Summary
Nous avons développé une nouvelle méthode pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes à surmonter les difficultés des méthodes conventionnelles. Il prend avantage d’utiliser un plasmide d’expression unique qui contient plusieurs protéines fonctionnellement indépendant exprimant des cassettes pour atteindre la co-expression de protéine.
Abstract
Informations sur la localization(s) subcellulaire spatio-temporelle d’une protéine sont essentielles de comprendre ses fonctions physiologiques dans les cellules. Protéines fluorescentes et génération des protéines de fusion fluorescents ont sauvagement servis comme un outil efficace pour visualiser directement la localisation des protéines et la dynamique dans les cellules. Il est particulièrement utile pour les comparer avec des marqueurs de l’organite bien connu après la co-expression avec la protéine d’intérêt. Néanmoins, les approches classiques pour la co-expression de protéines chez les plantes impliquent généralement plusieurs plasmides d’expression indépendante et par conséquent ont des inconvénients qui incluent la co-expression de faible efficacité, variation du niveau de l’expression et grand temps dépenses en traversant et le dépistage génétiques. Dans cette étude, nous décrivons une méthode nouvelle et robuste pour la co-expression de multiples protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. Il surmonte les limites des méthodes courantes à l’aide d’un vecteur d’expression unique qui se compose de plusieurs cassettes exprimant semi-indépendante. Chaque cassette d’expression de protéine contient ses propres éléments d’expression de protéine fonctionnelle, et par conséquent il peut être souple ajusté pour répondre à la demande de l’expression diversifiée. En outre, c’est facile et pratique d’effectuer l’assemblage et manipulation de l’ADN des fragments dans le plasmide d’expression à l’aide d’une réaction en une seule étape optimisé sans digestion supplémentaire et étapes de ligature. En outre, il est entièrement compatible avec les technologies actuelles de bio-imagerie des protéines fluorescentes dérivées et applications, telles que la frette et BiFC. Comme une validation de la méthode, nous avons utilisé ce nouveau système récepteur tri vacuolaire express co fluorescent fusionnés et protéines membranaires du porteur. Les résultats montrent que leurs localisations subcellulaires perspective sont les mêmes que dans les études antérieures par expression transitoire et transformation génétique chez les plantes.
Introduction
Protéines chimériques fluorescentes fusion ont été considérés comme des outils utiles pour étudier la dynamique intracellulaire et localisation subcellulaire et mieux comprendre leurs fonctions physiologiques et le travail des mécanismes1,2, 3 , 4. il est particulièrement bénéfique aux protéines de journaliste bien connu organite express Co avec la protéine en question pour mieux illustrer son raisonnement spatio-temporel, la distribution et l’ou les fonctions au sein du système endomembranaire dans les cellules4 , 5 , 6 , 7 , 8.
Une protéine de fusion fluorescent chimérique peut être exprimée dans les plantes par expression transitoire et de la transformation génétique stable, qui ont leurs avantages respectifs et les limites de10,9,11. Expression transitoire d’une protéine est une approche pratique qui comprend biolistique bombardement-, polyéthylène glycol (PEG)-, ou expression transitoire ADN induite par électroporation de protoplastes et Agrobacterium-médiée par infiltration de la feuille dans cellules végétales intactes, comme illustré à la Figure 1 a, B12,13,14,15,16. Toutefois, la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion dans une cellule végétale unique exige un mélange de plusieurs plasmides d’expression indépendante. Ainsi, les inconvénients d’employer plusieurs plasmides pour la co-expression de protéines chez les plantes sont plus faibles en raison de la chance considérablement réduite de plusieurs plasmides entrer simultanément dans les mêmes cellules par rapport à un plasmide, la co-expression et le variations des niveaux d’expression de protéine causées par le volume de chaque types de plasmide transféré dans la cellule17,18incontrôlable aléatoire. En outre, il est techniquement difficile d’introduire plusieurs plasmides d’expression indépendante dans un seul Agrobacterium pour la protéine co-expression9,10,11. Par conséquent, Agrobacterium-médiation protein expression transitoire par infiltration de tabac laisse est seulement capable d’exprimer un plasmide simultanément, comme illustré dans la Figure 1 b. En revanche, la génération de plantes transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent est habituellement obtenue par Agrobacterium qui transporte un vecteur de transformation binaire. Toutefois, le vecteur binaire qui intervient dans le transfert de gène et l’insertion dans le génome de la plante n’est capable d’exprimer une seule fusion fluorescent protéine (Figure 1 b)9,10,12. Générant une plante transgénique exprimant simultanément plusieurs protéines fluorescentes chimériques nécessite plusieurs cycles de croisement génétique et le dépistage, qui peut prendre des mois ans selon le nombre de gènes d’être exprimée conjointement.
L’emploi de qu'un vecteur d’expression unique pour la co-expression de multiples protéines végétales a été signalé par plusieurs précédentes études19,20,21. Toutefois, plusieurs cycles de digestion enzymatique et ligature d’ADN des molécules d’ADN et des vecteurs de la colonne vertébrale sont habituellement exigées pour la génération du plasmide final pour la co-expression de protéine ou une surexpression. Ici, nous avons développé une méthode nouvelle et robuste permettant d’exprimer conjointement plusieurs protéines fluorescentes chimériques dans les plantes. C’est une méthode très efficace et pratique qui permet d’obtenir plusieurs co-expression de protéines dans les végétaux destinés tant l’expression transitoire et transformation stable de manière séculaire. Il emploie un vecteur unique qui contient plusieurs cassettes d’expression de protéines fonctionnellement indépendants pour la co-expression de protéine et ainsi permet de surmonter les inconvénients des méthodes conventionnelles. En outre, c’est un système très polyvalent dans laquelle l’ADN les manipulations et l’Assemblée sont atteints par une réaction en une étape simple optimisée sans étapes additionnelles de digestion de l’ADN et la ligature. Le principe de fonctionnement est illustré à la Figure 2. En outre, il est entièrement compatible avec les approches cellulaires, moléculaires et biochimiques actuelles qui reposent sur des protéines de fusion fluorescent chimérique.
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Protocol
1. stratégie de conception amorce et Amplification de l’ADN
- Concevoir les amorces pour le clonage de fragments d’ADN. Les amorces comprennent 20 séquences de liaison spécifique de gène de bp et de 20 à 25 bp 5'-porte-à-faux séquences terminales, qui sont la séquence complémentaire qui se chevauchent des molécules d’ADN adjacentes (voir le tableau 1 par exemple).
NOTE : L’assemblage subséquent de chaque ADN fragments, assemblage des cassettes d’expression de protéines différentes, et l’intégration avec le vecteur de l’expression finale tous dépendent de la reconnaissance des séquences adjacentes qui se chevauchent. - Amplifier les fragments d’ADN, y compris le promoteur, reporter fluorescent, gène cible et terminator, qui sont nécessaires pour la construction des cassettes d’expression de protéine semi-indépendant par des réactions de PCR standards avec leurs correspondants des amorces et haute polymérase de fidélité.
Remarque : Les modèles utilisés dans cette étude pour l’amplification de l’ADN sont dérivés de précédentes études15,22,23. La température de recuit et de prorogation de délai des réactions PCR sont ABC et gènes dépendants.
2. DNA Fragment assemblage et Construction des Cassettes d’Expression de protéine
- Analyser la qualité des première ronde des produits PCR par électrophorèse d’ADN et quantifier par le spectrophotomètre. Vérifier si la dégradation de l’ADN et de la contamination ont été de 1 % gel d’agarose. Le OD260/OD280 des produits PCR doit être entre 1.6 et 1.8.
- Mélanger les différents fragments d’ADN (0,05 - 0,1 pmol pour chaque fragment) dans un nouveau tube PCR pour un volume final de 5 µL.
Remarque : Des molécules d’ADN de mélange conçu pour la même cassette d’expression de protéine ensemble dans un tube PCR. Éviter le mélange des ADN de cassette d’expression différents ensemble, car il permettra de réduire l’efficacité de l’Assemblée d’ADN en raison du nombre croissant de molécules d’ADN qui doivent être liés.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Préparer 5 x ISO stock tampon : 500 mM Tris-HCl, pH 7.5 ; 50 mM MgCl2; 1 mM désoxyribonucléosides (dNTP) ; 50 mM dithiothréitol ; 25 % de polyéthylène glycol (PEG) 8000 ; et 5 mM nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).
- Faire 1 mL 2 x mélange maître de 400 µL 5 x les stock tampon ISO, 7,5 unités de T5 exonucléase, 62,5 unités de haute fidélité ADN polymérase, 5 000 unités de la Taq polymérase (voir Table des matières), et double stérile distillée H2O.
NOTE : Ceci est une adaptation d’études précédentes24,25,26; ces volumes doivent être optimisées. - Aliquotes de 100 µL de 2 x mélange maître par tube et conserver à-20 ° C.
ATTENTION : Fréquents de gel et de dégel du 2 mélange maître x peuvent entraîner une faible efficacité de l’Assemblée de l’ADN. - Ajouter 15 µL du mélange maître de 2 x dans le mélange de l’ADN 5 µL et incuber à 50 ° C pendant 60 min.
3. construction du vecteur pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes Fusion chez les plantes
- Amplifier la cassette d’expression de protéine semi-indépendant entière par une PCR de second tour avec le produit (0,5 - 1,0 µL) de la réaction de l’Assemblée isotherme de premier tour comme le modèle et les amorces ultrapériphériques (p. ex., 1-FP35S et 1-RNOS pour l’expression cassette 1).
- Utilisation 1 unité de haute fidélité polymérase dans un volume réactionnel de 50 µL suivie de 30 cycles (94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 2 min), suivie d’une extension finale à 68 ° C pendant 5 min.
- Linéariser la protéine finale expression épine dorsale vecteurs pUC18 et pCAMBIA1300, qui sont conçus pour l’expression transitoire de la protéine et de transformation génétique, respectivement, en ajoutant 4 unités Sma I dans un volume final de réaction 10 µL et incubation pour 1 - 2 h à 25 ° C. Inactiver les enzymes de restriction en incubation à 65 ° C pendant 20 min.
- Mélange équimolaires molécules d’ADN des cassettes d’expression de protéine et vecteur final linéarisé dans un volume de réaction finale de 5 µL. Ensuite, effectuer la recombinaison de l’ADN secondaires en mélangeant avec 15 µL 2 x tampon maître et incubation à 50 ° C pendant 60 min.
- Utiliser les produits finaux de la réaction de recombinaison isotherme de deuxième ronde pour transformer compétentes d' e. coli cellules (par exemple, DH5α) selon les procédures standard27. Vérifiez les colonies positives par séquençage de l’ADN et la PCR colonie. Extrait les plasmides positives de l' e. coli à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide mini et conserver à-80 ° C.
ATTENTION : Pour le stockage à long terme, plasmides dissoute dans un tampon TE ou double distillée H2O sont plus stables que les garde dans des souches d’e. coli .
4. biolistique-bombardement médiée par co-expression transitoire de plusieurs protéines chimériques fluorescentes Fusion chez les plantes
- Préparer du tabac BY-2 cellules en suspension et les jeunes plantes Arabidopsis bombardement.
- Culture BY-2 cellules dans un milieu de Murashige et Skoog (MS) par repiquage deux fois par semaine à 25 ° C dans un agitateur fixé à 130 tr/min. D collecter 30 mL 3 filtre cultivées BY-2 cellules sur un morceau de papier filtre stérilisés à l’autoclave de 70 mm via une pompe à vide en affectant à la pression de vide 40 mbar.
- Afin d’éviter que les cellules ne se dessèchent pas aux étapes suivantes, ajouter quelques gouttes de milieu de culture liquide de BY-2 cellules dans une boîte de Pétri avant de placer le papier filtre (étape suivante).
- Transférer le papier-filtre avec les cellules de BY-2 à ce sujet à une nouvelle boîte de Pétri (85 x 15 mm).
- Surface de stériliser les graines d' Arabidopsis thaliana (Col-0) au vortex un mélange avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % Tween 20 pendant 10 min.
- Tournez en bas les graines à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 2 s, éliminer le surnageant et lavez les graines avec l’éthanol à 100 % une fois pendant 30 s. Pipette les graines sur un nouveau papier filtre stérile sous une hotte stérile. Ensuite, sécher les graines et les répartir sur plaques de gélose MS ½.
- Stocker les plaques à 4 ° C pendant 48 heures avant de les transférer dans une chambre de culture de plantes avec les paramètres suivants : 16 h de lumière 8 h d’obscurité avec 120 à 150 µm m-2 s-1 intensité, 22 ° C.
- Transférer 7 - jour vieilles centrales de l’échantillon dans un cercle de diamètre de 30 mm dans le centre d’une nouvelle plaque moyenne ½ MS pour accroître l’efficacité des bombardements.
ATTENTION : Éviter le chevauchement des plantes en transférant et en les plaçant sur la nouvelle plaque de ½ MS. - Ajouter quelques gouttes de ½ MS milieu liquide sur la surface des végétaux ou des tissus afin de préserver l’humidité et éviter de dessécher les plantes dehors aux étapes suivantes.
- Enrober les particules d’or avec l’ADN de plasmide.
- Solution avec des microporteurs or Vortex soigneusement, pendant 3 min. préparer un nouveau tube de 1,5 mL.
- Ajouter successivement les solutions suivantes dans le tube et le vortex : 25 µL (1,5 mg) or particules, vortex 10 s ; 10 µL de 25,46 mg/L la spermidine, vortex 10 s ; 5 µL d’ADN plasmidique 1µg/µL, vortex 3 min ; 25 µL de CaCl2 solution 277,5 mg/L, vortex 1 min.
ATTENTION : Gardez l’agitation au cours de cette étape. - Tournez en bas des microporteurs or en utilisant une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 5 s et soigneusement la pipette sur le surnageant sans déranger le culot. Laver avec 200 µL d’éthanol absolu et Resuspendre le culot de vortex pour 5-10 s. vitesse de rotation vers le bas à la vitesse max pendant 5 s et supprimer l’éthanol.
- Remettre en suspension les particules d’or dans 18 µL d’éthanol absolu et suspension 6 aliquotes de particules µL au milieu de trois macrocarriers. Laissez-les sécher à l’air.
- Transférer ADN dans les plantes par bombardement par des particules.
- Définir le système de largage de particules comme suit : 1 100 lb/po2, 28 mm Hg de pression, distance d’écart de 1 cm et la distance de vol particule de 9 cm.
- Bombarder les cellules/plantes sur la gélose au moyen de trois fois à trois positions différentes et ensuite maintenir les cellules/plantes dans ignorance immédiatement après le bombardement.
ATTENTION : Porter des lunettes de protection lorsque vous utilisez le système de largage de particules en raison de l’association des gaz à haute pression et de particules à grande vitesse avec le système.
- Gardez bombardés cellules/plantes dans l’obscurité dans la chambre de croissance végétale pour 6 à 72 heures avant l’observation des signaux fluorescents. La valeur de la chambre de croissance des végétaux à 24 h d’obscurité et de 22 ° C.
ATTENTION : L’efficacité de l’expression et l’intensité du signal fluorescent sont promoteur - gène- et alimenté par la plante/tissu.
5. génération de Stable Arabidopsis transgénique exprimant conjointement plusieurs protéines fluorescentes chimériques par Agrobacterium-Mediated Transformation.
- Décongeler les cellules compétentes Agrobacterium (PMP90) sur la glace et attendre 30 min, puis ajouter 2 vecteur binaire µL (100-200 ng) (préparé ci-dessus) dans les cellules compétentes. Reposer le mélange sur la glace pendant 10 min.
- Transférer le mélange dans une cupule d’électroporation préalablement réfrigérées 0,1 cm. Insérez la cuve dans le système de l’électroporation et effectuer électroporation avec les paramètres suivants : 1.6 kV, 600 ohms, 25 µF.
- Ajouter 1 mL de milieu liquide SOC dans la cupule immédiatement après l’électroporation, Pipetter les cellules dans un nouveau tube de 1,5 mL et incuber à 28 ° C dans un agitateur orbital horizontal à 200 tr/min à 120 min.
- Centrifuger les cellules à 2 348 x g à température ambiante pendant 5 min, jeter la majorité du liquide surnageant, doucement remettre en suspension les cellules granulés avec un embout de la pipette, étalez-les sur un plat de livre contenant 50 mg/L hygromycine B et incuber à 28 ° C pendant 2-3 jours.
- Transformer les plantes Col-0 Arabidopsis thaliana avec l' Agrobacterium, qui contient le vecteur binaire pCAMBIA1300 intégré avec plusieurs cassettes d’expression de protéine, par la méthode de28 floral trempette comme décrit précédemment pour générer des plantes transgéniques stables.
- Stériliser la surface des graines transgéniques Arabidopsis en les mélangeant avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % Tween 20. Vortexer pendant 10 min. Spin down les graines à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse supérieure à vitesse max pour 2 s, éliminer le surnageant et lavez les graines avec l’éthanol à 100 % une fois pour 30 s.
- Distribuer les graines sur un papier filtre stérile sous une hotte stérile. Par la suite, sécher à l’air et les répartir sur des plaques de gélose ½ MS contenant l’hygromycine B pour le dépistage positifs descendances.
- Incuber les boîtes à 4 ° C pendant 2 jours. Ensuite, transférer dans la chambre de croissance des plantes et de la culture pendant 7 jours.
- Sélectionnez 7 - jour vieilles centrales de juvéniles de survie en recherchant des signaux fluorescents sous le microscope à fluorescence, puis transférer les plantes dans le sol pour plus de dépistage des plantes homozygotes.
6. pharmaceutiques traitements
- Pour les traitements pharmaceutiques, diluer chaque médicament dans un milieu liquide MS à ses concentrations appropriées de travail avant l’incubation avec des piles ou des plantes.
- Wortmannin traitement : préparer les solutions de wortmannin 1 mM en dissolvant la poudre de wortmannin dans le DMSO et stocker les stocks à-20 ° C. Transfert de cellules végétales ou plantes juvéniles dans le milieu liquide de MS contenant 16,5 wortmammin µM et incuber pendant 30-45 min avant l’imagerie.
- Traitement de la bréfeldine A (BFA) : préparer les solutions de BFA 1 mM en dissolvant la poudre BFA dans le DMSO et stocker les stocks à-20 ° C. Transfert de cellules végétales ou plantes juvéniles dans le milieu liquide de MS contenant 10 µg/mL BFA pendant 30-45 min avant l’imagerie.
7. confocal Microscope Imaging et protéine subcellulaire co-localisation analyse
- Transférer les juvéniles ou les cellules en suspension sur une lame de verre classique et mettre doucement une diapositive de couverture sur le dessus pour imagerie par standard laser confocal, microscopie à balayage. Utilisez les paramètres suivants : 63 X eau objectif (N.A 1.4), 0 fond, gain 700, taille de pixel de 0,168 mm et détecteur de tube photomultiplicateur. Exciter les protéines GFP-étiquetée à 485 nm et détecter la fluorescence à 525 nm. Pour les protéines marquées DP, exciter au 514 nm et détecter à 575 nm.
- Calculer le ratio de co-localisation des signaux fluorescents à l’aide du logiciel Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) avec la Pearson-Spearman corrélation (CFP) co-localisation plug-in comme décrit précédemment8. Les coefficients de corrélation de Pearson ou coefficients de corrélation de Spearman rang apparaissent dans les résultats (Figure 4). Les valeurs r produite sera de -1 à 1. 0 ne montre aucun détectable de la corrélation de deux signaux, alors que les + 1 et -1 montrent une corrélation complète positive et négative, respectivement, de deux signaux.
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Representative Results
Nous avons développé une méthode robuste et très efficace pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. Il brise les barrières de la conventionnelle approches utilisent plusieurs plasmides séparés pour la co-expression de protéine, comme le montre la Figure 1 a, B, via l’expression transitoire ou transformation génétique stable. Dans cette nouvelle méthode, nous allons générer un vecteur d’expression unique qui se compose de plusieurs cassettes d’expression de protéines pour atteindre la protéine co-expression simultanément (Figure 1D). Les fonctions de cassette d’expression protéique, semi independently avec ses propres éléments d’ADN nécessaires à l’expression de la protéine. Par conséquent, chaque cassette d’expression de protéine peut être personnalisé indépendamment selon diverses exigences imposées pour l’expression de la protéine. Pour ce qui est le vecteur de la co-expression de protéine final, les cassettes d’expression de protéine en elle fonctionnent comme éléments de base « Lego » qui peuvent être modifiées, re-construit. et re-idéalement placé. Par ailleurs, une autre stratégie pour assemblage de molécule ADN, assemblage de plusieurs cassettes d’expression de protéine et l’intégration des fragments d’ADN avec le vecteur de la destination finale pour la co-expression de protéines chimériques fluorescentes fusion est obtenue simplement via une optimisé isotherme en vitro réaction de recombinaison sans mesures supplémentaires de digestion de l’ADN et l’interpénétration des. Le principe de fonctionnement de la réaction de recombinaison isotherme in vitro est illustré à la Figure 2. L’assemblage de plusieurs molécules d’ADN (par exemple, les trois représentant DNA fragments 1-3 montre la Figure 2) et leur intégration dans le vecteur d’expression finale sont simplement et efficacement atteints par la réaction en une seule étape (voir Figure 2 de ). Des études précédentes, il est adapté par chevauchement de recombinaison des molécules d’ADN médiée avec des séquences courtes qui se chevauchent pour réaliser la fusion de fragments d’ADN et de la construction des plasmides25,26.
Un test de la méthode, nous avons choisi le récepteur tri vacuolaire (VSR) et la protéine de membrane du porteur (SCAMP), qui sont deux protéines de journaliste participant en protéines sécrétoires et voies d’endocytose, respectivement6,22 ,23,29,30. ECP est type-j’ai des protéines intégrales de membrane qui médient trafic de biosynthèse de protéine dans la voie de sécrétion de la vacuole et surtout se localise dans les compartiments prévacuolaire (PVC) en plantes6,22,23. En revanche, protéines de la membrane du porteur (coquins) sont des protéines de membrane de type-IV qui participent à la voie endocytose de la plante. Elle se localise à la membrane plasmique (PM) et trans-réseaux de Golgi (TGNs), qui servent de début endosomes22,29,30. Nous avons construit deux cassettes d’expression de la protéine qui hébergent les fusions chimériques d’Arabidopsis VSR2 (AtVSR2) avec DP et Arabidopsis SCAMP4 (AtSCAMP4) avec GFP, comme illustré à la Figure 3. Afin d’assurer la que DP-AtVSR2 peut être traduit dans la salle d’urgence, un peptide signal (SP) est ajouté avant DP, comme précédemment rapporté6,31. Les deux cassettes d’expression de protéines individuelles sont plus liés entre eux et ligaturer avec la protéine finale expression vecteur pUC18 ou pCAMBIA1300 pour la co-expression de protéine ou protéine via transitoire ou végétaux transformation stable, comme le montre La figure 3. AtVSR2 et AtSCAMP4 ont avec succès conjointement exprimé sous forme de tabac BY-2 cellules par bombardement par des particules et des localisations correctes (Figure 4 a). DP-AtVSR2 a montré un modèle ponctué, qui se distinguait de la localisation de la membrane plasmique des AtSCAMP4-GFP avec quelques points ponctuées cytosoliques. En outre, Arabidopsis , plantes transgéniques qui expriment conjointement AtSCAMP4-GFP et DP-AtVSR2 ont été générées par Agrobacterium-mediated transformation. Les localisations subcellulaires d’exprimer conjointement DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP dans des cellules de racine et les poils absorbants ont été montrées dans la Figure 4 b et 4E. Les résultats de la co-expression de DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP provenant de transgéniques Arabidopsis concordaient avec celles des cellules de BY-2. En outre, les transgéniques Arabidopsis étaient traités avec wortmannin BFA pendant 30 min. Wortmmanin causé DP-AtVSR2 étiqueté PVC formant une petite structure annulaires et BFA induit AtSCAMP-GFP étiqueté agrégation TGN, comme illustré à la Figure 4 de , D, F, G. En outre, peu auto-fluorescente signal peut être détectée en tabac BY-2 cellules et Arabidopsis racine et poils absorbants en appliquant les mêmes paramètres de la collection d’images quant à la Figure 4 (la Figure 1).
Figure 1 : un système robuste pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. (A) les approches conventionnelles de co-expression transitoire de plusieurs protéines fluorescentes journaliste chez les plantes obtenus par électroporation, bombardement par des particules et la transformation par PEG en mélangeant plusieurs expression indépendante vecteurs. (B) la méthode conventionnelle pour la transformation génétique des plantes par Agrobacterium avec un vecteur d’expression de protéine unique fusion fluorescent. Pour co exprimer plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion dans une plante transgénique, autres croisement génétique et plusieurs séries de dépistage sont nécessaires pour obtenir des descendances homozygotes. (C) et (D) la nouvelle méthode alternative de la co-expression de protéine. Il profite d’un vecteur d’expression unique, qui se compose de plusieurs cassettes d’expression de protéine et est en mesure d’exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes journaliste en plantes via les deux transitoire expression et transformation génétique. Détails de cette figure ont paru en Zhong et al. 201736 (réimprimé avec permission ; copyright Frontiers in Plant Science). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : démonstration du principe de la méthode de montage en une seule étape l’ADN par la réaction de recombinaison isotherme travail. Les fragments d’ADN et le plasmide linéarisé avec chevauchement des séquences (OSs) sont fixent en base couplage entre la 5'-porte-à-faux chevauchant les régions, s’étendant par l’ADN polymérase et la liaison de la ligase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : la stratégie de la construction d’un plasmide pour exprimer conjointement plusieurs protéines chimériques fluorescentes fusion. Le diagramme illustre la stratégie pour la construction d’un plasmide d’expression unique pour la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion d’expression transitoire ou transformation stable chez les plantes. Le vecteur d’expression se compose de deux cassettes d’expression de protéine, dont chacun contient ses propres éléments nécessaires à l’expression de la protéine et des fonctions dans l’expression de sa protéine de fusion fluorescent chimérique individuels semi independently. Assemblée et l’interdépendance de toutes les molécules d’ADN sont idéalement réalisées par une méthode recombinaison optimisé isotherme en vitro médiée par les fragments d’ADN qui se chevauchent. Détails de cette figure ont paru en Zhong et al. 201736 (réimprimé avec permission ; copyright Frontiers in Plant Science). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images représentatives de la co-expression de chimérique fluorescente fusion de VSR et coquine dans les cellules végétales.
(A) la co-expression de DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP par bombardement par des particules en suspension cellulaire de tabac BY-2. (B) une image représentative d’une cellule de racine Arabidopsis transgénique exprimant conjointement DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP. (C) et (D) transgéniques Arabidopsis racines exprimant conjointement DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP ont été traités avec wortmannin et BFA pendant 30 min respectivement. (E) une image représentative d’un poil Arabidopsis transgénique exprimant conjointement DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP. Poils absorbants (F) et (G) transgéniques Arabidopsis co exprimant DP-AtVSR2 et AtSCAMP4-GFP ont été traités avec wortmannin et BFA pendant 30 min. flèches (D) et (G) indiquent les protéine induite par le BFA agrégation. rp = coefficient de corrélation de Pearson ; rs = corrélation de rang de Spearman. Barre d’échelle (A)-(D) est de 50 µm, (E)-(G) est de 30 µm. les détails de cette figure ont été d’abord publiés en Zhong et al. 201736 (réimprimé avec permission ; copyright Frontiers in Plant Science). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Cassette d’expression 1 | ||
| 1-FP35S | GAATTCGAGCTCGGTACCC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 1-RP35S | AGGACGCGGGCGTGGGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 1-FRFP | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCCCACGCCCGCGTCCT | |
| 1-RRFP | ATTATCCATATCACTCCCCA GGCGCCGGTGGAGTGGCGGC | |
| 1-FAtVSR2 | GCCGCCACTCCACCGGCGCC TGGGGAGTGATATGGATAAT | |
| 1-RAtVSR2 | AAATGTTTGAACGATCGGGA TTACAACTCTAGTTGAGAAG | |
| 1-FNOS | CTTCTCAACTAGAGTTGTAA TCCCGATCGTTCAAACATTT | |
| 1-RNOS | GAGAATGGATGCGAGTAATG TCTAGTAACATAGATGACAC | |
| Cassette d’expression 2 | ||
| 2-FP35S | CATTACTCGCATCCATTCTC ACATGGTGGAGCACGACACA | |
| 2-RP35S | TTAGGATCGTGTCGTGCCAT TATCACATCAATCCACTTGC | |
| 2-FAtSCAMP4 | GCAAGTGGATTGATGTGATA ATGGCACGACACGATCCTAA | |
| 2-RAtSCAMP4 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT TAGTGCACGCATCAAGGTCG | |
| 2-JEREMFINCK | CGACCTTGATGCGTGCACTA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | |
| 2-RGFP | TAAAACCAAAATCCAGTGAC TTACTTGTACAGCTCGTCCA | |
| 2-FT35S | TGGACGAGCTGTACAAGTAA GTCACTGGATTTTGGTTTTA | |
| 2-RT35S | GTCGACTCTAGAGGATCCCC GTCCGCAAAAATCACCAGTC | |
Tableau 1 : stratégie de conception d’amorce et de séquences utilisées dans cette étude. Nom de chaque amorce est donné sur le panneau de gauche. Les séquences complémentaires qui se chevauchent des amorces sont soulignés. Détails de cette table ont été tout d’abord publiés en Zhong et al. 201736 (réimprimé avec permission ; copyright Frontiers in Plant Science).
Supplémentaire Figure 1 : images représentatives d’autofluorescence dans BY-2 cellules, les racines de l’Arabidopsis et les poils absorbants. (A) l’autofluorescence des cellules de type sauvage BY-2 a été détectée dans les mêmes conditions d’imagerie avec les cellules transformées. (B) et (C) Arabidopsis poils absorbants et les cellules de la racine ont été détectés dans les mêmes conditions d’imagerie avec les cellules transformées d’Arabidopsis. Barre d’échelle (A)-(C) est de 20 µm. DIC, contraste interférentiel différentiel. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ici, nous avons démontré une méthode inédite pour robustement co expriment des protéines chimériques fluorescentes fusion chez les plantes. Il peut être utilisé pour l’expression transitoire et transformation génétique et est compatible avec l’actuel fluorescent basées sur les protéines bio-imagerie, moléculaires et biochimiques des applications et technologies9,10,13 . En outre, elle surmonte les difficultés des méthodes classiques qui utilisent plusieurs plasmides d’expression individuelle pour la co-expression de protéine. En revanche, il utilise un vecteur d’expression unique qui contient plusieurs cassettes d’expression de protéine avec leurs propres promoteurs individuels, étiquettes fluorescentes, protéines cibles et terminateurs. Par ailleurs, la cassette d’expression de protéine peut être gérée indépendamment pour répondre aux exigences de l’expression diversifiée, telles que l’utilisation d’un promoteur spécifique et la fusion chimérique de N - ou C-terminale d’une protéine fluorescente avec la protéine cible. Par conséquent, les fonctions de cassette d’expression de protéine comme un élément fondamental de « Lego » qui fonctionne semi-autonome dans le plasmide. En outre, c’est aussi un système très polyvalent qui gène modification, remplacement, et toute l’Assemblée peut être facilement réalisée par une réaction de recombinaison isotherme en une seule étape sans processus supplémentaires de digestion enzymatique et ligature. Nous avons optimisé l’efficacité de la réaction de recombinaison isotherme d’études antérieures, tel que décrit à l’étape 2.4, en testant différentes concentrations de T5 exonucléase et Phusion ADN polymérase Taq polymérase. En outre, la concentration de chaque ADN des fragments pour la réaction de recombinaison isotherme en une seule étape est suggérée pour être comprise entre 0,05 et 0,1 pmol pour obtenir une efficacité maximale de la ligature.
La surexpression d’un transgène en remplaçant son promoteur endogène avec une forte et promoteur continue, comme promoteur d’ubiquitine-10 (UBQ10) et en introduisant des exemplaires supplémentaires du gène est une approche sauvagement utilisée pour étudier les fonctions cellulaires et mécanisme de travail sous-jacent en cellules15,32. Cependant, inattendu vers le bas-règlement et forte d’inhibition de l’expression du gène parfois découvrit ainsi33,34. Le pourcentage de silençage varie de 2 à 100 % au titre de ces situations33,35de gènes imprévisibles. En outre, silençage génique a plus de chance de se produire dans l’expression de plusieurs gènes simultanément, transformation de hautes copies d’ADN et des augmentations significatives du gène niveau transcriptionnel9,33,24 ,,35. Afin de minimiser la présence du gène silencieux dans la robuste plusieurs système de co-expression de protéine de fusion, nous avons choisi différents promoteurs actifs pour conduire les cassettes d’expression de protéines différentes, lorsqu’elles expriment conjointement plusieurs protéines de fusion. En outre, nous avons évité continuellement à l’aide du même promoteur pour cassettes d’expression différents. En outre, une autre limitation potentielle de ce protocole est l’efficacité réduite du one-step isotherme recombinaison causée par l’augmentation du nombre de cassette d’expression de protéine pour la co-expression. En outre, le nombre des cassettes d’expression qui peuvent être hébergés dans le plasmide de l’expression finale principalement s’appuie sur le réplicon du plasmide épine dorsale24,25,35.
Ensemble, nous avons développé un système puissant pour exprimer les multiples protéines chimériques fluorescentes fusion idéalement en plantes36. Il surmonte les limites des méthodes classiques et utilise une réaction d’Assemblée ADN optimisée en une seule étape pour la construction d’interpénétration et plasmide ADN de façon séculaire. Cette avancée technique a été validée par AtVSR2 et AtSCAMP4 la co-expression dans usine cellules via expression transitoire et transformation génétique. Par conséquent, il démontre une méthode nouvelle et convaincante pour différents aspects des découvertes scientifiques par co-expression chimériques fluorescentes des protéines de fusion chez les plantes. En outre, le concept et le principe de la co-expression de multiples protéines chimériques fluorescentes fusion via un vecteur d’expression unique sont entièrement compatibles avec les technologies de surexpression CRISPR-Cas9, RNAi et protéines pour étudier les fonctions et interactions des gènes multiples plantes37,38,,39.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Wang des discussions utiles et commentaires. Ce travail est soutenu par la Fondation National sciences naturelles de Chine (NSFC, grant no 31570001) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong et la ville de Guangzhou (Don 201707010024 et no 2016A030313401) à H.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD-FX Polymerase | TOYOBO | KFX-101 | |
| Sma I | NEB | R0141L/S/V | |
| Tris-HCl | BBI | A600194-0500 | |
| MgCl2 | BBI | A601336-0500 | |
| dNTP | NEB | #N0447V | |
| DTT | BBI | C4H10O2S2 | |
| PEG 8000 | BBI | A100159-0500 | |
| NAD | BBI | A600641-0001 | |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | NEB | M0530S | |
| Taq DNA polymerase | NEB | B9022S | |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS) | Sigma | M5524 | |
| Ethanol | BBI | A500737-0500 | |
| Tween 20 | BBI | A600560-0500 | |
| Agar | BBI | A505255-0250 | |
| Spermidine | BBI | A614270-0001 | |
| Gold microcarrier particles | Bio-Rad | 165-2263 | 1.0 µm |
| CaCl2 | BBI | CD0050-500 | |
| Macrocarriers | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Rupture disk | Bio-Rad | 165-2329 | |
| Stopping screen | Bio-Rad | 165-2336 | |
| Tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Yeast Extract | OXOID | LP0021 | |
| NaCl | BBI | A610476-0001 | |
| KCl | BBI | A610440-0500 | |
| Glucose | BBI | A600219-0001 | |
| Hygromycin B | Genview | AH169-1G | |
| Wortmannin | Sigma | F9128 | |
| Brefeldin A | Sigma | SML0975-5MG | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | BBI | A600163-0500 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Growth chamber | Panasonic | MLR-352H-PC | |
| PSD-1000/He particle delivery system | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Gene Pulser | Bio-Rad | 1652660 | |
| Cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5427000097 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 7 DUO (780&7Live) | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| EPS-300 Power Supply | Tanon | EPS 300 | |
| Fluorescent microscope | Mshot | MF30 | |
| Agrose | BBI | A600234 | |
| Ampicillin | BBI | A100339 | |
| Ethylene Diamine Tetraacetie Acid | BBI | B300599 |
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