة الكفاءة وتباين مستوى التعبير، وحان الوقت النفقات في عبور الوراثية والفحص. في هذه الدراسة، ونحن تصف طريقة قوية ورواية للتعبير المشترك من البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. أن يتغلب على أوجه قصور الأساليب التقليدية باستخدام ناقل تعبير واحد يتكون من عدة أشرطة الكاسيت وإذ تعرب عن شبه مستقلة. كل كاسيت التعبير البروتين يحتوي على عناصر التعبير البروتين الفنية الخاصة به، ولذلك يمكن تعديله مرونة لتلبية الطلب التعبير متنوعة. كما أنها سهلة ومريحة لأداء الجمعية والتلاعب بالحمض النووي وشظايا في بلازميد التعبير باستخدام فعل أمثل في خطوة واحدة دون الهضم إضافية وخطوات عملية ربط. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع التكنولوجيات الحيوية-التصوير الفلورسنت البروتينات المشتقة الحالية والتطبيقات، مثل الحنق وبيفك. كعملية التحقق من الأسلوب، استخدمنا هذا النظام الجديد إلى مستقبلات الفرز رغوي المشارك إكسبريس فلوريسسينتلي تنصهر وبروتينات الغشاء الناقل الافرازية. وتبين النتائج أن تعريب سوبسيلولار منظور هي نفسها كما هو الحال في دراسات سابقة بتعبير عابر والتحول الوراثي في النباتات.

Introduction

تعتبر البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك كأدوات مفيدة لدراسة الديناميات داخل الخلايا والتعريب سوبسيلولار وكذلك فهم الوظائف الفسيولوجية وعمل آليات1،2، 3 , 4-أنه مفيد خصوصا للبروتينات مراسل عضية المعروفة إكسبرس المشارك مع البروتين في السؤال لتوضيح أفضل الأساس المنطقي الزمانية المكانية وتوزيع الدالة داخل منظومة اندوميمبراني في خلايا4 , 5 , 6 , 7 , 8.

ويمكن التعبير عن بروتين انصهار نيون تشيميريك في النباتات عن طريق التعبير عابرة والتحول الوراثي المستقرة، التي لديها مزايا كل منهما وقيود9،،من1011. تعبير عابر من البروتين هو نهج مناسب يتضمن biolistic-القصف، البولي إثيلين غليكول (شماعة)-، أو بوساطة انهانسر تعبير عابر الحمض النووي في بروتوبلاستس و المتبعة-وساطة التسلل إلى أوراق خلايا نباتية سليمة، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، ب12،13،14،،من1516. بيد أن التعبير المشارك متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في خلية نبات واحدة يتطلب مزيج البلازميدات التعبير مستقلة عدة. وهكذا، عيوب استخدام البلازميدات متعددة للتعبير البروتين المشارك في النباتات أدنى مستويات التعبير المشترك بسبب فرصة والبلازميدات عدة في نفس الوقت إدخال نفس الخلايا عند بلازميد واحد، بالمقارنة مع انخفاض كبير اختلافات مستويات التعبير البروتين تسبب بمقدار حسيب عشوائي لكل أنواع بلازميد نقله إلى خلية17،18. وبالإضافة إلى ذلك، أنها تمثل تحديا من الناحية التقنية ﻹدخال عدة التعبير المستقل والبلازميدات مفردة المتبعة للبروتين المشارك التعبير9،،من1011. ولذلك، المتبعة-وساطة البروتين يترك التعبير عابر بتسلل التبغ فقط قادرة على التعبير عن بلازميد واحد في كل مرة، كما هو مبين في الشكل 1 باء. في المقابل، جيل نباتات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية الانصهار عادة ما يتحقق عن طريق المتبعة التي يحمل ناقل ثنائي تحول. ومع ذلك، ناقل ثنائي أن يتوسط في نقل الجينات والإدراج في جينومات النباتات فقط قادرة على التعبير عن انصهار فلورسنت مفردة بروتين (الشكل 1B)9،،من1012. توليد نبات المعدلة وراثيا التي تعبر عن العديد من البروتينات الفلورية تشيميريك في وقت واحد يتطلب جولات متعددة من عبور الوراثية والفحص، التي يمكن أن تتخذ من أشهر إلى سنوات اعتماداً على عدد الجينات لتكون المشترك أعرب.

توظيف أبلغ تعبير واحد متجه للمشارك التعبير متعددة من البروتينات في النباتات قبل عدة السابقة الدراسات19،،من2021. ومع ذلك، جولات متعددة من الهضم الأنزيمي وربط الحمض النووي من جزيئات الحمض النووي وناقلات العمود الفقري مطلوبة عادة لتوليد بلازميد النهائي للبروتين المشارك أو تعبير الإفراط. وهنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة وقوية للتعاون معربا عن البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة في النباتات. وهي طريقة كفاءة عالية ومريحة ليحقق متعددة البروتين التعبير المشارك في النباتات للتعبير عابرة على حد سواء وتحول مستقر في طريقة العريقة. ويعمل ناقل واحد يحتوي على عدة شرائط التعبير البروتين مستقلة وظيفيا للبروتين المشارك التعبير ومما يتغلب على عيوب الأساليب التقليدية. وعلاوة على ذلك، وهو نظام متعدد الاستخدامات بدرجة في الحمض النووي الذي تحقق بفعل خطوة واحدة بسيطة الأمثل دون اتخاذ خطوات إضافية لهضم الحمض النووي وربط التلاعب والجمعية. ويتضح مبدأ العمل في الشكل 2. وعلاوة على ذلك، فإنه متوافق تماما مع النهج الخلوية والجزيئية والكيمياء الحيوية الحالية التي تعتمد على البروتينات تشيميريك الانصهار الفلورسنت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-التمهيدي تصميم الاستراتيجية وتضخيم الحمض النووي

  1. تصميم الإشعال للاستنساخ الجزيئي من شظايا من الحمض النووي. وتتألف كبسولة تفجير تسلسل الجين ملزمة محددة bp 20 و 20 إلى 25 bp 5 '-نهاية عبء متواليات، وهي تسلسل متداخلة مكملة المتاخمة جزيئات الحامض النووي (انظر الجدول 1 على سبيل المثال).
    ملاحظة: الجمعية العامة اللاحقة للحمض النووي كل الأجزاء، الربط بين الأشرطة تعبير البروتينات المختلفة، والتكامل مع كل ناقل التعبير النهائي يتوقف على اعتراف متواليات متداخلة المتاخمة.
  2. تضخيم شظايا من الحمض النووي، بما في ذلك المروج ومراسل الفلورسنت والجينات المستهدفة والمدمر، اللازمة لتشييد شرائط التعبير البروتين شبه المستقلة ردود الفعل PCR القياسية مع أصدقائهم الإشعال المقابلة وعالية بوليميريز الإخلاص.
    ملاحظة: القوالب المستخدمة في هذه الدراسة لتضخيم الحمض النووي مستمدة من الدراسات السابقة15،،من2223. درجة الحرارة انلينغ وتمديد الوقت ردود الفعل PCR هي التمهيدي والجينات التابعة.

2-الحمض النووي جزء الجمعية وتشييد البروتين التعبير أشرطة الكاسيت

  1. فحص جودة منتجات PCR الجولة الأولى بالتفريد الحمض النووي وتحديدها كمياً بجهاز المطياف الضوئي. التحقق من ما إذا كان الحمض النووي التدهور والتلوث قد حدثت قبل 1% [اغروس] هلام التفريد. ينبغي أن يكون OD260/OD280 منتجات PCR بين 1.6 و 1.8.
  2. مزيج مختلف شظايا من الحمض النووي (0.05-0.1 بمول لكل جزء) في أنبوب بكر جديدة إلى وحدة تخزين نهائي من 5 ميليلتر.
    ملاحظة: جزيئات الحمض النووي مزيج مصممة للبروتين نفس التعبير الكاسيت معا في أنبوب PCR واحد. تجنب الخلط بين السلطات الوطنية المعينة من كاسيت التعبير المختلفة معا، نظراً لأنه يقلل من كفاءة الجمعية الحمض النووي نظراً للإعداد المتزايدة من جزيئات الحمض النووي التي تحتاج إلى أن تكون مرتبطة.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  3. إعداد المخزن المؤقت للأسهم x ISO 5: 500 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5؛ مجكل 50 مم2؛ ديوكسينوكليوتيدي 1 مم (دنتب)؛ ديثيوثريتول 50 مم؛ 25% البولي إثيلين غليكول (شماعة) 8000؛ ومم 5 نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NAD).
  4. جعل 1 مل 2 × رئيسية خليط من 400 ميليلتر 5 × ISO الأسهم المخزن المؤقت، ووحدات 7.5 [ااكسونوكلس] T5، 62.5 وحدات عالية الدقة بوليميراز الدنا، 000 5 وحدة من [تق] [بولمرس] (انظر الجدول للمواد)، والمقطر المعقم الكيل H2o.
    ملاحظة: هذا هو مقتبس من السابق دراسات24،،من2526؛ وينبغي أن يكون الأمثل وحدات التخزين هذه.
  5. الكوة ميليلتر 100 2 × مزيج الرئيسي كل أنبوب ومخزن في-20 درجة مئوية.
    تنبيه: تجميد متكررة وذوبان الجليد الخليط الرئيسي x 2 يمكن أن يسبب انخفاض كفاءة الجمعية الحمض النووي.
  6. إضافة 15 ميليلتر من مزيج الرئيسي x 2 إلى 5 ميليلتر خليط الحمض النووي واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

3-بناء ناقلات للمشارك التعبير متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات

  1. تضخيم كاسيت التعبير البروتين شبه مستقلة كاملة ببكر الجولة الثانية استخدام المنتج (0.5-1.0 ميليلتر) من رد فعل الجمعية متحاور الجولة الأولى كالقالب والإشعال الأبعد (مثلاً، FP35S-1 و 1-رنوس للتعبير كاسيت 1).
    1. استخدام 1 وحدة من بوليميريز عالي الدقة في حجم رد فعل 50 ميليلتر تليها دورات 30 (94 درجة مئوية لمدة 30 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، متبوعاً تمديد نهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. لينيريزي بالبروتين النهائي التعبير ناقلات العمود الفقري pUC18 و pCAMBIA1300، التي صممت للبروتين عابر التعبير والتحول الوراثي، على التوالي، بإضافة 4 وحدات Sma أنا إلى حجم رد فعل نهائي 10 ميليلتر وتحضين 1- 2 ساعة عند 25 درجة مئوية. إلغاء تنشيط إنزيم التقييد التي تفرخ في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. مزيج اكويمولار من جزيئات الحامض النووي من البروتين التعبير أشرطة الكاسيت وناقلات النهائية خطية رد نهائي إلى حجم 5 ميليلتر. ثم، تنفيذ جزئ الحمض النووي الجولة الثانية بالاختلاط مع 15 ميليلتر 2 × المخزن الرئيسي وتفرخ عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. استخدام المنتجات النهائية من رد فعل جزئ متحاور الجولة الثانية لتحويل المختصة كولاي الخلايا (مثلاً، DH5α) وفقا للإجراءات القياسية27. التحقق من صحة المستعمرات الإيجابية بتسلسل مستعمرة بكر والحمض النووي. استخراج والبلازميدات إيجابية من كولاي باستخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد مصغرة وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    تنبيه: للتخزين على المدى الطويل، والبلازميدات حله في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات أو مزدوجة المقطر ح2س أكثر استقرارا من إبقائها في سلالات كولاي .

4-بيوليستيك-قصف بوساطة التعبير المشترك عابر متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات

  1. إعداد التبغ حسب-2 تعليق الخلايا والنباتات نبات الأحداث للقصف.
    1. تعيين الخلايا حسب الثقافة-2 في المتوسط Murashige وسكوغ (مللي ثانية) من سوبكولتورينج مرتين في الأسبوع في 25 درجة مئوية في شاكر 130 لفة في الدقيقة. تصفية الخلايا 2 جمع 30 مل 3 د مثقف على قطعة من ورق الترشيح يعقم 70 ملم عبر مضخة فراغ بإعداد ضغط الفراغ إلى 40 [مبر].
    2. من أجل منع الخلايا من الجفاف خلال الخطوات التالية، إضافة عدة قطرات من 2 حسب الخلية السائلة المتوسطة الثقافية في طبق بتري قبل وضع ورق الترشيح (الخطوة التالية).
    3. نقل ورقة تصفية مع الخلايا بمقدار 2 على ذلك إلى طبق بتري جديدة (85 ملم × 15 ملم).
    4. سطح تعقيم بذور نبات التمويل (Col-0) قبل فورتيكسينج خليط مع الإيثانول 70% (v/v) التي تحتوي على 0.05% 20 توين لمدة 10 دقائق.
    5. تدور أسفل البذور باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة ل 2 s، إزالة المادة طافية وتغسل البذور مع الإيثانول 100% مرة واحدة ماصة س. 30 من البذور على ورقة تصفية عقيمة جديدة في غطاء عقيمة. ثم، أيردري البذور ونشرها على لوحات أجار ½ مرض التصلب العصبي المتعدد.
    6. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل تحويلها إلى دائرة نمو نبات مع الإعدادات التالية: 16 ح الضوء الظلام 8 ح مع 120-150 ميكرومتر m-2 s-1 كثافة، 22 درجة مئوية.
    7. نقل 7-يوم العمر عينة النباتات داخل دائرة قطرها 30 ملم في وسط صفيحة متوسطة ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الجديدة لزيادة كفاءة عمليات القصف.
      تحذير: تجنب التداخل النباتات عند نقل ووضعها على لوح ½ مرض التصلب العصبي المتعدد الجديد.
    8. إضافة عدة قطرات من ½ MS المتوسطة السائل على سطح النباتات أو الأنسجة الحفاظ على الرطوبة ومنع جفاف النباتات من خلال الخطوات التالية.
  2. معطف جزيئات الذهب مع بلازميد الحمض النووي.
    1. دوامة ميكروكارير الذهب حل دقيق، للحد الأدنى 3 إعداد أنبوب 1.5 مل جديدة.
    2. التسلسل إضافة الحلول التالية في أنبوب ودوامه: 25 ميليلتر (1.5 ملغ) الذهب الجسيمات، دوامة 10 ق؛ 10 ميليلتر من سبيرمدين 25.46 مغ/لتر، دوامة 10 s; 5 ميليلتر من 1µg/ميليلتر بلازميد الحمض النووي، ودوامه 3 دقيقة؛ 25 ميليلتر 277.5 مغ/لتر كاكل2 الحل، دوامة 1 دقيقة.
      تنبيه: الحفاظ على فورتيكسينج أثناء هذه الخطوة.
    3. زيادة ونقصان لأسفل ميكروكاريرس الذهب باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة 5 s وماصة بها المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه. يغسل مع 200 ميليلتر من الإيثانول المطلقة وإعادة تعليق بيليه بدوامة لتدور س. 5-10 إلى أسفل في أقصى سرعة 5 s وإزالة الإيثانول.
    4. إعادة تعليق جزيئات الذهب في ميليلتر 18 الإيثانول المطلقة وتعليق الجسيمات ميليلتر 6 الكوة على منتصف ماكروكاريرس الثلاثة. السماح لهم بالهواء الجاف.
  3. نقل الحمض النووي في النباتات عن طريق القصف الجسيمات.
    1. تعيين نظام التسليم بالجسيمات كما يلي: 1100 رطل/بوصة مربعة، 28 ملم زئبق فراغ ومسافة الفجوة 1 سم ومسافة الرحلة الجسيمات 9-سم.
    2. قصف الخلايا/النباتات على لوحة متوسطة أجار لثلاث مرات في ثلاثة مواقع مختلفة وثم تبقى الخلايا/النباتات في الظلام بعد القصف مباشرة.
      تنبيه: ارتداء نظارات السلامة عند تشغيل نظام تسليم الجسيمات بسبب اقتران ارتفاع ضغط الغاز والجسيمات عالية السرعة مع النظام.
  4. تبقى قصفت خلايا/النباتات في الظلام في قاعة نمو النبات 6 إلى 72 ساعة قبل رصد إشارات الفلورسنت. تعيين الدائرة نمو النبات إلى الظلام 24 ح و 22 درجة مئوية.
    تنبيه: كفاءة التعبير وكثافة إشارة الفلورسنت هي المروج والجينات، والنبات/الأنسجة-تعتمد على.

5-جيل نبات المعدلة وراثيا مستقرة المشترك معربا عن البروتينات الفلورية تشيميريك متعددة المتبعة-بوساطة التحويل.

  1. ذوبان الجليد المتبعة الخلايا المختصة (PMP90) على الجليد والانتظار لمدة 30 دقيقة، ثم إضافة متجه ثنائي 2 ميليلتر (100-200 نانوغرام) (أعدت أعلاه) إلى الخلايا المختصة. الجلوس المخلوط بالثلج لمدة 10 دقائق.
  2. نقل الخليط إلى ومبومو انهانسر سم 0.1 مبردة مسبقاً. إدراج ومبومو في النظام انهانسر وأداء انهانسر مع الإعدادات التالية: 1.6 كيلو فولت، أوم 600، 25 µF.
  3. إضافة 1 مل من شركة نفط الجنوب السائلة المتوسطة إلى ومبومو فورا بعد انهانسر "الماصة؛" الخلايا في أنبوب 1.5 مل جديدة واحتضان عند 28 درجة مئوية في شاكر مداري أفقي 200 لفة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 2,348 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتجاهل غالبية المادة طافية، بلطف إعادة تعليق الخلايا الأعلاف مع تلميح ماصة، نشرها على لوحة رطل يحتوي على 50 ملغم/لتر هيجروميسين ب واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  5. تحويل التمويل نبات Col-0 النباتات مع المتبعة، التي تحتوي على pCAMBIA1300 ناقل ثنائي متكامل مع عدة شرائط التعبير البروتين، بواسطة الأسلوب28 تراجع الأزهار كما هو موضح سابقا إلى توليد النباتات المعدلة وراثيا مستقرة.
  6. تعقيم سطح بذور نبات المحورة وراثيا بخلطها مع الإيثانول 70% (v/v) التي تحتوي على 0.05% 20 توين. دوامة ل 10 دقيقة تدور أسفل البذور باستخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى هيئة في أقصى سرعة ل 2 s، إزالة المادة طافية، وتغسل البذور مع الإيثانول 100% مرة واحدة لمدة 30 ثانية.
  7. "الماصة؛" من البذور على ورقة تصفية عقيمة في غطاء عقيمة. وبعد ذلك، الهواء الجاف ونشرها على ½ MS أجار لوحات تتضمن ب هيجروميسين لفحص نسلها إيجابية.
  8. احتضان لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة يومين. ثم نقل منها إلى دائرة نمو النبات والثقافة لمدة 7 أيام.
  9. حدد العمر 7 اليوم بقاء النباتات الأحداث قبل التحقق من وجود إشارات الفلورسنت تحت مجهر فلوري، ثم نقل النباتات في التربة لفحص المزيد من النباتات متماثل.

6. العلاجات الدوائية

  1. للعلاجات الدوائية، تضعف كل المخدرات في متوسطة MS السائل تركيزات العامل المناسبة قبل الحضانة مع الخلايا أو النباتات.
    1. العلاج وورتمانين: إعداد حلول الأسهم من وورتمانين 1 ملم بتذويب مسحوق وورتمانين في [دمس] وتخزين المخزونات في-20 درجة مئوية. نقل الخلايا النباتية أو النباتات الأحداث في المتوسط MS السائلة التي تحتوي على 16.5 مكم وورتمامين واحتضان لمدة 30-45 دقيقة قبل التصوير.
    2. العلاج بريفالدين A (واو): إعداد 1 مم حلول الأسهم لمنتدى بواو الآسيوي بتذويب مسحوق منتدى بواو الآسيوي في [دمس] وتخزين المخزونات في-20 درجة مئوية. نقل الخلايا النباتية أو النباتات الأحداث في المتوسط MS السائلة التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل منتدى بواو الآسيوي لمدة 30-45 دقيقة قبل التصوير.

7-[كنفوكل] مجهر التصوير والبروتين تحليل التعريب المشارك سوبسيلولار

  1. نقل الأحداث النباتات أو خلايا تعليق على إحدى شرائح زجاجية تقليدية ووضع شريحة غطاء بلطف في الجزء العلوي لتصوير بالليزر [كنفوكل] معيار الفحص المجهري. استخدم الإعدادات التالية: المياه 63 X الهدف (N.A 1.4) 0 الخلفية، كسب 700، وحجم بكسل 0.168 مم، وكاشف ضوئي أنبوب. تثير البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم في 485 نانومتر والكشف عن الأسفار في 525 نانومتر. للبروتينات معلم طلب تقديم العروض، تثير في 514 nm وكشف في 575 نانومتر.
  2. حساب نسبة التعريب المشارك الفلورسنت الإشارات باستخدام البرمجيات "ي الصورة" (https://imagej.nih.gov/ij/) مع بيرسون-سبيرمان الارتباط (PSC) المشارك التعريب في المكونات كما هو موضح سابقا8. وتظهر معاملات الارتباط بيرسون أو معاملات الارتباط سبيرمان للرتب في النتائج (الشكل 4). تكون قيم r المنتجة من-1 إلى 1. 0 يوضح أي ارتباط لا يمكن اكتشافها من إشارات اثنين، بينما + 1 و-1 يبين العلاقة الإيجابية والسلبية الكاملة، على التوالي، إشارات اثنين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قمنا بتطوير أسلوب قوية وذات كفاءة عالية للتعبير المشترك عن متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. فإنه يكسر من خلال الحواجز التقليدية استخدام نهج متعددة والبلازميدات المنفصلين عن ذويهم للتعبير البروتين المشارك، وكما هو مبين في الشكل 1 ألف، باء، عن طريق التعبير عابرة أو التحول الوراثي مستقرة. في هذا الأسلوب الجديد، نقوم بإنشاء ناقل تعبير واحد يتكون من البروتين التعبير أشرطة متعددة لتحقيق البروتين المشارك التعبير في وقت واحد (الشكل 1، د). بروتين التعبير كاسيت وظائف شبه independently مع الخاصة به عناصر الحمض النووي اللازمة للتعبير البروتين. ولذلك، يمكن تخصيص كل كاسيت التعبير البروتين بشكل مستقل وفقا للمتطلبات المتنوعة للتعبير البروتين. أما بالنسبة لناقلات التعبير المشارك البروتين النهائي، تعمل شرائط التعبير البروتين في ذلك كما العناصر الأساسية "ليغو" التي يمكن تعديلها، أعيد بناؤها. وإعادة وضع مريح. وعلاوة على ذلك، يتحقق ببساطة استراتيجية بديلة للجمعية جزيء الحمض النووي، والربط بين عدة شرائط التعبير البروتين، والتكامل من شظايا من الحمض النووي مع ناقل الوجهة النهائية للمشارك التعبير عن البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك عن طريق محسن متحاور في المختبر جزئ فعل دون اتخاذ مزيد من الخطوات الإضافية لهضم الحمض النووي والترابط. ويتضح مبدأ العمل رد فعل جزئ متحاور في المختبر في الشكل 2. تحقيق الربط بين جزيئات الحمض النووي متعددة (مثلاً، الثلاثة الممثلة الحمض النووي الأجزاء 1-3 هو مبين في الشكل 2) واندماجها مع ناقل التعبير النهائي ببساطة وكفاءة برد فعل خطوة واحدة (انظر الشكل 2 ). هو مقتبس من الدراسات السابقة بتداخل جزئ من جزيئات الحمض النووي بوساطة مع تسلسل قصيرة المتداخلة لتحقيق انصهار شظايا من الحمض النووي والبناء البلازميدات،من25إلى26.

كاختبار للأسلوب، اخترنا مستقبلات الفرز رغوي (تم) وبروتين غشائي الناقل الافرازية (الشقي)، وهما اثنان مراسل البروتينات المشاركة في البروتينات الافرازية ومسارات الالتقام، على التوالي6،22 23، ،،من2930. نوع من فسرس--أنا يموضع بروتينات الغشاء لا يتجزأ التي تتوسط حركة البروتين السكروز في مسار الافرازية المنقبضة وأساساً في المقصورات بريفاكولار (Pvc) في مصانع6،،من2223. وفي المقابل، بروتينات الغشاء الناقل الافرازية (سكامبس) هي بروتينات الغشاء الرابعة من نوع المشاركة في المسار اندوسيتيك النباتية. أنه يموضع غشاء البلازما (م) و عبر-شبكات غولجي (تجنس)، والتي تكون بمثابة بداية اندوسوميس22،،من2930. نحن شيدت اثنين من الأشرطة التعبير البروتين التي تستضيف الأنشطار تشيميريك من نبات VSR2 (AtVSR2) مع طلب تقديم العروض، و نبات SCAMP4 (AtSCAMP4) مع التجارة والنقل، كما هو مبين في الشكل 3. لضمان تقديم العروض-AtVSR2 يمكن أن يترجم إلى لائحة، يتم إضافة إشارة هضميد (SP) قبل تقديم العروض، سابقا عنها6،31. الأشرطة الفردية البروتين اثنين على التعبير كذلك مترابطة واضطر مع البروتين النهائي التعبير متجه pUC18 أو pCAMBIA1300 للبروتين المشارك التعبير أما عن طريق البروتين عابرة أو النباتات تحول مستقر، كما هو موضح في الشكل 3. AtVSR2 و AtSCAMP4 بنجاح المشترك المعرب عنها في التبغ حسب-2 الخلايا عن طريق القصف الجسيمات وأظهرت تعريب الصحيح (الشكل 4 أ). طلب تقديم العروض-AtVSR2 نمطاً الشروريه، الذي كان متميزاً عن توطين غشاء البلازما AtSCAMP4-التجارة والنقل مع بعض النقاط الشروريه سيتوسوليك. وعلاوة على ذلك، نبات من النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن المشاركة AtSCAMP4-التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض-AtVSR2 التي تم إنشاؤها عن طريق المتبعة-بوساطة التحويل. تعريب سوبسيلولار شارك الإعراب عن طلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4--التجارة والنقل في خلايا الجذر وجذور الشعر مبين في الشكل 4B و 4E. وكانت نتائج التعبير المشارك AtVSR2 طلب تقديم العروض، والتي تم الحصول عليها من المعدلة وراثيا نبات AtSCAMP4-بروتينات فلورية خضراء باﻻتفاق مع تلك من الخلايا بمقدار 2. وباﻹضافة إلى ذلك، محوره وراثيا نبات تعامل مع وورتمانين ومنتدى بواو الآسيوي للحد الأدنى 30 وورتمانين تسببت في طلب تقديم العروض-AtVSR2 المسمى PVCs تشكيل بنية تشبه عصابة صغيرة، ومنتدى بواو الآسيوي التي يسببها أتسكامب-بروتينات فلورية خضراء المسمى التجميع TGN, كما هو موضح في الشكل 4 ، د، و، ز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن إشارة أوتوفلوريسسينت قليلاً في التبغ بمقدار-2 الخلايا والخلايا الجذرية والشعر جذر نبات بتطبيق نفس الإعدادات لمجموعة الصور أما بالنسبة الرقم 4 (تكميلية الشكل 1).

Figure 1
رقم 1: نظام قوي للمشارك التعبير متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. (أ) النهج التقليدية التعبير المشترك عابر متعددة مراسل الفلورسنت البروتينات في النباتات تحقيقه عبر انهانسر وقصف الجسيمات والتحول بوساطة شماعة بخلط عدة التعبير المستقل ناقلات الأمراض. (ب) الأسلوب التقليدي للتحول الوراثية النباتية المتبعة مع ناقل تعبير بروتين انصهار فلورسنت واحدة. للتعبير عن المشاركة متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في نبات المعدلة وراثيا، كذلك العبور الوراثي وجولات متعددة للفحص مطلوبة من أجل الحصول على نسلها متماثل. (ج) (د) طريقة التعبير المشارك البروتين البديلة الجديدة. فإنه يستفيد من ناقل تعبير واحد، وهي تتألف من عدة شرائط التعبير البروتين وقادرا على التعبير المشترك عدة مراسل الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات عن طريق كل عابر التعبير والتحول الوراثي. ونشرت تفاصيل هذا الرقم أولاً في تشونغ et al. 201736 (طبع بإذن؛ حدود حقوق التأليف والنشر في علم النبات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: البيان العملي لمبدأ العمل أسلوب الجمعية الحمض النووي خطوة واحدة عن طريق تفاعل جزئ متحاور. شظايا من الحمض النووي وبلازميد خطية متداخلة متواليات (OSs) مرفقة بالتقشير قاعدة بين 5 '-overhang متداخلة المناطق وتوسيع طريق بوليميراز الدنا وربطها ليجاسى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: استراتيجية بناء بلازميد وحيدة للتعبير عن المشاركة متعددة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات. يوضح الرسم التخطيطي استراتيجية بناء بلازميد تعبير واحد للتعبير المشترك عن البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة للتعبير عابرة أو تحول مستقر في النباتات. ناقل التعبير يتكون من اثنين من الأشرطة التعبير البروتين، كل منها يحتوي على الخاصة به العناصر اللازمة للتعبير البروتين، ووظائف في الإعراب عن البروتين الانصهار الفلورسنت تشيميريك الفردية شبه independently. الجمعية والترابط بين جميع جزيئات الحمض النووي مريح حققها أمثل متحاور في المختبر جزئ أسلوب وساطة مع أجزاء الحمض النووي متداخلة. ونشرت تفاصيل هذا الرقم أولاً في تشونغ et al. 201736 (طبع بإذن؛ حدود حقوق التأليف والنشر في علم النبات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: صور الممثل المشارك التعبير الانصهار الفلورسنت تشيميريك تم والشقي في الخلايا النباتية.
(أ) التعبير المشارك لطلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4-التجارة والنقل عبر قصف الجسيمات في الخلايا تعليق التبغ بمقدار 2. ((ب)) صورة تمثيلية لخلية جذر نبات المعدلة وراثيا شارك الإعراب عن طلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4--التجارة والنقل. تعامل جذور المعدلة وراثيا نبات (ج) و (د) شارك الإعراب عن طلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4--التجارة والنقل مع وورتمانين، ومنتدى بواو الآسيوي لمدة 30 دقيقة على التوالي. (ه) صورة تمثيلية للشعر جذر نبات المعدلة وراثيا شارك الإعراب عن طلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4--التجارة والنقل. (و) و (ز) المعدلة وراثيا نبات الشعر الجذر المشترك عن طلب تقديم العروض-AtVSR2 و AtSCAMP4--التجارة والنقل تم علاج مع وورتمانين، ومنتدى بواو الآسيوي 30 دقيقة أسهم في (د) و (ز) تشير إلى البروتينات المستحثة بمنتدى بواو الآسيوي التجميع. rp = معامل ارتباط Pearson؛ rs = ارتباط سبيرمان للرتب. هو مقياس بار في (أ)-(د) 50 ميكرون، (ه)-(ز) 30 ميكرومتر. تفاصيل هذا الرقم كانت نشرت لأول مرة في تشونغ et al. 201736 (طبع بإذن؛ حدود حقوق التأليف والنشر في علم النبات). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

كاسيت التعبير 1
1-FP35S جاتكجاجكتكجتاككك أكاتجتجاجكاكجاكاكا
1-RP35S أجاكجكججكجتججككات تاتكاكاتكاتككاكتجك
1-فرفب جكاجتجاتجاتجتجاتا أتجكككاكجكككجكجتككت
1-ررفب أتاتككاتاتكاكتككككا جكجككجتجاجتجكجك
1-FAtVSR2 جككجككاكتككاككجكجكك تجججاجتجاتاتجاتات
1-RAtVSR2 آآتجتتجاكجاتكججا تاكاكتكتاجتجاجاج
1-فنوس كتكتكاكتاجاجتجتا تكككجاتكجتكااكاتت
1-رنوس جاجاتجاتجكجاجتاتج تكتاجتاكاتاجاتجاكاك
التعبير كاسيت 2
2-FP35S كاتاكتكجكاتككاتكتك أكاتجتجاجكاكجاكاكا
2-RP35S تاجاتكجتجتكجتجككات تاتكاكاتكاتككاكتجك
2-FAtSCAMP4 جكاجتجاتجاتجتجاتا أتجكاكجاكاكجاتككتا
2-RAtSCAMP4 تككتكجكككتجكتكاككات تاجتجكاكجكاتكاجتكج
2-فجفب كجاككتجاتجكجتجكاكتا أتجتجاجكاججكجاجا
2-رجفب تاااككاااتككاجتجاك تاكتجتاكاجكتكجتككا
2-FT35S تجاكجاجكتجتاكاجتا جتكاكتجاتتتجتتتا
2-RT35S جتكجاكتكتاجاجاتكككك جتككجكااااتكاككاجتك

الجدول 1: استراتيجية تصميم التمهيدي وتسلسل المستخدمة في هذه الدراسة. ويرد اسم كل التمهيدي في اللوحة اليسرى. وتبرز متواليات متداخلة مكملة كبسولة تفجير. ونشرت تفاصيل هذا الجدول أولاً في تشونغ et al. 201736 (طبع بإذن؛ حدود حقوق التأليف والنشر في علم النبات).

الإضافي رقم 1: صور الممثل من أوتوفلوريسسينسي في الخلايا بمقدار 2 وجذور نبات وجذور الشعر. (أ) تم الكشف عن أوتوفلوريسسينسي الخلايا البرية نوع من-2 تحت نفس الظروف التصوير مع الخلايا المحولة. تم الكشف عن خلايا الجذر والشعر الجذر (ب) و (ج) أعطيت تحت نفس الظروف التصوير مع خلايا نبات محولة. مقياس بار في (أ)-(ج) هو 20 ميكرومتر. DIC، التباين التدخل التفاضلية. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا لقد أظهرنا طريقة جديدة للتعبير عن المشاركة قوة الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. فإنه يمكن استخدامها للتعبير عابرة والتحول الوراثي ومتوافق مع الحالية الفلورسنت القائم على البروتين بيو-التصوير الجزيئي والكيمياء الحيوية تطبيقات وتكنولوجيات9،10،13 . وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يتغلب على الصعوبات للأساليب التقليدية التي تستخدم عدة التعبير الفردي والبلازميدات للتعبير البروتين المشارك. وفي المقابل، يعمل ناقل تعبير واحد يحتوي على بروتين التعبير أشرطة متعددة مع المروجين الفردية الخاصة بهم، والعلامات الفلورسنت، البروتينات المستهدفة، والوحدات الطرفية. وعلاوة على ذلك، يمكن إدارة الكاسيت التعبير البروتين بشكل مستقل للوفاء بمتطلبات التعبير المتنوعة، مثل استخدام مروج محددة والانصهار تشيميريك الطرفي ن أو ج بروتين فلوري مع البروتين الهدف. ولذلك، مثل وظائف كاسيت التعبير البروتين عنصر "ليغو" أساسية التي يعمل شبه مستقل في بلازميد. وعلاوة على ذلك، وأيضا نظام متعدد الاستخدامات بدرجة في الجينات التي التحرير، والاستبدال، والجمعية كافة يمكن أن يتحقق بسهولة بفعل جزئ متحاور خطوة واحدة دون عمليات إضافية لأنزيم الهضم وعملية ربط. ونحن قد الأمثل كفاءة جزئ متحاور رد فعل من الدراسات السابقة، كما هو موضح في الخطوة 2، 4، عن طريق اختبار تركيزات مختلفة من بوليميراز "الدنا فوسيون" T5 [ااكسونوكلس] و [تق] [بولمرس]. وباﻹضافة إلى ذلك، تركيز الحمض النووي كل الأجزاء لرد فعل جزئ متحاور خطوة واحدة يقترح أن تكون بين 0.05 و 0.1 pmol تحقيق ربط الحد الأقصى من الكفاءة.

التعبير المفرط للتحوير الاستعاضة عن مروج الذاتية مع قوية ومروج المستمر، مثل المروج 10 أوبيكويتين (UBQ10)، وإدخال نسخ إضافية من الجين نهج بعنف المستخدمة لدراسة وظائفها الخلوية و إليه العامل الأساسي في الخلايا15،32. ومع ذلك، تثبيط أسفل اللائحة وقوية غير متوقعة من التعبير الجيني في بعض الأحيان عثر كذلك33،34. النسبة المئوية للجينات لا يمكن التنبؤ بها إسكات يتراوح من 2 إلى 100 ٪ تحت هذه الحالات33،35. وعلاوة على ذلك، إسكات الجينات لديها فرصة أكبر ليحدث في العديد من الجينات في وقت واحد، التحول من نسخ عالية من الحمض النووي، وزيادات كبيرة من الجينات المستوى النسخي9،33،24 ،35. من أجل تقليل حدوث الجينات إسكات في قوي متعددة نظام التعبير المشارك في البروتين الانصهار، اخترنا المروجين النشطة المختلفة محرك الأشرطة التعبير البروتين مختلفة عندما شارك الإعراب عن متعددة الانصهار البروتينات. وعلاوة على ذلك، علينا تجنب باستمرار استخدام نفس المروج لشرائط التعبير المختلفة. وباﻹضافة إلى ذلك، قيد محتمل آخر لهذا البروتوكول هو انخفاض كفاءة خطوة واحدة متحاور جزئ الحمض النووي الناجم عن الإعداد المتزايدة من البروتين التعبير كاسيت للمشارك التعبير. وعلاوة على ذلك، يعتمد العدد من أشرطة الكاسيت التعبير التي يمكن استضافتها في بلازميد التعبير النهائي أساسا على ريبليكون العمود الفقري بلازميد24،،من2535.

أخذت معا، قمنا بتطوير نظام قوي للمشترك معربا عن البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة مريح في النباتات36. أن يتغلب على أوجه قصور الأساليب الكلاسيكية، ويستخدم فعل الجمعية الحمض النووي خطوة واحدة أمثل لبناء الترابط وبلازميد الحمض النووي بطريقة العريقة. وقد تم التحقق من صحة هذا التقدم التقني ب AtVSR2 والتعبير AtSCAMP4 المشارك في مصنع الخلايا عن طريق التعبير عابرة والتحول الوراثي. ولذلك، فإنه يوضح أسلوب مقنع ورواية لجوانب مختلفة من الاكتشافات العلمية بالتعبير المشارك من الانصهار الفلورسنت تشيميريك البروتينات في النباتات. بالإضافة إلى ذلك، مفهوم ومبدأ التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة عن طريق ناقل تعبير واحدة متوافقة تماما مع تقنيات التعبير المفرط كريسبر-Cas9، [رني] والبروتين لدراسة الوظائف و التفاعلات متعددة الجينات في النباتات37،،من3839.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء المختبر وانغ لإجراء مناقشات مفيدة وتعليقات. يدعمه هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (تشرف، المنحة رقم 31570001) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ ومدينة قوانغتشو (منح رقم 2016A030313401 و 201707010024) للأب

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD-FX Polymerase TOYOBO KFX-101
Sma I NEB R0141L/S/V
Tris-HCl BBI A600194-0500
MgCl2 BBI A601336-0500
dNTP NEB #N0447V
DTT BBI C4H10O2S2
PEG 8000 BBI A100159-0500
NAD BBI A600641-0001
T5 exonuclease Epicentre T5E4111K
Phusion High-Fidelity DNA polymerase NEB M0530S
Taq DNA polymerase NEB B9022S
Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) Sigma M5524
Ethanol BBI A500737-0500
Tween 20 BBI A600560-0500
Agar BBI A505255-0250
Spermidine BBI A614270-0001
Gold microcarrier particles Bio-Rad 165-2263 1.0 µm
CaCl2 BBI CD0050-500
Macrocarriers Bio-Rad 165-2335
Rupture disk Bio-Rad 165-2329
Stopping screen Bio-Rad 165-2336
Tryptone OXOID LP0042
Yeast Extract OXOID LP0021
NaCl BBI A610476-0001
KCl BBI A610440-0500
Glucose BBI A600219-0001
Hygromycin B Genview AH169-1G
Wortmannin Sigma F9128
Brefeldin A Sigma SML0975-5MG
Dimethylsulphoxide (DMSO) BBI A600163-0500
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Growth chamber Panasonic MLR-352H-PC
PSD-1000/He particle delivery system Bio-Rad 165-2257
Gene Pulser Bio-Rad 1652660
Cuvette Bio-Rad 1652083
Benchtop centrifuge Eppendorf 5427000097
Confocal microscope Zeiss LSM 7 DUO (780&7Live)
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
EPS-300 Power Supply Tanon EPS 300
Fluorescent microscope Mshot MF30
Agrose BBI A600234
Ampicillin BBI A100339
Ethylene Diamine Tetraacetie Acid BBI B300599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  2. Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
  3. Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
  4. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  5. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
  6. Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
  7. Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
  8. Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
  9. Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
  10. Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
  11. Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
  12. Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
  13. Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
  14. Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
  15. Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
  16. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  17. Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
  18. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
  19. Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
  20. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
  21. Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
  22. Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
  23. Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
  24. Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
  25. Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
  26. Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
  27. Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
  28. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
  29. Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
  30. Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
  31. Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
  32. Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
  33. Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
  34. Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
  35. Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
  36. Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
  37. Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
  38. Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
  39. Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).

Tags

الكيمياء، 137 قضية، التعبير المشارك البروتين والبروتين الانصهار نيون تشيميريك، التعريب سوبسيلولار البروتين وديناميات، شرائط التعبير البروتين، خطوة واحدة رد فعل الجمعية الحمض النووي، وناقلات تعبير واحد، والتعبير عابرة، مستقرة التحول الوراثي
التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peng, X., Zhong, G., Wang, H.… More

Peng, X., Zhong, G., Wang, H. Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants. J. Vis. Exp. (137), e57354, doi:10.3791/57354 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter