クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

Summary

高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット スクリーニング法の妥当性を提案します。

Abstract

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持。トリートメントや露出の世話をする治療薬を開発する努力をこれらの傷害の分子・細胞メカニズムを理解する重要なことです。提案する高スループット小さな抑制 RNA (siRNA) スクリーニングの利用がより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を明らかにすることができる重要なツールをすることができます。siRNA は、二本鎖 RNA 分子長 19-25 のヌクレオチドと転写後サイレンシング mRNA を低下させる経路を利用、siRNA に相同性があります。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。開発と検証暴露モデルの in vitroのハイスループットス クリーニング (HTS) フッ化水素 (HF) とクロルピクリン (CP) による眼損傷のための方法は、この記事で掲載されています。我々 はこれらの 2 つの有効成分を選択、私たちの方法は、毒性物質の曝露プロトコルに変更を加える他の有効成分の研究に適用されます。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞生存率及び il-8 産生は、スクリーニングのプロトコルのエンドポイントとして選択されました。毒性物質の暴露の開発に関連付けられているいくつかの課題、高温超伝導の研究に適した培養技術が表示されます。これらの毒性の高温超伝導モデルの確立化学眼傷害のための潜在的な治療のメカニズムやけがの画面を理解するそれ以上の調査が可能です。

Introduction

化学物質を急速に重要な組織の損傷を与える可能性があるために、毒性物質による眼障害は真眼緊急です。残念ながら、毒性物質による角膜損傷の治療法は、これらの傷害を治療するために特定の治療法が存在しないため、一般に支持のみです。現在の治療戦略は非特定、潤滑剤、抗生物質などの局所治療が主に含まれています、cycloplegics 続いて抗炎症薬 (例えばステロイド) 一度角膜^{1 を epithelialized、再 ,2}。最高現在治療オプションは、にもかかわらず長期予後不良進歩的な角膜混濁と血管新生の^2,の³のためであります。

動物モデルは、化学的毒性を調査し、傷害のメカニズムを理解する伝統的に使用されています。ただし、動物実験は時間がかかり、高価です。動物テストを削減する取り組みもあります。たとえば、欧州連合 REACH 規制 (EC 1907/2006 年) 動物実験を減らすため規定しています。規定には、動物テストおよび動物に提案するテストを実行する前に欧州化学物質庁から承認を得ることを避けるために、企業がデータを共有する要件が含まれます。リーチの規定の下で動物実験は最後の手段にする必要があります。また、動物で化粧品のテスト廃止欧州の化粧品規制 (EC 1223/2009) があります。3 r の原則に導かれるとき、動物実験が行われる (絞り込み、削減、および交換)、非動物の代わりを使用して、慈悲深い動物の研究を行って、使用する動物の数を減らすためのフレームワークを提供します。可能な限り。これらの理由から、毒物学の分野は、毒性の分子メカニズムに洞察力を提供することができますしより高いスループット⁴で行うことができますの in vitroアッセイを採用を求めています。これは機能的な毒物学アプローチの化学だけではなく機能別に毒性が定義されています。さらに、機能的な一歩を踏み出したトキシコゲノミクスを求める特定の遺伝子毒性⁵の効果を果たす役割を理解します。SiRNA 技術の応用、毒性物質を分子・細胞応答の遺伝子の機能を調べる画面を高スループットで行うことができます。siRNA は、長いポスト転写遺伝子サイレンシング経路すべて哺乳類セル⁶に存在する活用 19-25 のヌクレオチドは、二本鎖 RNA の分子です。これらは総合的作られて、特定の遺伝子をターゲットに設計されています。SiRNA は処理セルに導入されたとき、ガイド鎖一本鎖 RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) が読み込まれます。SiRNA は、mRNA 分子の相補的な領域に RISC を指示し、RISC の mRNA の低下します。これは特定の遺伝子の発現の減少の結果します。特定の遺伝子の表現の結果の減少は、細胞に対して、毒性物質、遺伝子の機能を確認するために毒性物質の露出した細胞で研究できます。このようなアプローチは、リシン感受性のメカニズムと CYP1A1^7,8の AHR 依存型誘導をさらに理解するために使用されています。

化学テロのリスク評価 (CTRA) リストおよび有毒工業化学物質 (TIC) のリストは、その毒性やテロ、戦争、または産業事故イベント⁹にリリースされる可能性に基づいて選択化学物質を明細が。SiRNA のハイスループットス クリーニング (HTS) トキシコゲノミクスでハイリスクのテロ事件で使用する識別されている CTRA リスト毒性の研究アプローチを適用しています。伝統的な毒性化学物質が生物に悪影響を理解しようとしています。しかし、我々 は通知におそらく、治療薬や治療法の開発を目的として傷害のメカニズムを理解しさらに願望を持っている分子治療の開発の対象にすることができますを発見します。いくつかの方法でこの努力は、siRNA スクリーニングおよび薬剤の発見プロセス¹⁰に基づくセルの試金の使用に類似した考慮されるかもしれない。主な違いは、我々 のアプローチでそれはやや毒性物質曝露の治療のため治療価値の高い特異なターゲットがあるだろうと考えにくいに対し、その創は通常治療探索対象が単数形を求めているでしょう。我々 は、毒性物質の露出のための効果的な治療法のパラダイムが高い治療価値を達成するために多面的なアプローチを必要とし、トキシコゲノミクス解析を用いたデータは極めて効果的な治療パラダイムを通知ことがあることを予測します。

ベンチトップ オートメーションは、医薬品やバイオ テクノロジー産業の外の所に高スループット方法論をもたらします。当研究所での in vitroの研究は歴史的に低スループット^11,12,13である伝統的なアッセイをされています。過去数年間で私たちの研究室は、siRNA スクリーニングを実行する卓上型ロボットの使用に移行しています。ここで、眼細胞モデルの精緻化と体外の開発露出の手法を提示水素フッ化物 (HF) とクロルピクリン (CP) siRNA スクリーニングに適した。私たちの目標は、これらの毒性に対して細胞傷害を調節する分子を識別することです。我々 が選択した siRNA ライブラリのターゲットには、G タンパク質共役型受容体、蛋白質キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、イオン チャネル、および他の潜在的 druggable ターゲットが含まれます。HF および CP は蒸気暴露^9,14を介して眼傷害の最大のリスクを提示する研究の産業事故の ToxNet レポート CTRA リスト エージェントを相互参照によって選ばれました。CP (化学式 Cl₃CNO₂、CAS 番号 76-06-2) もともと、第一次世界大戦¹⁵で催涙ガスとして使用されました。それは現在として殺虫剤、殺菌剤、殺¹⁶農業燻蒸と関数として使用されます。フッ化水素 (HF) は、石油精製所、¹⁷有機化合物の電気化学的フッ素化アルキル化を含むプロセスで使用されます。HF (化学式 HF、CAS 番号 62778-11-4) ガスであるが、形式で水溶液はフッ化水素酸 (HFA、CAS 番号 7664-39-3)。したがって、我々 は我々 の細胞で HFA を使用する選出露出モデル。SV40 large T 抗原 SV40 HCEC は研究に選ばれたひと角膜上皮細胞ラインを不死化。細胞死および炎症性応答の細胞傷害に関与している目標を反映する必要がありますので、細胞生存率及び炎症性マーカー IL 8 はエンドポイントとして選択されました。具体的には、ターゲットは、毒性物質の露出の保護の役割を果たすことが、細胞死および炎症性サイトカイン産生増やす必要があります対象式は、siRNA によって阻害されるとき。否定的な役割を果たす目標の真反対のでしょう。また、露出、および細胞死経路への介入が向上臨床^2,18後角膜病理学の役割を果たすに慢性的な炎症が表示されます。

Protocol

1. セルの文化の維持 成長セル行 SV40 HCEC 37 ° C、5% CO215% ウシ胎児血清 (FBS)、DMEM F 12 の 90% 湿度 1 %l-グルタミン、10 μ g/L 上皮成長因子 (EGF)、5 mg/L インスリン。 密度が決して文化保守中に 80% を超えていることを確認する細胞株 (播種) によってすべての 3 〜 4 日の通路します。 37 ° C で 8 分以上の剥離液 (14 mL すべて 150 cm2フラスコ) と潜伏を使用してフラ?…

Representative Results

露光法の開発 私たちは洗練され、ひと角膜上皮細胞線 SV40 HCEC 高温超伝導の研究で使用するための適合性を評価します。SV40 HCEC SV 40 大 T 抗原を用いた不死化された層から発掘 Pal23からの贈り物だった.簡潔にここに提示する露出方法論開発の検討も多くの変数があった、だから、信じて我々 ?…

Discussion

ここ HF および CP の傷害の研究のためのモデルをスクリーニングする高スループット角膜上皮細胞の開発に、私たちの方法と結果を述べる。HF 傷害の主な siRNA 画面から結果を提案する.TIC の傷害の研究のための高温超伝導モデルの開発に多くの課題があった。我々 は細胞培養モデルの HF、HFA または CP の研究に関連する文献で見つけることができる方法は、少しの助けのだった。フッ化物イ?…

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting