Summary
Мы разработали новый метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растения преодолевать трудности обычных методов. Он принимает преимущество использования плазмида одного выражения, содержащего несколько функционально независимой белка, выражая кассет для достижения совместного выражения протеина.
Abstract
Информация о пространственно-временных внутриклеточных localization(s) белок имеет решающее значение для понимания ее физиологических функций в клетках. Флуоресцентные белки и поколения флуоресцентные синтез белков дико использовались как эффективный инструмент непосредственно визуализировать локализация белка и динамика в клетках. Это особенно полезно сравнить их с известным органеллы маркеры после совместного с белками проявление интереса. Тем не менее обычно включают несколько независимых выражений плазмид классические подходы для совместного выражения протеина в растениях и поэтому имеют свои недостатки, которые включают низких совместно выражение эффективности, уровня выражения вариации и высокое время расходы в генетических пересечения и скрининг. В этом исследовании мы описываем надежные и Роман метод для совместного выражение несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Он преодолевает ограничения обычных методов, используя одно выражение вектор, состоящий из нескольких полунезависимых выражая кассеты. Каждая кассета выражение протеина содержит элементы выражения своих собственных функциональных белков, и поэтому она может быть гибко скорректирована для удовлетворения спроса на разнообразные выражения. Кроме того это просто и удобно для выполнения сборки и манипуляции с ДНК фрагментов в выражение плазмида с помощью оптимизированного одношаговый реакции без дополнительных пищеварение и перевязка шаги. Кроме того он полностью совместим с текущей флуоресцентный белок Производные био изображений технологий и приложений, таких как ладу и БМФЦ. Как проверка метода мы использовали эту новую систему совместного Экспресс дневно сплавили вакуолярной сортировки рецепторов и несущей мембранных белков. Результаты показывают, что их перспективы субцеллюлярные локализации такие же, как предыдущие исследования переходных выражение и генетической трансформации в растениях.
Introduction
Химерных флуоресцентные синтез белков было рассматривать как полезные инструменты для изучения внутриклеточных динамика и внутриклеточных локализации и более глубокого понимания их физиологических функций и рабочих механизмов1,2, 3 , 4. Это особенно выгодно для совместного Экспресс известных органеллы репортер белки с белком, о котором идет речь, чтобы лучше проиллюстрировать его пространственно-временных обоснование, распределение и функции в системе endomembrane в клетки4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Химерных флуоресцентные синтез белка может быть выражено в растения через переходные выражение и стабильные генетические трансформации, которые имеют свои соответствующие преимущества и ограничения9,10,11. Переходных выражение протеина является удобный подход, который включает в себя баллистической бомбардировки-, полиэтиленгликоль (PEG)-, или электропорация опосредованной ДНК переходных выражение в протопласта и Agrobacterium-опосредованного проникновения лист в клетки растений нетронутыми, как показано на рисунке 1A, B12,13,14,,1516. Однако, Сопредседатель выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в одном растительной клетки требует смесь нескольких независимых выражений плазмид. Таким образом, недостатки использования нескольких плазмиды для совместного выражения протеина в растениях, низких совместно выражение из-за резко снижение шансов несколько плазмид одновременно ввести те же клетки, когда по сравнению с одной плазмида и вариации уровнях выражения протеина, вызванные неудержимо случайное количество каждого типа плазмида, передаваемых в ячейке17,18. Кроме того это технически сложно внедрить несколько независимых выражений плазмид в единый Agrobacterium белка совместного выражения9,10,11. Таким образом, Agrobacterium-опосредованной белка, переходных выражение проникновения табака выходит только способен выражения одного плазмида в то время, как показано на рисунке 1B. В отличие от поколения трансгенных растений, выражая флуоресцентные синтез белков обычно достигается Agrobacterium , который несет Двоичные преобразования вектора. Однако бинарный вектор, которая опосредует перенос генов и вставки в геномах растений способен только выражения одного флуоресцентные фьюжн белка (рис. 1B)9,10,12. Создание трансгенных растений, которая выражает несколько химерных флуоресцентных белков одновременно требует нескольких раундов генетических пересечения и отбора, которая может занять от месяцев до года в зависимости от числа генов быть совместно выразили.
Занятости, что одно выражение вектор для совместного выражение несколько белков в заводе было сообщено несколько предыдущих исследований19,,2021. Однако для генерации окончательный плазмида совместного выражения протеина или гиперэкспрессия обычно требуется несколько раундов ферментативного пищеварения и перевязка ДНК молекул ДНК и магистральной векторов. Здесь мы разработали новый и надежный метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентных белков в растениях. Это очень эффективный и удобный способ, который достигает несколько совместного выражения протеина в растениях и переходных выражения и стабильной преобразования в освященной веками моды. Он использует единый вектор, содержащий несколько функционально независимой белка выражение кассеты для совместного выражения протеина и тем самым преодолевает недостатки обычных методов. Кроме того это очень гибкая система, в которой ДНК манипуляции и Ассамблеи достигается простой одношаговый оптимизированный реакции без дополнительных шагов ДНК пищеварение и перевязки. Принцип работы показана на рисунке 2. Кроме того он полностью совместим с текущей сотовой, молекулярной и биохимической подходы, основанные на химерных флуоресцентные синтеза белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. грунтовка разработки стратегии и амплификации ДНК
- Дизайн праймеров для молекулярное клонирование фрагментов ДНК. Праймеры состоят из 20 bp последовательностей гена конкретной привязки и 20-25 bp 5'-конце навеса последовательностей, которые являются взаимодополняющими перекрывающихся последовательность соседних молекул ДНК (см. таблицу 1 для примера).
Примечание: Последующие сборки каждого ДНК фрагментов, увязка различных белков выражение кассет, и интеграции с вектором окончательное выражение все зависит от признания соседних перекрывающихся последовательностей. - Усилить фрагментов ДНК, включая промоутер, флуоресцентный репортер, целевых генов и Терминатор, которые являются необходимыми для строительства полуавтономных белка выражение кассеты по стандартным ПЦР-реакции с их соответствующими праймерами и высокая верность полимеразы.
Примечание: Шаблоны, используемые в данном исследовании для амплификации ДНК являются производными от предыдущих исследований15,,22-23. Отжига температура и расширение время ПЦР-реакции являются грунт и зависимых генов.
2. ДНК фрагмента Ассамблеи и строительство кассеты выражения протеина
- Изучить качество продуктов ПЦР первом туре методом электрофореза ДНК и количественно спектрофотометра. Проверьте, произошли ли ДНК деградации и загрязнения, электрофорезом геля агарозы 1%. OD260/OD280 продуктов PCR должна быть между 1.6 и 1.8.
- Смешивать различные фрагменты ДНК (0.05 - 0.1 пмоль каждого фрагмента) в новом ПЦР-пробирку в окончательный объем 5 мкл.
Примечание: Молекулы ДНК смесь предназначена для же кассету выражение протеина вместе в одном ПЦР-пробирку. Избегайте смешивания ННУ из различных выражений кассеты вместе, так как это снизит эффективность Ассамблеи ДНК за счет увеличения числа молекул ДНК, которые должны быть связаны.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Подготовить 5 x ISO запасов буфера: 500 мм трис-HCl, рН 7,5; 50 мм MgCl2; 1 мм deoxynucleotide (dNTP); Дитиотреитол 50 мм; 25% полиэтиленгликоля (PEG) 8000; и 5 мм Никотинамидадениндинуклеотид (NAD).
- Сделать 1 мл 2 x мастер смесь из 400 мкл 5 x ISO запасов буфера, 7,5 единиц при exonuclease T5, 62,5 единиц высокой верности ДНК-полимеразы, 5000 единиц полимеразы Taq (см. Таблицу материалы), и стерилизовать двойной дистиллированной H2O.
Примечание: Это адаптирован из предыдущих исследований24,,2526; Эти тома должны быть оптимизированы. - Аликвота 100 мкл 2 x мастер смесь в трубки и хранить при температуре от-20 ° C.
Предупреждение: Частые замораживания и оттаивания 2 x мастер смеси может привести к низкой эффективности Ассамблеи ДНК. - 15 мкл 2 x мастер смесь 5 мкл ДНК смесь и Инкубируйте на 50 ° C 60 мин.
3. Строительство вектора для совместного выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растений
- Усилить выражение кассету целиком полунезависимую белка второй раунд ПЦР с помощью продукта (0,5 - 1,0 мкл) от первого раунда изотермический Ассамблея реакции как шаблон и внешней грунтовки (например, 1-FP35S и 1-RNOS для выражения Кассета 1).
- Использование 1 единица высокой верности полимеразы в объеме 50 мкл реакции следуют 30 циклов (94 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s и 68 ° C на 2 мин), а затем окончательное расширение на 68 ° C за 5 мин.
- Линеаризации окончательный белка выражение позвоночника векторов pUC18 и pCAMBIA1300, которые предназначены для переходных выражения протеина и генетической трансформации, соответственно, путем добавления 4 единицы Sma я в окончательный объем реакции 10 мкл и инкубирования 1 - 2 ч при 25 ° C. Инактивирует энзима ограничения по инкубации при 65 ° C для 20 мин.
- Смешайте эквимолярных ДНК молекул белка выражение кассеты и линеаризованное окончательного вектора в том окончательный реакции 5 мкл. Затем выполните второй раунд рекомбинации ДНК путем смешивания с 15 мкл 2 x мастер буфера и инкубации при 50 ° C 60 мин.
- Используйте окончательные продукты реакции второго раунда изотермический рекомбинации чтобы преобразовать сведущее Escherichia coli клетки (например, DH5α), в соответствии со стандартными процедурами27. Перепроверить положительных колоний на ПЦР секвенирования колонии. Извлеките положительных плазмид от кишечной палочки с помощью мини-плазмида добыча комплект и хранить при температуре-80 ° C.
Предупреждение: Для длительного хранения, плазмиды растворенными в буфере TE или двойной дистиллированной H2O более устойчивы, чем держать их в штаммов E. coli .
4. баллистической бомбардировка опосредованной переходных Сопредседатель выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растений
- Подготовка табака BY-2 подвеска клетки и несовершеннолетних растения арабидопсис для бомбардировки.
- Культура по-2 клетки в среде фотосинтетическую и Скуг (МС), subculturing два раза в неделю при 25 ° C в шейкере на 130 об/мин. D сбор 30 мл 3 фильтр культивированный BY-2 клетки на кусок 70-мм газобетона фильтровальной бумаги через в вакуумный насос, установив вакуумного давления 40 мбар.
- Для того, чтобы предотвратить клетки от пересыхания во время следующих шагов, добавьте несколько капель BY-2 клетки жидкой культурной среды в чашке Петри перед размещением фильтровальная бумага (следующий шаг).
- Передать фильтр бумага с BY-2 клетки на нем новый Петри (85 мм x 15 мм).
- Поверхность стерилизовать Arabidopsis thaliana (Col-0) семена, vortexing смесь с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% Tween-20 за 10 мин.
- Спин вниз семена с помощью центрифуги Топ скамейке на Макс скорость для 2 s, удалить супернатант и мыть семена с 100% этанола один раз за 30 с. пипетку из семян на новых стерильных фильтровальную бумагу в стерильных Худ. Затем просушите семена и распространения их на ½ MS плиты агара.
- Хранить пластины на 4 ° C за 48 часов до их передачи в камере роста растений со следующими параметрами: 16 h свет 8 h темные с 120-150 мкм м-2 s-1 интенсивностью, 22 ° C.
- Передача 7 - день старого образца растений в круг диаметром 30 мм в центре новой ½ MS средних пластины для повышения эффективности бомбардировки.
Внимание: Избегайте дублирования растений при передаче и размещение их на новую пластину ½ MS. - Добавьте несколько капель ½ MS жидкой среды на поверхности растений или ткани для сохранения влаги и предотвращения высыхания растений, на следующих этапах.
- Герб золотые частицы с плазмидной ДНК.
- Вихревой золото microcarrier раствор тщательно, на 3 мин готовят новый 1,5 мл трубки.
- Последовательно добавить следующие решения в трубку и вихревой: 25 мкл (1,5 мг) золотые частицы, вихревой 10 s; 10 мкл 25,46 мг/Л спермидина, вихревой 10 s; 5 мкл 1µg/мкл плазмидной ДНК, вихревой 3 мин; 25 мкл 277.5 мг/л раствора2 CaCl, вихревые 1 мин.
Внимание: Держите vortexing во время этого шага. - Спин вниз золото microcarriers, с помощью скамейке Топ центрифуги на Макс скорость 5 s и тщательно пипетку вне супернатант не нарушая гранулы. Вымойте с 200 мкл абсолютного этанола и вновь приостановить Пелле, вихревые за 5-10 с. спин вниз на Макс скорость 5 s и удалить этанола.
- Вновь приостановите золотые частицы в 18 мкл абсолютного этанола и аликвота 6 мкл частицы подвеска на середине трех macrocarriers. Дайте им высохнуть на воздухе.
- Передача ДНК в растения через бомбардировка частиц.
- Установите систему доставки частиц следующим: 1100 psi, 28-мм Hg вакуума, разрыв 1 см расстояние и дальность полета-9см частиц.
- Бомбардируют клетки, растения на средних плита агара три раза в три различные позиции, а затем сохранить клетки, растения в темноте сразу же после бомбардировки.
Предупреждение: Носить защитные очки при работе с системой доставки частиц из-за ассоциации высокого давления газа и высокоскоростных частиц с системой.
- Держите обстреляли клетки, растения в темноте в камере роста растений для 6 до 72 часов до наблюдения флуоресцентные сигналов. Установите камеры роста растений 24 h темно и 22 ° C.
Предупреждение: Выражение эффективность и интенсивность флуоресцентного сигнала являются промоутер - ген- и завод/ткани зависимых.
5. создание стабильной трансгенных Arabidopsis, совместно выражая несколько химерных флуоресцентных белков, Agrobacterium-опосредованной трансформации.
- Оттепель Agrobacterium сведущие клетки (PMP90) на льду и подождите 30 минут, затем добавить 2 мкл бинарный вектор (100-200 ng) (подготовлен выше) в компетентных клетки. Смесь сидите на льду за 10 мин.
- Передача смеси в кювет электропорации предварительно охлажденные 0,1 см. Вставить кювета в системе электропорации и выполнить электропорации с следующими параметрами: 1,6 кв, 600 Ом, 25 МКФ.
- Добавьте 1 mL SOC жидкой среды в кювет сразу же после электропорация, Пипетка клетки в новой 1,5 мл трубку и Инкубируйте на 28 ° C в горизонтальной орбитальный шейкер на 200 об/мин для 120 мин.
- Центрифуга клетки на 2348 x g при комнатной температуре в течение 5 мин, отменить большинство супернатанта, нежно вновь приостановить гранулированных клетки с кончиком пипетки, выкладывают их на плиту LB содержит 50 мг/Л Hygromycin B и Инкубируйте на 28 ° C на 2-3 дней.
- Преобразования Arabidopsis thaliana Col-0 растения с Agrobacterium, который содержит бинарный вектор pCAMBIA1300, интегрирована с несколькими кассеты выражение протеина, методом28 цветочные купанием как описано в генерировать стабильные трансгенных растений.
- Стерилизовать поверхности трансгенных семян Arabidopsis, смешивая их с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% 20 анимации. Вортекс для 10 min. спин вниз семена с помощью центрифуги Топ скамейке на Макс скорость для 2 s, удалить супернатант и мыть семена с 100% этанола один раз за 30 s.
- Пипетка, семена на стерильного фильтра бумагу в стерильных Худ. После этого воздух сухой и распространения их на ½ MS плиты агара, содержащие Hygromycin B для скрининга позитивные потомков.
- Инкубируйте пластины на 4 ° C на 2 дня. Затем перенесите их в камере роста растений и культуру для 7 дней.
- Выберите 7 - дневных выживания несовершеннолетних растений, установив для флуоресцентных сигналов под флуоресцентный Микроскоп, а затем передавать растений в почву для дальнейшего скрининга гомозиготных растений.
6. фармацевтического лечения
- Для фармацевтического лечения развести каждого лекарства в жидкой среде MS в ее соответствующих рабочих концентрациях до инкубации клеток или растений.
- Вортманнин лечение: подготовить 1 мм акций решения Вортманнин путем растворения порошка Вортманнин в ДМСО и хранить запасы при-20 ° C. Передача несовершеннолетних растений или растительных клеток в жидкой среде MS, содержащие 16,5 микрон wortmammin и Инкубируйте 30-45 мин до изображений.
- Лечение Brefeldin (БФА): подготовка 1 мм запасов решений БФА путем растворения порошка БФА в ДМСО и хранить запасы при-20 ° C. Передача несовершеннолетних растений или растительных клеток в жидкой среде MS, содержащие 10 мкг/мл БФА за 30-45 мин до изображений.
7. Конфокальный микроскоп изображений и белка субцеллюлярные Сопредседатель локализации анализ
- Передача несовершеннолетних растений или подвеска клетки на слайд обычного стекла и аккуратно положить слайд крышка на верхней части для изображений, стандартных Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Используйте следующие параметры: 63 X воды цель (N.A 1.4), 0 фон, 700 выгоды, размер пикселя 0,168 мм и фотоэлектронный умножитель Трубка детектора. Возбуждают GFP-тегами белков в 485 Нм и обнаруживать флуоресценции в 525 Нм. Для ЗП тегами белков, возбуждают в 514 Нм и обнаружить на 575 Нм.
- Вычислить коэффициент совместного локализации флуоресцентные сигналов с использованием изображений J программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/) с Пирсона и Спирмена корреляции (PSC) совместно локализации плагин как описано8. Коэффициенты корреляции Пирсона или ранга коэффициенты корреляции Спирмена отображаются в результатах (рис. 4). Значения производимых r будет от -1 до 1. 0 демонстрирует отсутствие обнаружению корреляции двух сигналов, тогда как + 1 и -1 показывают полный положительной и отрицательной корреляции, соответственно, двух сигналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы разработали надежные и очень эффективный метод для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Оно ломает через барьеры обычных подходов использовать несколько разделенных плазмиды для совместного выражения протеина, как показано на рисунке 1A, B, через переходные выражение или стабильной генетической трансформации. В этом новом методе мы генерируем одно выражение вектор, состоящий из нескольких кассеты выражение протеина для достижения совместного выражения протеина в одно время (рис. 1 cD). Выражение кассеты функций белков полу independently с собственной необходимые элементы ДНК для выражения протеина. Таким образом каждая кассета выражение протеина могут быть настроены независимо согласно различных требований для выражения протеина. Как вектор Сопредседатель выражение окончательного белка кассеты выражения белка в нем функционировать как основные «Lego» элементы, которые могут быть изменены, реконструировано. и вновь размещены удобно. Кроме того просто достигается альтернативную стратегию для Ассамблеи молекулы ДНК, увязка несколько кассет выражения протеина и интеграции фрагментов ДНК с вектор конечного назначения для совместного выражения химерных флуоресцентные синтеза белков через оптимизированная изотермическая в vitro рекомбинации реакции без дальнейших дополнительных шагов ДНК пищеварение и взаимосвязи. Принцип работы реакции рекомбинации изотермический в vitro показано на рисунке 2. Связь нескольких молекул ДНК (например, три представителя ДНК фрагменты 1-3 показано на рис. 2) и их интеграции с вектором окончательное выражение просто и эффективно достигаются одношаговый реакции (см. рисунок 2 ). Он заимствован из предыдущих исследований перекрывающихся рекомбинации молекул ДНК, при посредничестве с перекрывающимися коротких последовательностей для достижения Слияние фрагментов ДНК и строительство плазмид25,26.
Как тест метода мы выбрали вакуолярной сортировки рецептор (ВСР) и Выделительный протеин несущей (СКЕМП), которые являются два репортера белки, участвующие в белка секреторных и пути эндоцитоза, соответственно6,22 ,23,29,30. VSRs являются тип-я неотъемлемой мембранных белков, которые посредником биосинтетических белка трафика в секреторную путь вакуоль и главным образом локализуется в prevacuolar отсеков (PVC) в растения6,22,23. В отличие от несущей мембранных белков (Сорванцы), тип IV мембранных белков, которые участвуют в завод endocytic пути. Он локализуется на плазматической мембраны (ПП) и транс-Гольджи сетей (TGNs), которые служат в качестве раннего endosomes22,29,30. Мы построили две кассеты выражение протеина, принимающие химерных сплавливания арабидопсиса VSR2 (AtVSR2) с ЗП и арабидопсиса SCAMP4 (AtSCAMP4) с GFP, как показано на рисунке 3. Чтобы убедиться, что ЗП-AtVSR2 может быть переведен в ER, сигнал пептид (SP) добавляется перед ППП, как ранее сообщалось в6,31. Две кассеты выражение индивидуальных белков далее взаимосвязаны и перевязать с окончательной белка выражение вектор pUC18 или pCAMBIA1300 для совместного выражения протеина либо через белка переходных или растений стабильной преобразования, как показано в На рисунке 3. AtVSR2 и AtSCAMP4 были успешно совместно выражается в табак BY-2 клетки через бомбардировка частиц и показал правильной локализации (рис. 4A). ЗП-AtVSR2 показало пунктата шаблон, который отличается от локализации плазматической мембраны AtSCAMP4-GFP с некоторыми цитозольной пунктата точек. Кроме того, Arabidopsis трансгенных растений, которые совместно Экспресс AtSCAMP4-GFP и ЗП-AtVSR2 были созданы через Agrobacterium-опосредованной трансформации. Субцеллюлярные локализации совместно выражения ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-ГФП в клетках корня и корень волос были показаны в рисунке 4В и 4E. Результаты совместного выражения ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-GFP получены трансгенные Arabidopsis были согласны с те из клеток по-2. Кроме того трансгенных Arabidopsis лечили Вортманнин и БФА на 30 мин Wortmmanin вызвало ЗП-AtVSR2 помечены PVC, образуя небольшой кольцо как структура и БФА индуцированных AtSCAMP-GFP помечены TGN агрегации, как показано в Рисунок 4 c , D, F, G. Кроме того мало autofluorescent сигнала могут быть обнаружены в табак BY-2 клетки и клетки корня и корневого волоска Arabidopsis, применяя те же параметры коллекции изображений как Рисунок 4 (Дополнительные рис. 1).
Рисунок 1: надежная система для совместного выражение несколько химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. (A) традиционные подходы переходных совместного выражения нескольких флуоресцентные репортер белков растений достигнуты через электропорация, бомбардировка частиц и ПЭГ опосредованной трансформации, смешивая несколько независимых выражений векторы. (B) обычный метод для генетической трансформации растений путем Agrobacterium с вектором выражения белка одного флуоресцентные фьюжн. Совместно выразить несколько химерных флуоресцентные синтез белков в трансгенных растений, дальнейшие генетические пересечения и нескольких раундов скрининга для получения гомозиготных потомков. (C) и (D) альтернативный новый метод совместного выражения протеина. Он использует одно выражение вектора, который состоит из нескольких кассеты выражение протеина и способен выразить совместно несколько химерных репортер флуоресцентные белки в растения через оба переходных выражение и генетической трансформации. Подробности этой фигуры были впервые опубликованы в Zhong и др. 201736 (Перепечатано с разрешения; границы авторского права в науке растений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: демонстрация принцип работы одношаговый ДНК Ассамблеи методом изотермической рекомбинации реакции. Базовый кожура между 5'-свес перекрывающихся регионов, расширяя ДНК-полимеразы и увязки лигаза прикреплены фрагментов ДНК и линеаризованное плазмида с перекрывающимися последовательностями (OSs). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: стратегия построения единого плазмиду для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков. Диаграмма показывает стратегия построения плазмида одно выражение для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков для переходных выражение или стабильной трансформации в растениях. Вектор выражение состоит из двух кассет выражения белка, каждая из которых содержит свой собственный необходимые элементы для выражения протеина и функции выражая его отдельных химерных флуоресцентные синтез белка полу independently. Оптимизированная изотермическая в vitro методом рекомбинации опосредованной с перекрывающихся фрагментов ДНК удобно достигаются Ассамблеи и взаимосвязи всех молекул ДНК. Подробности этой фигуры были впервые опубликованы в Zhong и др. 201736 (Перепечатано с разрешения; границы авторского права в науке растений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель изображения совместного выражения химерных флуоресцентные фьюжн VSR и СКЕМП в клетках растений.
(A) сотрудничество выражение ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-GFP через бомбардировка частиц в клетках подвеска табака по-2. (B) представитель изображение трансгенных корня Arabidopsis клетки совместно выражая ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-GFP. (C) и (D) корни трансгенных Arabidopsis , совместно выражая ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-ГФП были относиться с Вортманнин и БФА 30 мин соответственно. (E) представитель изображение трансгенных Arabidopsis корневого волоска совместно выражая ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-GFP. (F) и (G) трансгенных Arabidopsis корневых волосков, которые совместно выражая ЗП-AtVSR2 и AtSCAMP4-GFP лечили Вортманнин и БФА на 30 мин стрелки в (D) и (G) указывают БФА индуцированного белка Агрегация. rp = коэффициент корреляции Пирсона; rs = корреляции Спирмена. Линейки в (A)-(D) — 50 мкм, (E)-(G) — 30 мкм. детали этой фигуры были впервые опубликованы в Zhong и др. 201736 (Перепечатано с разрешения; границы авторского права в науке растений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Выражение кассета 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Выражение кассета 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-FGFP | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Таблица 1: грунтовка разработки стратегии и последовательности, используемые в данном исследовании. На левой панели дается имя каждого праймера. Дополнительные перекрытие последовательностей праймеры подчеркнуты. Подробности этой таблицы были впервые опубликованы в Zhong и др. 201736 (Перепечатано с разрешения; границы авторского права в науке растений).
Дополнительные рисунок 1: представитель изображений аутофлюоресценция BY-2 клетки и арабидопсиса корни и корневые волоски. (A) аутофлюоресценция дикого типа BY-2 клетки был обнаружен на тех же условиях изображений с трансформированных клеток. (B) и (C) Arabidopsis корневого волоска и корневых клеток были обнаружены на тех же условиях изображений с трансформированных клеток арабидопсиса. Линейки в (A)-(C) — 20 мкм. ОПК, дифференциальной помехи контраст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы продемонстрировали новый метод выразить энергично совместно химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Он может использоваться для переходных выражения и генетической трансформации и совместим с текущей флуоресцентного белка на основе био изображений, молекулярной и биохимической приложений и технологий9,10,13 . Кроме того он преодолевает трудности обычных методов, которые используют несколько плазмидов индивидуального выражения для совместного выражения протеина. Напротив она использует одно выражение вектор, содержащий несколько кассет выражение протеина с их собственных индивидуальных промоутеров, флуоресцентные метки, белков-мишеней и терминаторы. Кроме того кассета выражение протеина может управляться независимо для удовлетворения требований различных выражений, например использование конкретной промоутера и N - или C-терминал химерных сплавливание флуоресцентный белок с целевого белка. Таким образом функции кассеты выражение протеина как базовый элемент «Лего», который работает полу независимо в плазмиду. Кроме того это также очень гибкая система, в которой гена, редактирования, замены, и Ассамблея все могут быть легко достигнуты одношаговый изотермический рекомбинации реакции без дополнительных процессов пищеварения энзима и перевязки. Мы оптимизировали эффективность изотермический рекомбинации реакции от предыдущих исследований, как описано в шаге 2.4, тестируя различные концентрации при exonuclease T5, Phusion ДНК-полимеразы и полимеразы Taq. Кроме того концентрация каждого ДНК фрагментов для реакции изотермический рекомбинации одношаговый предлагается составлять 0,05 и 0,1 пмоль для достижения максимальной лигирование эффективности.
Гиперэкспрессия трансген, заменив его эндогенного промоутер с сильной и постоянной промоутер, таких как промоутер убиквитин-10 (UBQ10) и введение дополнительных копий гена это дико используется подход для изучения клеточных функций и основной рабочий механизм в клетки15,32. Однако неожиданные вниз регулирование и сильным ингибированием экспрессии генов иногда был также найден33,34. Процент от непредсказуемых гена, глушителей колеблется от 2 до 100% в этих ситуациях33,35. Кроме того, заставлять замолчать гена имеет более высокий шанс случиться в экспрессию нескольких генов одновременно, преобразование высокой копий ДНК, и значительный рост гена транскрипционный анализ уровня9,33,24 ,35. Для того, чтобы свести к минимуму возникновение глушитель в надежные несколько синтеза белка совместного выражения гена, мы выбрали различных активных промоутеров водить кассеты выражения различных белков при совместном выражении несколько синтеза белков. Кроме того мы избегали, постоянно используя же промоутер для выражения различных кассет. Кроме того другим потенциальным ограничением этого протокола является снижение эффективности одношаговый изотермический рекомбинации ДНК вызвано увеличением числа кассеты выражение протеина для совместного выражения. Кроме того Количество кассет выражения, которые могут быть размещены в окончательное выражение плазмида главным образом опирается на репликоном позвоночника плазмида24,25,35.
Взятые вместе, мы разработали мощную систему для совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков удобно в растения36. Он преодолевает ограничения классических методов и использует оптимизированные одношаговый ДНК Ассамблеи реакции на строительство взаимосвязи и плазмида ДНК в освященной веками моды. Этот технический прогресс был проверен AtVSR2 и Сопредседатель выражение AtSCAMP4 заводе клетки через переходные выражение и генетической трансформации. Таким образом он демонстрирует убедительные и Роман метод для различных аспектов научных открытий выражением совместного химерных флуоресцентные синтез белков в растениях. Кроме того, концепция и принцип совместного выражения несколько химерных флуоресцентные синтез белков через одно выражение вектор полностью совместимы с ТРИФОСФАТЫ-Cas9, интерферирующих РНК и белков гиперэкспрессия технологий для изучения функций и взаимодействия нескольких генов растений37,,3839.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов Ван лаборатории полезные обсуждения и комментариев. Эта работа поддерживается Национальный фонд Китая естественных наук (NSFC, Грант № 31570001) и фонд естественных наук провинции Гуандун и город Гуанчжоу (Грант № 2016A030313401 и 201707010024) для H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Tsien, R. Y., Miyawaki, A. Seeing the machinery of live cells. Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).
- Wang, H. Visualizing Plant Cells in a Brand New Way. Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).
- Tse, Y. C., et al. Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells. Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).
- Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall. Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).
- Wang, H., et al. A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation. Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).
- Canto, T. Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints. Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).
- Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).
- Li, S., et al. Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean. Front Plant Sci. 8, 246 (2017).
- Manavella, P. A., Chan, R. L. Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies. Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).
- Martin, K., et al. Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta. Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).
- Miao, Y., Jiang, L. Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells. Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).
- Wang, H., Jiang, L. Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes. Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Candat, A., et al. Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions. Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Binder, A., et al. A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants. PLoS One. 9 (2), e88218 (2014).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).
- Forner, J., Binder, S. The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants. BMC Plant Biol. 7, 28 (2007).
- Wang, H., et al. Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth. Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).
- Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes. Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).
- Chen, W. X., et al. Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).
- Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination. Gene. 548 (1), 39-42 (2014).
- Torella, J. P., et al. Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly. Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).
- Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha. Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
- Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).
- Lam, S. K., et al. Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells. Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).
- Jiang, L., Rogers, J. C. Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways. J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).
- Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans. Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).
- Bruening, G. Plant gene silencing regularized. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).
- Wassenegger, M., Pelissier, T. A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants. Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).
- Dehio, C., Schell, J. Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).
- Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants. Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).
- Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops. Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).
- Zhu, Q. L., et al. Development of "purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system. Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).
- Tang, H. W., et al. Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes. Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).
