Summary
Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.
Abstract
Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn over het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. In de inspanningen voor de ontwikkeling van behandelingen en therapeutics zorg voor blootstelling, kan het belangrijk om te begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van deze verwondingen. Wij stellen voor dat gebruik van hoge-doorvoer kleine remmende RNA (siRNA) screening kan een belangrijke tool die bijdragen kan aan het sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. siRNA zijn dubbele gestrande RNA molecules die 19-25 nucleotiden lang zijn en gebruik maken van het post-transcriptional gen silencing traject om te degraderen van mRNA die homologie aan siRNA hebben. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. De ontwikkeling en validering van in vitro blootstelling modellen en methoden mbt de hoge throughput screening (HTS) van waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine-(CP) geïnduceerde oogbeschadigingen en/of blessure worden gepresenteerd in dit artikel. Hoewel wij deze twee toxische stoffen geselecteerd, zijn onze methoden van toepassing tot de studie van andere toxische stoffen met kleine wijzigingen in het protocol van toxische blootstelling. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de productie van IL-8 werden geselecteerd als de eindpunten in het protocol van de screening. Verschillende uitdagingen in verband met de ontwikkeling van toxische blootstelling en cel cultuur methoden geschikt voor HTS studies worden gepresenteerd. De oprichting van HTS modellen voor deze toxische stoffen voorziet in verdere studies om het mechanisme van letsel en scherm voor potentiële therapeutics voor chemische oogbeschadigingen en/of schade beter te begrijpen.
Introduction
Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn helaas alleen in het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. De huidige strategie van de behandeling is niet-specifieke en hoofdzakelijk bevat actuele therapeutische behandelingen zoals smeermiddelen, antibiotica, en cycloplegics gevolgd door ontstekingsremmers (bijv., steroïden) eenmaal het hoornvlies heeft opnieuw epithelialized1 ,2. Ondanks de beste huidige therapeutische behandelingsopties beschikbaar is op lange termijn prognose over het algemeen slecht als gevolg van progressieve hoornvlies vertroebelt en neovascularization2,3.
Dierlijke modellen hebben van oudsher gebruikt chemische toxiciteit onderzoeken en begrijpen van de mechanismen van de schade. Dierproeven zijn echter tijdrovend en duur. Er zijn ook inspanningen ter vermindering van dierproeven. REACH-wetgeving (EG 1907/2006) in de Europese Unie heeft bijvoorbeeld bepalingen ter verminderen van dierproeven. De voorschriften omvatten een eis dat bedrijven gegevens delen teneinde dierproeven en goedkeuring van het Europees Chemicaliënagentschap voorafgaand aan het verrichten van voorgestelde proeven op dieren. Krachtens de bepalingen van REACH moeten de dierproeven een laatste redmiddel. Er is ook de Europese cosmetica-verordening (EG 1223/2009), die geleidelijk het testen van cosmetica op dieren. Wanneer dierproeven zijn uitgevoerd, zij worden geleid door de beginselen van 3V (verfijning, vermindering en vervanging), die een kader bieden voor het uitvoeren van meer humane dierlijk onderzoek, vermindering van het aantal proefdieren en het gebruik van proefdiervrije alternatieven waar mogelijk. Om deze redenen heeft het gebied van toxicologie willen aannemen in vitro testen die kunnen inzicht geven in de moleculaire mechanismen van toxiciteit en kunnen worden gedaan in de hogere doorvoer4. Dit is een functionele toxicologie benadering waar toxische stoffen worden gedefinieerd door hun functie in plaats van uitsluitend door hun chemie. Een stapje verder, functionele toxicogenomics proberen te begrijpen van de rol(len) die specifieke genen in de werking van toxische stoffen5 spelen. Met de toepassing van siRNA technologie, kunnen schermen te onderzoeken van de genfunctie in de moleculaire en cellulaire reacties op toxische stoffen worden gedaan met hoge doorvoersnelheid. siRNA zijn dubbele gestrande molecules van RNA die 19-25 nucleotiden lang die profiteren van de post transcriptionele gene silencing pathway aanwezig in alle cellen van zoogdieren6. Dit zijn synthetisch gemaakt en ontworpen om te richten van een specifiek gen. Wanneer een cel binnengebracht, siRNA wordt verwerkt en een strand, het strand van de gids, wordt geladen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). SiRNA stuurt de RISC naar een aanvullend gebied in een mRNA-molecuul en de RISC degradeert de mRNA. Dit resulteert in het terugdringen van de expressie van de specifiek gen. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. Een dergelijke aanpak is verder inzicht in de mechanismen van ricine gevoeligheid en de AHR-afhankelijke inductie van CYP1A17,8gebruikt.
De lijst van chemische terrorisme Risk Assessment (CTRA) en de toxische industriële chemische stoffen (TIC) aanbiedingen hebben gespecificeerde select chemicaliën op basis van hun toxiciteit en potentieel tijdens een terrorist, oorlogvoering of arbeidsongeval gebeurtenis9worden vrijgegeven. We passen een siRNA hoge throughput screening (HTS) toxicogenomic benadering van de studie van CTRA lijst toxische stoffen, die zijn geïdentificeerd als hoog risico van gebruik in een terroristisch incident. Traditionele toxicologie tracht te begrijpen van de schadelijke effecten die chemicaliën op levende organismen hebben; we hebben echter een verdere verlangen om te begrijpen van de mechanismen van letsel met het oog op de ontwikkeling van therapeutics en therapeutische benaderingen, en eventueel ook te informeren ontdekken van moleculen die voor therapeutische ontwikkeling kunnen worden gericht. Deze inspanning in sommige opzichten kan vergelijkbaar met het gebruik van hoge-doorvoer siRNA screening en cellen gebaseerde testen in de drug discovery proces10worden beschouwd. Een groot verschil zou zijn dat drugontdekking meestal tot doel heeft een enkelvoud doel voor therapeutische ontdekking overwegende dat in onze aanpak is het enigszins onwaarschijnlijk dat er zou een enkelvoud doel met hoge therapeutische waarde voor de behandeling van toxische blootstelling. Wij verwachten dat elke effectieve behandeling paradigma voor toxische blootstelling zou vereisen een veelzijdige aanpak om te bereiken hoge therapeutische waarde, en toxicogenomic gegevens kan een effectieve behandeling paradigma vitaal in kennis stellen.
Benchtop automatisering brengt hoge doorvoer methodologie aan laboratoria buiten de farmaceutische of de biotech-industrie. De in vitro studies aan ons instituut geweest historisch traditionele testen die lage doorvoersnelheid11,12,13. Ons laboratorium heeft in de afgelopen jaren overgestapt naar het gebruik van benchtop robotica tot hoge doorvoer siRNA screening uit te voeren. Hierin presenteren we de verfijning van oogbeschadigingen en/of cel modellen en de ontwikkeling van in vitro blootstelling methoden voor waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine (CP) geschikt voor hoge doorvoer siRNA screening. Ons doel is het identificeren van moleculen die regulering van cellulaire schade naar aanleiding van deze toxische stoffen. De doelstellingen van de bibliotheek van de siRNA die wij geselecteerd zijn G eiwit-gekoppelde receptoren, eiwit kinases, proteasen, fosfatasen genaamd, ionenkanalen en andere potentieel druggable doelen. HF en CP werden geselecteerd voor studie door kruisverwijzingen CTRA lijst agenten met de verslagen van de ToxNet van industriële ongevallen te vinden die het grootste risico van oogbeschadigingen en/of letsel via damp blootstelling9,14te presenteren. CP (chemische formule Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) werd oorspronkelijk gebruikt als een traangas in WWI15. Het wordt momenteel gebruikt als een agrarische fumigatiemiddel en functies als een insecticide, fungicide en nematicide16. Waterstoffluoride (HF) wordt gebruikt in processen zoals alkylatie in olieraffinaderijen en elektrochemische fluorering van organische stoffen17. HF (chemische formule HF, CAS-nummer 62778-11-4) is een gas, maar in de waterige vorm is fluorwaterstofzuur (HFA, CAS number 7664-39-3). Dus wij gekozen om HFA gebruiken in onze in cel blootstelling modellen. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de inflammatoire IL-8-markering werden geselecteerd als de eindpunten omdat doelstellingen die bij cellulaire schade betrokken zijn moeten worden weerspiegeld in de dood van de cel en de ontstekingsreactie. In het bijzonder als een doelwit waren een beschermende rol te spelen in toxische blootstelling, moet celdood en/of inflammatoire cytokine productie verhogen wanneer de target-expressie door siRNA wordt geremd. Het omgekeerde zou gelden voor doelstellingen die een negatieve rol spelen. Ook lijkt chronische ontsteking een rol te spelen in de cornea pathologie na blootstelling, en de interventie in de cel dood wegen kan verbetering van klinische resultaten2,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel cultuur onderhoud
- Groeien de cellijn SV40-HCEC bij 37 ° C, 5% CO2, en 90% vochtigheid in DMEM F-12 met 15% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 10 µg/L epidermale groeifactor (EGF) en 5 mg/L insuline.
- Passage de cellijn elke 3 tot 4 dagen (afhankelijk van de dichtheid van het seeding) om ervoor te zorgen dat confluentie nooit groter is dan 80% tijdens het onderhoud van de cultuur.
- Loskoppelen van de cellen van de kolven met behulp van een detachement solution (14 mL oplossing voor elke 150 cm2 kolf) en incubatie bij 37 ° C gedurende niet meer dan 8 minuten.
- Neutraliseren van het detachement oplossing met een gelijk volume cel kweekmedium- and -pellet cellen in 50 mL conische buizen door centrifugeren gedurende 7 minuten op 160 x g.
- Resuspendeer de pellet cel in medium (20 mL voor elke kolf 150 cm2 ).
- De cellen met een geautomatiseerde handheld cel teller en zaad in nieuwe kolven op een dichtheid die hen in staat te groeien voor 3 tot 4 dagen zonder meer dan 80% confluentie te tellen.
2. plaat cellen voor experimenten
- Selectievakje maatkolven van SV40-HCECs door de lichte microscopie van fase contrast om ervoor te zorgen dat confluentie is minder dan 80% en het beoordelen van de algemene cell gezondheid.
- Loskoppelen, pellet resuspendeer en SV40-HCECs van de kolven zoals beschreven in stap 1.3 naar de 1.6 van cel cultuur onderhoud tellen. Hiermee kunt u dat SV40-HCEC medium met 0,5 µg/mL hydrocortison (HCORT medium) resuspendeer de cellen.
- Maak een suspensie van SV40-HCECs bij 17,857 cellen/mL in voorverwarmde HCORT medium in een wegwerp middellange fles.
- Een voldoende hoeveelheid celsuspensie voorbereiden op het aantal platen te worden ontpit.
- Zaad van een minimum van 14 x 96-wells-platen met cellen voor elke siRNA bibliotheek plaat worden bestudeerd.
- Swirl van de fles om gelijkmatig opschorten van de cellen, een voldoende volume van de celsuspensie giet in een reservoir op het roteerschudapparaat nest van een geautomatiseerde vloeibare handler en opslaan van de fles met de celsuspensie op een 37 ° C plaat opwarming van de aarde tijdens de cel plating proces.
- Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler aan cellen toevoegen aan de platen bij een dichtheid van 1000 cellen per putje (5000 cellen/cm2) in 70 µL van medium per putje van een 96-wells-plaat. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
- De roteerschudapparaat op 100 rpm constant tijdens het seeding uitvoeren.
- Meng de celsuspensie drie keer (140 µL vermengen volume) met behulp van de geautomatiseerde vloeibare handler.
- 140 µL van de celsuspensie gecombineerd en afzien van 70 µL in elk putje van twee cel cultuur platen.
- Herhaal stap 2.5.3 en 2.5.4 totdat alle platen hebben is bezaaid met cellen.
- Bijvullen van het reservoir van de schorsing cel zo nodig tijdens het seeding.
- Nadat de platen hebben is uitgezaaid, verwijderen uit de geautomatiseerde vloeibare handler en broeden ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u ze overbrengt naar een cel cultuur incubator.
- Evalueren van de celdichtheid van elke put voor elke plaat de volgende ochtend met behulp van een geautomatiseerd imaging systeem die is gehuisvest in een cel cultuur incubator en uitsluiten van alle platen uit de studie die interieur putten die niet tussen 15% en 22% heuvels.
3. transfect cellen met siRNA
- Verwerven van siRNA bibliotheek platen van de leverancier vooraf geconfigureerd bevatten 80 siRNA doelstellingen per plaat (Zie Figuur 4), met de kolommen 1 en 12 leeg gelaten.
- Reconstrueren de siRNA bibliotheek plaat met siRNA buffer aan een definitieve concentratie van 2 pmol/µL voor elk putje van siRNA volgens de fabrikant instructies19.
- Transfect de cellen 24 h na het zaaien met 4 pmol/putje van siRNA en 0,3 µL per putje van transfectiereagens. Voer alle stappen uit volgens protocol van de transfectie reagens fabrikant (Zie Figuur 4 voor plaat lay-out)20.
- Alle de transfections met behulp van een geautomatiseerde vloeibare handler uitvoeren, en gebruik een 25 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die zal zijn transfected.
- Gebruik de top helft van de plaat van de bibliotheek aan de transfect een set van zes repliceren platen hierna aangeduid als de "Top plaat Set" (zes repliceert per siRNA, n = 6).
- Gebruik de onderste helft van de plaat van de bibliotheek naar een andere set van zes repliceren platen transfect hierna aangeduid als de "onderste plaat Set" (zes repliceert per siRNA, n = 6).
- Gebruik de term "Volledige plaat Set" om te beschrijven de 12 cell platen die met bibliotheek siRNA hebben zijn transfected.
- Transfect putten B2-B6 van alle platen in de volledige plaat Set met negatieve pool siRNA nadat alle boven- en onderkant plaat sets met bibliotheek siRNA hebben zijn transfected.
- Ook transfect putjes B2-B6 van een andere twee platen, die ontvangen geen bibliotheek siRNA en zal dienen als onbelicht besturingselementen (een voor de bovenplaat set) en één voor de bodem plaat set, met negatieve pool siRNA.
- Incubeer alle cel platen in een cel cultuur incubator voor 4 uur na alle transfectie mixen bijgekomen en mix door zachte tikken van elk uur.
- Gebruik een geautomatiseerde vloeibare handler te wassen alle putjes van de platen tweemaal met voorverwarmde HCORT medium verdund 1:5 in PBS. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
- Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in een afval reservoir.
- Toevoegen aan elke goed 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium verdund 1:5 in PBS die is opgenomen in een ander reservoir op een voldoende hoeveelheid voor het aantal platen.
- Herhaal stap 3.5.1 en 3.5.2 voor elke plaat.
- Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
- Bijvullen van het reservoir met HCORT medium verdund 1:5 in PBS zo nodig.
- Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in het afval reservoir.
- Bijvoeding alle putjes van de platen met 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium, die is opgenomen in een ander reservoir op een voldoende hoeveelheid medium voor het aantal platen.
- Bijvullen van het reservoir met medium zoals nodig.
- Putjes C2-C6 van alle platen als niet-transfected besturingselementen gebruiken.
- Houd wells B7-B11 en C7-C11 van alle platen niet-transfected om te worden gebruikt als drugs- en voertuig besturingselementen voor toxische blootstelling.
4. bijvoeding de cellen de volgende dag
- Gebruik een geautomatiseerde vloeibare handler aan bijvoeding alle putjes van de platen. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
- Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in een afval reservoir.
- Bijvoeding elk goed met 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium dat is opgenomen in een ander reservoir en heeft een voldoende volume van medium voor het aantal platen te worden refed.
- Herhaal stap 4.1.1 en 4.1.2 desgewenst aan bijvoeding alle platen van de cel.
- Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
- Bijvullen van het reservoir met medium zoals nodig.
5. de positieve controle toevoeging
- Twee dagen na de transfectie en twee uur voorafgaand aan blootstelling, bereid een 62,5 µM-oplossing van de positieve controle cardamonin in HCORT medium worden gebruikt voor HFA vorderingen en toevoegen aan rij B van een 8-rij verdunning reservoir.
- Voor CP blootstelling, bereiden en gebruiken van een oplossing van 25 µM van SKF 86002.
- Voorbereiden van een volume van positieve controle voldoende is voor het aantal platen te beproeven.
- Bereid een 0.625%-oplossing van DMSO in HCORT medium (voertuig control) en voeg aan rij C van de dezelfde reservoir.
- Voor CP blootstelling, bereiden en gebruiken van een 0,5%-oplossing van DMSO.
- Voorbereiden van een volume van voertuig controle voldoende is voor het aantal platen te beproeven.
- Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler positieve en voertuig besturingselementen toevoegen aan wells B7-B11 en C7-C11 van elke cel plaat en gebruik een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die de besturingselementen positief en voertuig ontvangt.
- 10 µL van medium verwijderen uit putten B7-B11 en C7-C11 van elke cel plaat en gooi het in rijen G en H van het reservoir 8-rij verdunning.
- Breng van 10 µL van de positieve en voertuig besturingselementen in die putjes en meng 3 keer.
- Deze cel platen terugkomen in de incubator.
- Herhaal stap 5.3 naar 5.4 totdat alle cel platen hebben ontvangen positieve en besturingselementen van het voertuig.
6. HF blootstelling van gekweekte cellen
Let op: HFA is corrosief en acuut toxisch.
- Alle chemische blootstelling bewerkingen uitvoeren in een chemische zuurkast een laboratorium jas, wegwerp polyethyleen mouwbeschermers, dubbele nitril handschoenen en veiligheidsbril dragen.
- Verwerven HFA als een 48% oplossing.
- Verdun HFA tot 1% met ultrazuiver water en op te slaan in 5 mL aliquots in flesjes van 10 mL dikke muur polyethyleen om veiligheid te verbeteren.
- Decontaminatie Pipetteer tips en reservoirs die met HFA en eventuele overgebleven vloeibare HFA met 2,5% calcium gluconaat voorafgaand aan verwijdering in de stroom van gevaarlijke afvalstoffen in contact zijn gekomen.
- Voor elke siRNA bibliotheek plaat onderzochte, bereid een 0.0036% HFA middellange-oplossing door het toevoegen van 288 µL van 1% HFA tot 80 mL voor voorverwarmde HCORT medium in een fles van 150 mL.
- Swirl van de fles en de verdunde HFA in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 10 minuten uit te broeden.
- Meng de middellange HFA-oplossing opnieuw door de fles zwenken en voeg de HFA middellange oplossing aan een reagens reservoir op een schotelverwarmer.
- De blootstelling met twee technici werken in tandem uitvoeren.
- Hebben de technicus op de juiste aspirate 100 µL van elk van de interieur putjes van de plaat van een cel met behulp van een pipet 12 kanaal en geef vervolgens de plaat aan de technicus aan de linkerkant.
- De technicus aan de linkerkant Voeg 100 µL per putje van de middellange oplossing van HFA heb.
- Herhaal stap 6.4.1 en 6.4.2 voor alle cel-platen die worden blootgesteld aan veroorzaken.
- Ook Herhaal stap 6.4.1 en 6.4.2 voor onbelichte controle platen, met behulp van verse HCORT medium in plaats van de middellange HFA-oplossing.
- Plaats de platen in de chemische fume hood incubator voor 20 min en vervolgens terugsturen naar de cel cultuur incubator.
- Herhaal de stap van de positieve controle inzake toevoeging (stappen 5.1 tot 5,5) zoals eerder getoond zodra alle platen zijn blootgesteld en keerde terug naar de cel cultuur incubator.
7. CP blootstelling van gekweekte cellen
Let op: CP is acuut toxisch en een irriterend.
- Alle chemische blootstelling bewerkingen uitvoeren in een chemische zuurkast een laboratorium jas, wegwerp polyethyleen mouwbeschermers, dubbele nitril handschoenen en veiligheidsbril dragen.
- Verwerven van CP.
- Verdun CP tot 5% in DMSO en op te slaan in 10 mL aliquots in flesjes van 10 mL Scintillatie om veiligheid te verbeteren.
- Decontaminatie Pipetteer tips en reservoirs die met CP en eventuele overgebleven vloeibare CP met 2,5% natrium bisulfiet voorafgaand aan verwijdering in de stroom van gevaarlijke afvalstoffen in contact zijn gekomen.
- Voorbereiden van een voldoende hoeveelheid voorverwarmde HCORT medium met 1 x Pen/Strep en voorverwarmde PBS voor het aantal platen te worden blootgesteld.
- Voor elke set Top plaat instellen of bodemplaat, voeg 8.04 µL van 5% CP in DMSO naar een hoeveelheid van 50 mL van voorverwarmde HCORT medium en mix goed voor een eindconcentratie van de CP van 0,0008%. Cap de buis strak en Incubeer de oplossing in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 1 uur.
- De tijd van de toevoeging van CP aan de 50 mL aliquots van medium zodat elk blootgesteld Top plaat ingesteld en veroorzaken precies 1 h bodem plaat ingesteld ontvangt nadat CP werd toegevoegd aan het 50 mL monster van medium.
- Een Top plaat ingesteld en 1 onbelicht controle plaat verwijderen uit de cel cultuur incubator en plaats ze in de chemische zuurkast in de buurt van het einde van de incubatieperiode.
- Meng de CP-oplossing door het omkeren van de buis en decanteren het vervolgens naar een reagens reservoir aan het eind van de incubatieperiode van 1 h.
- De blootstelling met twee technici werken in tandem uitvoeren.
- Hebben de technicus op de juiste aspirate 100 µL van elk van de interieur putjes van de plaat van een cel met behulp van een pipet 12 kanaal en geef vervolgens de plaat aan de technicus aan de linkerkant.
- De technicus aan de linkerkant Voeg 100 µL per putje van de CP middellange oplossing hebben.
- Herhaal stap punten 7.6.1 en 7.6.2 voor alle platen van de cel van de Set van Top plaat worden blootgesteld aan veroorzaken.
- Ook Herhaal punten 7.6.1 en 7.6.2 voor onbelichte controle platen, met behulp van verse HCORT medium in plaats van de CP middellange oplossing.
- Plaats de platen in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 10 minuten.
- Voeg een voldoende hoeveelheid PBS en HCORT medium met 1 x Pen/Strep aan reagens stuwmeren in de buurt van het einde van de incubatieperiode van 10 min.
- De CP-oplossing uit cel platen met behulp van een pipet 12 kanaal verwijderen en het vervangen van 100 µL per putje van PBS aan het eind van de incubatietijd van 10 min.
- Onmiddellijk de PBS uit cel platen te verwijderen en te vervangen door 100 µL per putje HCORT medium dat 1 x Pen/Strep.
- Ook Herhaal 7.9 en 7.10 voor de onbelichte controle platen.
- De platen van de cel terug naar een standaard cel cultuur incubator.
- Herhaal stap 7.3 naar 7.12 voor de bodem plaat Set.
- Herhaal de stap van de positieve controle inzake toevoeging (stappen 5.1 tot 5,5) zodra alle platen zijn blootgesteld en keerde terug naar de cel cultuur incubator zoals hiervoor is beschreven.
8. voorbeeld van de collectie en cel levensvatbaarheid Assay
- Vierentwintig uur na de blootstelling, bereid een oplossing van 0, 5 mg/mL MTT substraat in PBS met 10 g/L glucose en warm tot 37 ° C21. Bereiden van 10 mL substraat voor elke plaat te worden bepaald.
- Voeg een voldoende hoeveelheid MTT substraat oplossing naar een reservoir van een geautomatiseerde vloeibare-handler voor het aantal platen worden bepaald.
- Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler monster verzameld en toevoegen van MTT substraat met behulp van een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen. Vooraf configureren van tip vakken om alleen die putten te worden bepaald.
- Aspirate 95 µL van medium uit de innerlijke 60 putten uit de cel plaat, en de storting 42,5 µL in elk van de twee platen van 384-well-opslag.
- Onmiddellijk 100 µL per putje van de MTT substraat oplossing toevoegen aan de cel platen, en hen Incubeer bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 1,5 h.
- Het bijvullen van het reservoir met MTT substraat oplossing zo nodig.
- Incubeer de platen van de cel bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 1 h.
- Zegel van de platen 384-well opslag en bewaar ze bij-80 ° C voor latere analyse.
- Herhaal stap 8.3 naar 8,5 voor alle boven- en onderkant plaat sets en de bijbehorende onbelicht besturingselementen.
- Hergebruik tips tussen wordt gerepliceerd als gewenst, maar ze was bij het toevoegen van MTT substraat oplossing en als schakelen tussen plaat wordt ingesteld.
- Na de incubatie 1 h toevoegen een voldoende hoeveelheid DMSO naar een reservoir van een geautomatiseerde vloeibare handler.
- Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler toevoegen van DMSO en gebruik een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen.
- Gecombineerd 100 µL van elk van de innerlijke putten van de cel-platen en gooi de MTT substraat oplossing in een afval reservoir.
- Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
- Overlay elk putje met 100 µL DMSO.
- Bijvullen van het reservoir DMSO zo nodig.
- Gecombineerd 100 µL van elk van de innerlijke putten van de cel-platen en gooi de MTT substraat oplossing in een afval reservoir.
- Schud de platen op een plaat shaker gedurende 3 minuten.
- Meet de extinctie op 570 en 690 nm met behulp van een plaat spectrofotometer.
- Aftrekken van de achtergrond en de levensvatbaarheid van de cellen van de % door de blootgestelde absorptie-waarden te delen door de onbelichte besturingselementen te berekenen. Gebruik het gemiddelde onbelicht negatieve pool siRNA besturingselement voor het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen van de % voor alle doelen.
9. maatregel IL-8 concentratie in cel cultuur supernatant
- Maatregel de concentratie van IL-8 in de cel cultuur supernatant met behulp van een no wassen kraal gebaseerde bepaling volgens22instructies van de fabrikant. Maak een lay-out van het plaat assay voor monsters en standaard curve.
- Verwijderen van de 384-well opslag platen uit de diepvries-80 ° C, ontdooien bij kamertemperatuur en kort centrifugeren de platen voor het verzamelen van het monster in de bodem van de putten.
- Voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd, een voldoende hoeveelheid anti-IL-8 acceptor kralen en biotinyleerd anti-IL-8 antilichaam in assay buffer inbegrepen in de kit te maken. De verhouding van 50 µL van anti-IL8 acceptor kralen en 50 µL van biotinyleerd anti-IL8 antilichaam aan 9.9 milliliters assay buffer gebruiken.
- Met behulp van een meerkanaals Pipet, parel/antilichaam mengsel aan een plaat met zwarte 384-well opslag toevoegen.
- Acceptor parel/antilichaam aan de putten die bestemd zijn voor gebruik voor monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen.
- Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
- Met behulp van een meerkanaals Pipet, parel/antilichaam mengsel aan een plaat met zwarte 384-well opslag toevoegen.
- Reconstrueren van IL-8-norm tot 1000 pg/mL met behulp van cel kweekmedium dat 354 µM NaCl. Maak een voldoende volume voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
- Acht tweevoudige seriële verdunningen van de standaard curve maken
- De standaard curve in drievoud toevoegen aan de juiste putjes van de plaat van een zwarte 384-well opslag volgens de assay plaat lay-out. Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
- Op dezelfde manier toevoegen cel kweekmedium dat 354 µM NaCl met IL-8 voor de meting van de achtergrond.
- Gebruik een geautomatiseerde vloeibare-handler voor het uitvoeren van de test. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die zijn aangewezen door de assay plaat lay-out. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
- 8 µL van het mengsel van de kraal-antilichaam acceptor overbrengen in de putten van de witte ondiepe 384-well goed assay-platen.
- Alleen toevoegen aan de putjes aangewezen voor monsters en de standaard curve volgens de assay plaat lay-out.
- Breng 2 µL van de standaard curve aan de juiste putjes van de ondiepe goed assay platen volgens de assay plaat lay-out.
- Bereid een 3.54 M NaCl-oplossing en een voldoende volume voor het aantal platen te worden bepaald naar een ondiep reservoir van de geautomatiseerde vloeibare-handler toevoegen.
- Aanpassen van de zoutconcentratie van de monsters naar overeenkomen met die van de standaard curve door de overdracht van 4.5 µL van de NaCl-oplossing aan de monsters in de zwarte 384-well opslag platen.
- Meng de monsters driemaal met een mengen volume van 30 µL en overdracht 2 µL van de monsters naar de ondiepe wit goed assay platen volgens de assay plaat lay-out.
- Tips tussen monster platen wijzigen
- Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
- Voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd, een voldoende hoeveelheid acceptor kralen in assay buffer te maken. De verhouding van 200 µL van secundaire acceptor parels aan 12.3 mL assay buffer gebruiken.
- Met behulp van een meerkanaals Pipet, secundaire kralen aan een plaat met zwarte 384-well opslag toevoegen.
- Secundaire kralen aan de putten die bestemd zijn voor gebruik voor monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen.
- Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
- Met behulp van de geautomatiseerde vloeibare handler, overdracht 10 µL van de secundaire parels aan de putjes van de witte ondiepe 384-well goed assay platen.
- Alleen aan de putten die ontvangen van monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen en wassen van de tips tussen elke plaat.
- Incubeer gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur.
- 8 µL van het mengsel van de kraal-antilichaam acceptor overbrengen in de putten van de witte ondiepe 384-well goed assay-platen.
- Het zegel van de test platen met duidelijk plaat zeehonden en scannen met behulp van een afleesapparaat compatibel met de test. 0.2 mm afstand tussen de plaat en detector, 180 ms excitatie tijd en 550 ms meting tijd gebruiken voor de scan.
- Importeren van de ruwe gegevens van de IL-8 testen in een werkblad.
- Gebruik van geautomatiseerde curve passend voor de standaard curve van de tests van de IL-8, en vervolgens de onbewerkte gegevens omzetten in pg/mL voor elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwikkelen van de methoden van blootstelling
We verfijnd en de geschiktheid van de menselijke hoornvlies epitheliale cellijn SV40-HCEC voor gebruik in HTS studies geëvalueerd. SV40-HCEC zijn vereeuwigd met behulp van het SV-40 grote T antigeen en waren een geschenk van Dhanajay Pal23. Er waren te veel variabelen onderzocht in het blootstelling Methodiekontwikkeling bondig hierin presenteren, en dus, alleen enkele monsters van bevindingen die wij geloven meer in het algemeen kunnen gelden tot meerdere toxische stoffen worden gepresenteerd.
Toxische blootstelling door Spike of middellange Exchange
We in eerste instantie getracht cellen weergeven waarmee werkmapberekeningen door blancobepalingen 5 µL van een concentratie van de werken van veroorzaken verdund in water, zout of een schijf in 95 µL van medium reeds aanwezig zijn in elk putje van cellen in een 96-wells-plaat aan de uiteindelijke gewenste blootstelling-concentratie wordt bereikt. SV40-HCEC werden blootgesteld met behulp van deze piek bloot/bijvoeding methodologie 1 X LD50 van HFA gedurende 24 uur (1 X LD50 = 0,02% HFA door deze methode als de Prikker HFA was verdund in medium), en wells waren refed met verse middellange 10 min later. De cellen waren na 24u bedekt met MTT substraat zoals hierboven beschreven voor de cel levensvatbaarheid assay. Beelden werden gevangen door photomicroscopy voorafgaand aan de solubilisatie van de formazan kristallen met DMSO. Nauwgezet onderzoek van putten is gebleken dat een grote mate van celdood werd gelokaliseerd op één plek, en dit ondanks het feit dat de plaat gedurende 15 werd geschud s onmiddellijk na de Prikker toevoegde aan de gehele plaat (Figuur 1a). Dit verschijnsel werd waargenomen wanneer de Prikker toevoegde aan de onderkant van het goed of wanneer toegevoegd aan de meniscus. Een hogere vergroting beeld van dit gebied met behulp van fase contrast toont dat cellen zijn nog steeds aanwezig in het gebied onbevlekt door MTT (Figuur 1b). We testten ook een middellange uitwisseling bloot/bijvoeding methodologie waar medium werd verwijderd uit de putten, vervangen door cel kweekmedium dat de 1 X LD50 van HFA (1 X LD50 = 0,035% HFA door deze methode) en wells waren refed met verse middellange 10 min later. De cellen waren na 24u bedekt met MTT substraat zoals hierboven beschreven. Deze methode bereikt een blijkbaar meer zelfs cel dood respons van cellen binnen elk putje (Figuur 1 c en 1 d). Onbelichte besturingselementen worden verstrekt ter referentie en tonen geen gelokaliseerde gebieden van celdood (Figuur 1e en 1f). Bij CP vorderingen de spike wijze niet tot gevolg hebben een grote mate van celdood gelokaliseerd op één plek binnen elk putje; de cel dood reactie was echter uit een iteratie consequenter naar de volgende methode middellange uitwisseling blootstelling (gegevens niet worden weergegeven).
Figuur 1 : Cel dood geïnduceerd door spike en blootstelling-methoden voor middelgrote sleuteluitwisseling. Alle beelden werden gevangen 1,5 h na toevoeging van MTT substraat. Deelvenster (a) is een heldere veld beeld van SV40-HCEC blootgesteld aan HFA Prikker bloot/bijvoeding methodologie. Paneel (b) is een hogere vergroting van de dezelfde put in deelvenster (a) met fase contrast. Paneel (c) is een heldere veld beeld van SV40-HCEC blootgesteld door middelgrote beurs bloot/bijvoeding methodologie. Paneel (d) is een hogere vergroting van de dezelfde put in deelvenster (c) met fase contrast. Panelen (e) en (f) zijn van een veld onbelicht goed, helder en fase contrast hogere vergroting, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Toxische stabiliteit in Medium
Het werd waargenomen dat als verdund in medium, de duidelijke cytotoxiciteit van HF en CP verandert en vervolgens stabiliseert. HFA was op middellange tot 0.0036% verdund en mogen Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-60 minuten vóór blootstelling SV40-HCECs zoals hierboven beschreven. Voor HFA verhoogt de cytotoxiciteit binnen de eerste 5 min dat HFA in medium wordt verdund en vervolgens stabiel voor ten minste een uur (Figuur 2a). Unidirectioneel ANOVA gevolgd door Dunnett van meerdere vergelijkingstest toonde de levensvatbaarheid van de cellen van dat % op alle tijdstippen waren sterk afwijkt van de 1 min tijd punt. Er waren geen significante verschillen tussen de 2.5 tot 60 min tijd punten. CP is organisch en wordt eerst verdund tot 5% in DMSO. Het was vervolgens verdund op middellange tot 0,0008% en mogen Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-120 minuten vóór blootstelling SV40-HCECs zoals hierboven beschreven. Zodra verdund in medium, de cytotoxiciteit van CP vermindert van meer dan 60 min en vervolgens stabiliseert voor ten minste de volgende h (Figuur 2b). Unidirectioneel ANOVA gevolgd door Dunnett van meerdere vergelijkingstest toonde de levensvatbaarheid van de cellen van dat % op alle tijdstippen waren van de 5 min tijd punt afwijkt. Er waren geen significante verschillen tussen de 60 tot 120 min tijd punten.
Figuur 2 : Toxische verlies van cytotoxiciteit wordt in middelgrote verdunningen. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde van de procentuele levensvatbaarheid ± SD (n = 6). Deelvenster (a) wordt de stabiliteit van 0.0036% HFA cytotoxiciteit wanneer verdund in medium en geïncubeerd bij kamertemperatuur voor 1-60 min vóór bloot SV40-HCECs zoals hierboven beschreven. Paneel (b) toont de stabiliteit van 0,0008% CP cytotoxiciteit wanneer verdund in medium en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-120 minuten kunnen vóór blootstelling SV40-HCECs zoals hierboven beschreven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Bloot/bijvoeding of Expose alleen
Een andere factor in het blootstelling methodologie onderzocht werd of: A) veroorzaken toevoegen voor 10 min, wassen, bijvoeding, het verwijderen van platen uit de chemische zuurkast, en incubeer 24u in een standaard cel cultuur incubator (bloot/bijvoeding methode); of B) veroorzaken toevoegen, laat het op platen uit de chemische zuurkast verwijderen en incubeer 24u in een standaard cel cultuur incubator (bloot enige methode). Veiligheid is een belangrijke factor als het kan niet toegestaan voor het verwijderen van platen van cellen met verdunde veroorzaken van de chemische zuurkast omdat de veroorzaken zal uit-gas en personeel bloot. Een verwante overweging is het aantal platen worden blootgesteld op een bepaald moment sinds de meer platen er zijn, zal er een groter volume off-vergassing. In onze HTS-methoden onthullen we 48 x 96-wells-platen in een bepaalde studiedag. We blootgestelde cel cultuur platen in een verzegelde zak worden geplaatst en vervolgens gebruikt colorimetrische gas detector buizen te beoordelen CP en HF af-vergassing van blootgestelde platen. We vonden dat bloot 48 platen op 1 x LD50 van HFA niet leidt een aantoonbaar HF tot af-vergassing (gegevens niet worden weergegeven). Bij CP vorderingen vonden wij dat er genoeg CP was uit-vergassing van 48 platen blootgesteld aan 1 x LD50 in te dienen op zijn minst enige veiligheidszorg (gegevens niet worden weergegeven). Zowel bloot/bijvoeding en bloot alleen methoden werden geëvalueerd voor HFA vorderingen. SV40-HCEC cellen werden blootgesteld aan HFA en levensvatbaarheid werd beoordeeld door MTT assay 24u na blootstelling. Dosis reactie iteraties werden uitgevoerd op verschillende dagen. Vergeleken met de methode van bloot/bijvoeding (Figuur 3a), vonden we dat de enige methode van bloot consistenter cel levensvatbaarheid assay (Figuur 3b resultaten). Daarom is deze methode werd geselecteerd als onderdeel van de laatste blootstelling-methodologie. Voor CP, eventuele verschillen in de consistentie van cel levensvatbaarheid assay resultaten tussen de twee methoden voor de verschillende belichtingsprogramma kon niet worden geëvalueerd omdat veiligheidsrisico's uitgesloten voor het verwijderen van de CP blootgesteld platen uit de chemische zuurkast voor 24 uur incubatie in een standaard cel cultuur incubator.
Figuur 3 : Blootstelling consistentie met bloot/bijvoeding en slechts methodes bloot. De gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde van de procentuele levensvatbaarheid ± SD (n = 6). (a) HFA was verdund in medium, bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten geïncubeerd en vervolgens cellen weergeven waarmee werkmapberekeningen gebruikt door de methode bloot/bijvoeding. (b) HFA was verdund in medium, bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten geïncubeerd en vervolgens gebruikt om bloot SV40-HCEC door de enige methode van bloot. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Cel Model verfijning
Middellange bestanddelen
Wij vastgehouden aan de cultuur voorwaarden die zijn vastgesteld door de van oorsprong onderzoekers voor de passage en het onderhoud van deze cellijnen; Nochtans, gewijzigd wij hen voor cellen in experimenten. De cel-kweekmedium voorgeschreven door de van oorsprong onderzoekers voor de SV40-HCEC cellen bevat geen hydrocortison, maar we een laag niveau van hydrocortison (0,5 µg/mL) gebruikt tijdens blootstelling studie te onderdrukken de occasionele piek in de cytokine productie gezien in de naïeve SV40-HCEC (gegevens niet worden weergegeven) die aangetast data-analyse van een iteratie naar de volgende tijdens de studie van de verfijning.
Fenotypische stabiliteit
Tijdens onze cel model verfijning studie, vonden we dat de SV40-HCEC beginnen te zijn gedaald cytokine productie in reactie op toxische blootstelling beginnend rond passage nummer 60 (gegevens niet worden weergegeven). Om deze reden, wij onderhouden cryostocks van lage passage cellen uitgevoerd van alle studies cuvetten onder passage nummer 60 en cytokine productie tijdens het beoordelingsproces gecontroleerd.
Plaat lay-out
Een belangrijke bron van experimentele variabiliteit in hoge-doorvoer studies is randeffecten van multi goed platen. We vonden dat de cytokine antwoorden van cellen in rand wells niet consistent met waren, of gelijkwaardig aan, interieur putjes in beide HFA en CP studies (gegevens niet worden weergegeven). Mediaan Pools van de gegevens, een statistische oefening gebruikt om te minimaliseren van de gevolgen van de rand voor een gegevensset, niet voldoende opgelost de kwestie (gegevens niet worden weergegeven). Daarom werden geen cel plaat rand wells gebruikt voor experimenten of besturingselementen (Figuur 4).
Figuur 4 : Bibliotheek en cel plaat lay-outs. De grijs gearceerde gebieden in de bibliotheek plaat indeling vertegenwoordigen putten die siRNA bevatten. De witte putten zijn leeg. De 40 doelen uit rijen A-D van de bibliotheek plaat worden gebruikt in de "Top Set van de plaat", en de 40 doelen uit rijen E-H van de bibliotheek plaat worden gebruikt in de "onderste plaat Set". Wells B2-B6 worden gebruikt voor negatieve pool siRNA besturingselementen. Wells C2-C6 zijn niet-transfected. Wells B7-B11 worden gebruikt voor cardamonin of SKF 86002 positieve controle drugs zoals beschreven, en wells C7-C11 voor DMSO voertuig controle worden gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In Vitro modelvalidatie voor HTS
We gebruikten Z' factor analyse om te bepalen van de geschiktheid van SV40-HCEC voor gebruik in HTS studies zoals deze statistische test wordt gebruikt om assay kwaliteit voor HTS24te bepalen. Voor HF Z' factor analyse, cellen werden zaadjes op 1,25 x 103 cellen per putje, transfected met negatieve pool siRNA (zoals hierboven beschreven) 24 h na het zaaien en blootgestelde 48 h na transfectie tot 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. Voor CP Z' factor analyse, cellen werden zaadjes transfected zoals hierboven beschreven en blootgesteld 48u na transfectie 0,0008% CP (1 x LD50), n = 5. Een grotere n werd gebruikt voor de CP studies ten gevolge van de grotere variabiliteit in dit model van de blootstelling. Z' factor werd berekend voor IL-8 expressie van onbelicht vs. blootgesteld cellen en negatieve pool siRNA transfected onbelicht vs. blootgesteld gegevenscellen van CP en HFA posities. Wij ook niet-transfected cellen om te bepalen of er een effect op assay kwaliteit als gevolg van siRNA transfectie was geanalyseerd. Vele iteraties van het validatieonderzoek werden uitgevoerd terwijl de raffinage van blootstelling en cultuur voorwaarden in een poging om te maximaliseren de Z' factor van resultaten. SV40-HCEC tussendekspassagier Geldigverklaring en meeste iteraties had Z' factor waarden die groter zijn dan 0.50 voor HF posities (tabel 1) en CP posities (tabel 2). Elke repliceren in deze tabellen was van cellen verguld op verschillende dagen.
| Blootstelling groepen | Z'-Factor analyse | ||
| Rep. #1 | Rep. #2 | Rep. #3 | |
| HF-blootgesteld negatieve controle vs. onbelicht negatieve controle | 0.68 | 0,5 | 0,56 |
| HF-blootgesteld vs. naïef | 0.4 | 0.68 | 0,56 |
Tabel 1: SV40-HCEC HFA blootstelling Z' Factor analyse van IL-8
| Blootstelling groepen | Z'-Factor analyse | ||
| Rep. #1 | Rep. #2 | Rep. #3 | |
| CP-blootgesteld negatieve controle vs. onbelicht negatieve controle | 0.6 | 0.18 | 0,46 |
| CP-blootgesteld vs. naïef | 0,42 | 0,29 | 0,42 |
Tabel 2: SV40-HCEC CP blootstelling Z' Factor analyse van IL-8
Primaire siRNA Screening resultaten van HFA gewond cellen
Transfectie optimalisatie studies werden uitgevoerd voorafgaand aan de screening, en siRNA gericht op cyclophilin b werd gebruikt voor deze studies. Een in situ RNA detectie assay werd gebruikt voor het meten van de mRNA niveaus van cyclophilin b, en een hoge inhoud analyzer werd gebruikt om te meten de resultaten. We bereikt in de buurt van 90% vechtpartij van cyclophilin b en meestal niet meer dan 5-10% verlies van de cel met 4 pmol van siRNA per putje en 0,3 µL per putje transfectiereagens (gegevens niet worden weergegeven). Hogere hoeveelheden siRNA eigenlijk resulteerde in armere cyclophilin b knockdown (gegevens niet worden weergegeven). Vergelijkbare niveaus van knockdown werden bereikt met 1.2 pmol/putje van siRNA en 0.09 µL per putje transfectiereagens, maar we gebruiken 4 pmol per putje om geen doelstellingen die grotere hoeveelheden van siRNA vereisen zou om effectieve knockdown gekozen. Doel vechtpartij kinetiek werden eveneens beoordeeld, en werd naar voren gebracht dat doel knockdown maximale werd door twee dagen na transfectie (gegevens niet worden weergegeven). Doel vechtpartij samenhang tussen de plaat was ook gevalideerde (gegevens niet worden weergegeven). De anti-inflammatoire geneesmiddelen cardamonin en SKF 86002 worden gebruikt als positieve controles voor de remming van de cytokine productie voor HFA en CP blootstelling, respectievelijk. Deze werden geselecteerd door de testen van een verscheidenheid van samenstellingen met bekende anti-inflammatoire eigenschappen in blootgestelde cellen. De dosis gebruikt bij bevolkingsonderzoek studies werd geselecteerd door de dosis respons optimalisatie studies.
De hoge doorvoer siRNA screening strategie we gebruikt is de industriestandaard en omvat drie belangrijke stappen: 1) primair onderzoek en 2) bibliotheek deconvolutie 3) doel validatie. In primaire screening, wordt het fenotype van elk doel geëvalueerd met behulp van een mengsel van verschillende siRNA reeksen als een enkele reagens te richten elk gen. Doelstellingen zijn dan down-geselecteerd voor bibliotheek deconvolutie. In deze stap zijn elk van de verschillende siRNA sequenties die zijn gebundeld te richten op elk gen in primair onderzoek apart getest. Doelstellingen ondergaan een ander down-selectie in doel validatie waarin het doel fenotype is bevestigd met drugs, fenotype restauratie, en/of siRNA van een andere leverancier. Voor onze primaire scherm, wij gekozen voor het uitvoeren van een gerichte sub-genomic scherm in plaats van een genoom-breedbeeld omwille van de economie. Microarray gegevens van HF en CP gewond muis hoornvlies en vindingrijkheid Pathway analyse (IPA) werden gebruikt om zich te concentreren onze doel-bibliotheek voor het primaire scherm (manuscripten in voorbereiding). Kort, muis hoornvlies werden blootgesteld aan toxische damp met behulp van een vergelijkbaar met de eerder beschreven methoden25damp-kopje. Blootgestelde hoornvlies knoppen en besturingselementen zijn geoogst in verschillende tijd punten na blootstelling. RNA werd geïsoleerd, en de kwaliteit en de hoeveelheid RNA gecontroleerd. Alle microarray experimenten werden uitgevoerd volgens de fabrikant protocol26. Ruwe signaal intensiteit zijn genormaliseerd en geanalyseerd door de belangrijkste componenten analyse (PCA) om te bepalen van de belangrijke bronnen van variabiliteit van de gegevens. Genen waren rang gerangschikt statistische significantie. De gegevens werden ontgonnen en vergeleken met gene lijsten van vooraf geconfigureerde siRNA bibliotheken. Uit deze lijsten gen geselecteerd we 3120 doelstellingen voor screening. De bibliotheek van siRNA werd vertoond in SV40-HCEC cellen (Zie Figuur 5 voor een stroomschema van het HTS-protocol voor het primaire scherm). Eindpunt evaluaties opgenomen IL-8 niveaus in cel kweekmedium door neen-wash kraal gebaseerde bepaling en levensvatbaarheid van de cellen door MTT assay. De cellen werden blootgesteld aan 0.0036%HFA, zoals hiervoor is beschreven, die is ongeveer 1 x LD50. Levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld door MTT assay 24u na blootstelling. Het effect van elke groep van siRNA op de levensvatbaarheid van de cellen werd geanalyseerd voor statistische significantie ten opzichte van het gemiddelde van de blootgestelde negatieve pool voor elke plaat met behulp van strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil (SSMD)27. Een dual-zaklamp plot van de SSMD en cel levensvatbaarheid vouw-wijziging wordt weergegeven in Figuur 6. De drempels van de hit selectie gekozen voor doelen die verergerd celdood of verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen waren SSMD ≤-1.28 en SSMD ≥ 1.28, respectievelijk.
Figuur 5 : Primaire scherm HTS protocol stroomschema. Deze stroom grafiek toont de essentiële stappen die worden uitgevoerd op elke dag voor de HTS-protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Dual-zaklamp Plot van siRNA Effect op cellen van Cell Viability of HFA-Exposed SV40-HCEC. Resultaten die worden weergegeven voor elke doelstelling zijn het gemiddelde van zes wordt gerepliceerd (n = 6). Levensvatbaarheid van celgegevens worden uitgedrukt in een vouw-wijziging ten opzichte van de blootgestelde negatieve pool controle siRNA en statistische significantie werd geanalyseerd door SSMD. Doelstellingen die had een SSMD ≤-1.28 of ≥ 1.28 uitgekozen als hits. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Het effect van elke groep van siRNA op HFA-geïnduceerde IL-8 productie werd geanalyseerd voor statistische significantie ten opzichte van het gemiddelde van de blootgestelde negatieve pool voor elke plaat. IL-8 in de cultuur van de cel supernatant was beoordeeld assay 24u na blootstelling. Een dual-zaklamp plot van de SSMD en IL-8 vouw-wijziging wordt weergegeven in Figuur 7. De drempels van de hit selectie gekozen voor doelen die productie van de IL-8 verminderde waren een daling van de 40% en SSMD ≤ -1,0. De drempels van de hit selectie gekozen voor doelen die productie van de IL-8 verhoogde vervijfvoudigen en SSMD waren > 1,28.
Figuur 7 : Dual-zaklamp Plot van het siRNA effect op de productie van IL-8 door HFA-Exposed SV40-HCEC cellen. Resultaten die worden weergegeven zijn het gemiddelde van zes wordt gerepliceerd (n = 6). IL-8 expressie niveau gegevens worden uitgedrukt in een vouw-wijziging ten opzichte van de blootgestelde negatieve pool siRNA en statistische significantie werd geanalyseerd door SSMD. Hits werden gedefinieerd als doelstellingen dat een 40 was % afname van IL-8 niveaus en SSMD ≤ -1,0, of een vijfvoudige toename van IL-8 niveaus en SSMD > 1,28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin beschrijven we onze methoden en de resultaten op de ontwikkeling van een hoge doorvoersnelheid hoornvlies epitheliale cel screening model voor de studie van HF en CP verwondingen. Ook presenteren we de resultaten van het scherm van de primaire siRNA voor HF letsel. Er waren veel uitdagingen aan de ontwikkeling van HTS modellen voor de studie van TIC verwondingen. Methoden die we in de literatuur aan de studie van HF, HFA of CP in cel cultuur modellen gerelateerde vinden konden waren weinig hulp. Meeste in vitro studies op het fluoride ion mondelinge cellen te betrekken en Natriumfluoride en niet HF of HFA gebruikt (voor enige voorbeelden, Zie28,29). Sommige methodologie op de in vitro Gasbedwelming met behulp van bronchiale epitheliale cellen CP is gepubliceerd door Pesonen et al. 30. uiteindelijk vonden we geen specifieke methode in de literatuur met betrekking tot de studie HTS HF, HFA of CP, en de overgrote meerderheid van de uitdagingen en variabelen die met de studie van deze toxische stoffen in HTS vereist ontwikkeling verband. Bijzondere aandacht werd besteed aan het bereiken van de hoge mate van blootstelling consistentie over tijd en talrijke screening platen nodig zijn voor een succesvolle studie HTS.
Één soort uitdaging ondervonden hield verband met de toepassing van veroorzaken op cel cultuur systemen. Sommige toxische stoffen zijn reactief met of unstable in waterige oplossingen. De toxische stoffen die we voor het onderzoek gekozen worden niet beschouwd als de problemen van deze instabiliteit. Een agrarische studie onderzoek naar photohydrolysis van CP toonde aan dat een 0,001 M oplossing van CP in water had een halfwaardetijd van 31.1 h wanneer blootgesteld aan een 1100 lux-xenon-lichtbron (zonlicht intensiteit van een bewolkte dag) gedurende 10 dagen, 12 uur per dag31. Er was geen meetbare hydrolyse dezelfde periode 10 dagen als de oplossing was opgeslagen in het donker. Het proton en het fluoride ion van HFA zijn duidelijk stabiel in water. Er zijn echter extra stabiliteit overwegingen met betrekking tot toxische verdunningen gemaakt in cel kweekmedium. We vonden dat er een eerste wijziging van de cytotoxiciteit tot op zekere hoogte was toen de toxische stoffen werden eerst verdund in cel cultuur medium dat vervolgens na een korte periode van tijd stabiliseert. Wij zijn van mening dat dit te wijten aan de toxische bindende- of complexvormers verwijderd met kiezers in het medium is. Cel medium bevat calcium, magnesium, eiwitten, etc. die zijn bekend om te interageren met de fluoride ion32,33. CP is bekend dat oxidatieve reacties met biologische thiolen, maar het kan ook het binden van DNA, eiwitten en andere nucleofielen34,35. Zodra deze reacties en interacties zijn voltooid of bereikte evenwicht, de hoeveelheid beschikbare veroorzaken stabiliseert en dus de schijnbare cytotoxiciteit stabiliseert. In eerste instantie verkenden we het gebruik van zout en water verdunningen van het toxische stoffen voor werkende voorraden gebruikt voor posities om te voorkomen dat toxische interacties met middellange kiezers in werkende verdunningen. Het gebruik van zout zou ook de zure component van HFA letsel bij vorderingen uitgevoerd door middelgrote uitwisseling behouden. We vonden dat de cel dood reacties voor toxische stoffen in het water en de zoute verdunningen waren meer variabele dan de methode waarmee de cel kweekmedium verdunningen met middellange exchange (gegevens niet worden weergegeven). Met betrekking tot de methode van de blootstelling spike met HFA, de variabiliteit mogelijk als gevolg van inconsistentie in de Prikker verspreiden in de goed leidt tot cellulaire doelstellingen concurreren met middelgrote bestanddelen voor de beschikbare fluoride ion. De redenen voor de variabiliteit in HFA posities door middelgrote uitwisseling met HFA zoute verdunningen zijn volstrekt onduidelijk. In elk geval waren blootstelling methodes gebruikend zoute verdunningen voor HFA verlaten en niet onderzocht voor CP. De toxiciteit van onze HFA verdunningen in middellange bootst waarschijnlijk nauw studies met Natriumfluoride omdat het medium van de cel buffer het gratis proton in onze HFA-verdunningen.
Andere uitdagingen die we tegenkwamen hadden betrekking op de verfijning van de cel cultuur modellen voor gebruik in de HTS. We vonden het nodig aan te passen van de cel kweekmedium bestanddelen voor cellen in experimenten, specifiek hydrocortison en antibiotica. We een laag niveau van hydrocortison (0,5 µg/mL) tijdens blootstelling studie te onderdrukken de occasionele piek in de cytokine productie gezien in naïef SV40-HCEC gebruikt. Deze lage hoeveelheid hydrocortison deed geen afbreuk doen aan de reacties van de cellen te veroorzaken en was onder het niveau van meestal gebruikt om te onderdrukken van cytokine productie door gekweekte cellen in reactie op stimulerende middelen36,37. De precieze redenen waarom naïef SV40-HCEC cellen soms overtollige cytokines produceren zijn niet bekend, maar het is mogelijk dat de cellen variabel gevoelig zijn voor de kleine stressoren die zich voordoen tijdens de cel passaging en plating. Vele labs omvatten routinematig antibiotica in de cel onderhoud kweekmedium, maar sommige antibiotica, tetracyclinen in het bijzonder is gebleken om anti-inflammatoire effecten op gekweekte cellen, met inbegrip van hoornvlies epitheliale cellen38tentoon te stellen. In het algemeen vermijdt ons laboratorium het gebruik van antibiotica zoveel mogelijk aangezien deze potentieel studies kunnen verwarren. We onderzochten ook de fenotypische drift over meerdere passages van onze cellen in cultuur. Het is gebruikelijk voor vereeuwigd cellen te ondergaan van genetische en/of fenotypische drift over meerdere passages, zo niet gehandhaafd in de exponentiële fase wordt doorgelaten aan confluentie of blootgesteld aan bepaalde milieustressoren39,40 ,41. Daarom is het kritische tijdens een hoge doorvoersnelheid scherm dat cellijnen zijn goed onderhouden en dat het scherm is voltooid met behulp van cel passage getallen die handhaven van de bekende fenotypische reactie. Multi goed plaat randeffecten is het verschijnsel dat cellen gekweekt in de putten van de buitenste rand van multi goed platen vaak niet hetzelfde reageren of met de dezelfde consistentie als cellen gekweekt in interieur wells42. Er zijn statistische oefeningen, zoals mediaan Pools, die kan worden gebruikt om te minimaliseren van randeffecten op een gegevensset43. Er is echter geen statistische oefening die randeffecten op een bepaald doel of het besturingselement elimineren kan als het altijd is getest in een rand goed, en ga doelstellingen variëren van de indeling van de plaat tussen repliceert of besturingselementen off van rand putten niet logistiek praktische of rendabel. Het is onze mening dat het besluit om het gebruik van rand wells in cel-gebaseerde HTS testen moet voorzichtig worden gemaakt. We vonden het nodig om te elimineren van het gebruik van cellen die zijn geteeld in rand wells voor besturingselementen en doelstellingen.
Onze HTS cel model en blootstelling methodologie voor in vitro HF letsel werd gebruikt om het scherm van de primaire siRNA van 3120 doelstellingen kan worden voltooid. SSMD werd gebruikt voor hit selectie omdat specifiek voor het meten van de omvang van het verschil tussen een besturingselement en een siRNA27werd voorgesteld. Onze resultaten voor de levensvatbaarheid van de cellen blijkt dat er een lineaire relatie in de dual-zaklamp plot tussen SSMD en vouw-verandering voor vrijwel alle doelen. Voor deze reden gebruikten we de één criterium van SSMD hit selecteren voor dit eindpunt. De gegevens van de IL-8 verschilden in dat sommige doelen had zwak maar consistente effecten, terwijl anderen bleek sterk maar inconsistent effecten. Dus we zowel vouw-verandering en SSMD gebruikt voor hit selectiecriteria voor dit eindpunt. De SSMD-waarden gebruikt voor hit selectie voor beide levensvatbaarheid van de cellen en IL-8 gegevens werden gekozen omdat cutoffs tussen 1 en 1.645 (of -1 en-1.65) lage valse ontdekking en niet-discovery tarieven44 bereiken. Er waren sommige doelen die hits in zowel de levensvatbaarheid van de cellen en de IL-8 gegevens werden. In deze gevallen, voorkeur voor opneming in de bibliotheek deconvolutie werd gegeven aan die doelstellingen die hun effecten in dezelfde richting van verbetering van de algehele gezondheid (verbeterde levensvatbaarheid en verminderde IL-8) of verergert letsel uitgeoefend (toegenomen celdood en verhoogde IL-8). Globaal, wij hebben gekozen een totaal van 250 doelstellingen tussen de levensvatbaarheid van de cellen en de eindpunten van de IL-8 aan de deconvolutie bibliotheek voor HF schade make-up. Het primaire scherm voor in vitro CP letsel wordt uitgevoerd.
Kortom, hebben we ontwikkeld blootstelling en cultuur omstandigheden geschikt voor de studie HTS oogbeschadigingen en/of schade door HF en CP. Meerdere variabelen in het blootstelling en cultuur voorwaarden werden verfijnd en geoptimaliseerd, en de modellen zijn gevalideerd te geschikt voor HTS studies door Z' factor analyse. We hebben het nut van deze modellen verder bewezen door het invullen van het primaire scherm van een bibliotheek van siRNA in het HF-model. Er zijn vele verwondingen en ziekten die van geen zijn of beperkte interesse aan de farmaceutische of de biotech-industrie, de toxische letsel door CP en HF opgenomen, en de komst van benchtop robotica vergemakkelijkt de studie HTS van verwondingen en ziekten in vrijwel elk laboratorium . Hoge-doorvoer genomic gegevens sets kunnen aanzienlijk bijdragen aan het begrip van de rollen die specifieke genen spelen in letsel of ziekte die tot efficiënter focus bijdragen kan Volg op in vitro of in vivo studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
DISCLAIMER: de meningen uitgedrukt in dit artikel zijn die van de auteur (s) en komen niet overeen met het officiële beleid van de afdeling van het leger, ministerie van defensie en de Amerikaanse regering. Dit onderzoek werd ondersteund door een interdepartementale overeenkomst tussen NIH/NIAID en de USAMRICD, en gedeeltelijk door een afspraak aan de Postgraduate onderzoeksprogramma voor deelname aan het Amerikaanse leger medisch onderzoek instituut van chemische defensie wordt beheerd door de eik Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs door een interdepartementale overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en USAMRMC.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid tegengaan programma Interagency overeenkomst # AOD13015-001. Wij wil Stephanie Froberg en Peter Hurst bedanken voor hun inspanningen en expertise op videoproductie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
References
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
- Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
- North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
- Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
- Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
- Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
- Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
- Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
- Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
- Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
- Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
- Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
- Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
- Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
- Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
- Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
- IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
- Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
- GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
- Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
- He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
- Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
- Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
- Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
- Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
- Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
- Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
- van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
- Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
- Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
- Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
- ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).
