Summary
A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.
Abstract
Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. Nos esforços para desenvolver tratamentos e terapias para cuidar de exposição, pode ser importante para compreender os mecanismos moleculares e celulares destes ferimentos. Propomos que a utilização dos rastreio pequena de RNA (siRNA) inibitório alto throughput pode ser uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. siRNA são dobro encalhadas moléculas de RNA que são 19-25 nucleotides longos e utilizam o silenciamento caminho para degradar o mRNA do gene pós-transcricional que tem homologia com o siRNA. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. O desenvolvimento e validação de modelos de exposição em vitro e métodos para o alto throughput screening (HTS) de fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina-(CP) induzido por lesão ocular são apresentados neste artigo. Embora nós selecionamos essas duas substâncias tóxicas, nossos métodos são aplicáveis ao estudo de outras substâncias tóxicas, com pequenas modificações para o protocolo de exposição tóxica. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e produção de IL-8 foram selecionados como pontos de extremidade no protocolo de triagem. Diversos desafios associados ao desenvolvimento de exposição tóxica e métodos de cultura celular adequados para estudos HTS são apresentados. Permite a criação de modelos HTS para estas substâncias tóxicas mais estudos entender melhor o mecanismo da lesão e a tela para terapêutica potencial para lesão ocular química.
Introduction
Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Infelizmente, tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea só são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. A atual estratégia de tratamento é específico e principalmente inclui tratamentos terapêuticos tópicos tais como os lubrificantes, antibióticos, e cycloplegics seguido por anti-inflamatórios (por exemplo, esteroides) uma vez a córnea tem re-epithelialized1 ,2. Apesar das melhor tratamento terapêutico opções atuais disponíveis, prognóstico a longo prazo é geralmente pobre devido à turvação corneal progressiva e neovascularização2,3.
Modelos animais tem sido tradicionalmente usados para investigar a toxicidade química e compreender os mecanismos de lesão. No entanto, estudos em animais são demorado e caro. Existem também os esforços para reduzir a experimentação animal. Por exemplo, a legislação REACH (1907/2006 CE) na União Europeia tem disposições destinadas a reduzir a experimentação animal. As disposições incluem uma exigência que as empresas compartilham dados para evitar testes animais e obtenção de aprovação da Agência Europeia dos produtos químicos, antes de realizar os testes propostos em animais. Ao abrigo das disposições do REACH, a experimentação animal deve ser um último recurso. Há também o regulamento europeu de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminadas a testes de cosméticos em animais. Quando são realizados estudos em animais, eles são guiados pelos princípios do 3Rs (refinamento, redução e substituição), que fornecem uma estrutura para a realização de pesquisas com animais mais humana, reduzindo o número de animais utilizados e usando alternativas não-animais sempre que possível. Por estas razões, o campo de toxicologia tem procurado adoptar em vitro ensaios que podem fornecer a introspecção do mecanismo molecular de toxicidade e podem ser feitos em maior taxa de transferência4. Esta é uma abordagem de toxicologia funcional onde substâncias tóxicas são definidas por sua função em vez de unicamente por sua química. Levou um passo adiante, funcional toxicogenomics procurar compreender as funções que desempenhar os efeitos de substâncias tóxicas5genes específicos. Com a aplicação da tecnologia siRNA, telas para investigar a função do gene nas respostas moleculares e celulares a substâncias tóxicas podem ser feitas com alto rendimento. siRNA são moléculas de RNA encalhadas dobro que são 19-25 nucleotides longos que aproveitar o post transcriptional gene silencioso caminho presente em todas as células de mamíferos6. Estes são sinteticamente feitos e projetados para atingir um gene específico. Quando introduzido em uma célula, o siRNA é processado e um fio, o fio guia, é carregado no complexo silencioso induzido por RNA (RISC). O siRNA direciona o RISC para uma região complementar em uma molécula de mRNA, e o RISC degrada o mRNA. Isso resulta na redução da expressão do gene específico. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. Esta abordagem tem sido usada para entender os mecanismos de susceptibilidade de ricina e a indução de AHR-dependente de CYP1A17,8.
A lista de avaliação de risco de terrorismo químico (CTRA) e as listas de produtos químicos industriais tóxicos (TIC) têm discriminados selecionados produtos químicos com base na sua toxicidade e potencial para ser liberado durante um terrorista, guerra ou acidente industrial evento9. Nós estamos aplicando um alto throughput de siRNA, abordagem de toxicogenomic (HTS) para o estudo de substâncias tóxicas de lista CTRA, que foram identificados com alto risco de utilização em um incidente terrorista de triagem. Toxicologia tradicional procura entender os efeitos adversos que produtos químicos em organismos vivos; no entanto, temos um desejo mais para entender os mecanismos de lesão com a finalidade de informar o desenvolvimento de abordagens terapêuticas e terapêutica e, possivelmente, descobrir moléculas que podem ser direcionadas para o desenvolvimento de terapêutico. Este esforço de certa forma pode ser considerado análogo ao uso de triagem de siRNA alto throughput e ensaios de célula com base na droga descoberta processo10. A principal diferença seria que essa descoberta de drogas normalmente procura um destino singular para descoberta terapêutica Considerando que em nossa abordagem é pouco provável que haja um destino singular com elevado valor terapêutico para o tratamento de exposição tóxica. Antecipamos que qualquer paradigma de tratamento eficaz para a exposição tóxica exigiria uma abordagem multi-facetada para alcançar alto valor terapêutico, e toxicogenomic dados vital podem informar uma paradigma de tratamento eficaz.
Automação de bancada traz metodologia alto throughput para laboratórios fora as indústrias farmacêuticas ou biotecnologia. Os estudos em vitro no nosso Instituto têm sido historicamente ensaios tradicionais que são de baixa taxa de transferência11,12,13. Nos últimos anos, nosso laboratório possui uma transição para o uso da robótica de bancada para realizar a triagem de siRNA alto throughput. Aqui, apresentamos o refinamento dos modelos de célula ocular e o desenvolvimento in vitro métodos de exposição para o fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina (CP) apropriada para triagem de siRNA alto throughput. Nosso objetivo é identificar as moléculas que regulam a lesão celular em resposta a essas substâncias tóxicas. Os alvos da biblioteca siRNA selecionados incluem receptores G proteína quinase de proteína, proteases, fosfatases, canais iônicos e outros alvos potencialmente druggable. HF e CP foram selecionados para o estudo por agentes de lista CTRA com os relatórios de ToxNet dos acidentes industriais a cruzar para encontrar aqueles que apresentam o maior risco de lesão ocular através do vapor exposição9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) foi originalmente usado como um gás lacrimogêneo em WWI15. Atualmente é usado como um fumigante agrícola e funções como um inseticida, fungicida e nematicida16. Fluoreto de hidrogênio (HF) é usado em processos incluindo alquilação em refinarias de petróleo e fluoração eletroquímica de compostos orgânicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) é um gás, mas na sua forma aquosa é o ácido fluorídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Portanto, eleito para usar HFA em nosso celular em modelos de exposição. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e o marcador inflamatório IL-8 foram selecionadas como pontos de extremidade alvos que estão envolvidos na lesão celular devem reflectir-se na morte celular e a resposta inflamatória. Especificamente, se o alvo fosse a desempenhar um papel protetor na exposição tóxica, morte celular e/ou produção de citocinas inflamatórias deve aumentar quando a expressão-alvo é inibida por siRNA. O contrário seria verdadeiro para alvos que desempenham um papel negativo. Além disso, inflamação crônica parece desempenhar um papel na patologia da córnea após exposição e intervenção em caminhos de morte celular podem melhorar os resultados clínicos2,18.
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Protocol
1. manutenção de cultura celular
- Crescer a linha de celular SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO2e 90% de umidade em DMEM F-12 com 15% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, µ g/L 10 fator de crescimento epidérmico (EGF) e insulina 5mg/L.
- Passagem da linhagem celular a cada 3 a 4 dias (dependendo da densidade de semeadura) para garantir que a confluência nunca excede 80% durante a manutenção da cultura.
- Separe as células de balões usando uma solução de destacamento (solução de 14 mL para cada frasco de2 150 cm) e incubação a 37 ° C para não mais do que 8 min.
- Neutralizar a solução de desprendimento com igual volume de meio de cultura celular e as células em tubos de Erlenmeyer de 50 mL de pelotas por centrifugação durante 7 min a 160 x g.
- Ressuspender o pellet de células no meio (20 mL para cada frasco de2 150 cm).
- Conte as células com um contador de celular portátil automatizado e sementes em frascos de novos numa densidade que lhes permitirá crescer por 3 a 4 dias sem exceder 80% confluência.
2. placa células para experimentação
- Balões de seleção de SV40-HCECs por microscopia de luz contraste fase para garantir essa confluência é menor que 80% e para avaliar a saúde geral da célula.
- Desanexar, pelota, resuspenda e contar SV40-HCECs de frascos, conforme descrito nas etapas de 1.3 para 1.6 de manutenção de cultura celular. Use meio de SV40-HCEC contendo hidrocortisona 0,5 µ g/mL (média HCORT) para Ressuspender as células.
- Numa garrafa descartável média, prepare uma suspensão de SV40-HCECs em células/mL 17.857 médio pré-aquecido e HCORT.
- Prepare um volume suficiente de suspensão de células para o número de placas para ser semeado.
- Sementes de um mínimo de 14 x 96 poços de placas com células para cada placa de biblioteca de siRNA ser estudado.
- Agite o frasco para suspender as células uniformemente, despeje um volume suficiente de suspensão de células em um reservatório no ninho agitador orbital de um manipulador de líquido automático e armazenar o frasco contendo a suspensão de células em um 37 ° C placa de aquecimento durante o chapeamento de célula processo.
- Use o manipulador de líquido automático para adicionar células à placas em uma densidade de 1000 células por poço (5000 células/cm2) em 70 µ l de meio por alvéolo de uma placa de 96 poços. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
- Execute o agitador orbital a 100 rpm constantemente durante o processo de preparação.
- Misturar a suspensão celular três vezes (140 µ l de volume de mistura) usando o manipulador de líquido automático.
- Aspirar a 140 µ l da suspensão celular e dispense 70 µ l em cada poço de duas placas de cultura de células.
- Repita as etapas 2.5.3 e 2.5.4 até que todas as placas têm sido inoculadas com células.
- Encha novamente o reservatório de suspensão de célula conforme necessário durante o processo de preparação.
- Depois que as placas têm sido semeadas, removê-los do manipulador de líquido automático e incube-os por 30 min à temperatura ambiente antes de transferi-los para uma incubadora de cultura de células.
- Avalie a densidade de células de cada poço por cada placa na manhã seguinte, usando um sistema automatizado de imagens que está alojado em uma incubadora de cultura celular e excluir quaisquer placas de estudo que têm poços interiores que não estão entre 15% e 22% de Confluencia.
3. transfect células com siRNA
- Adquirir placas de biblioteca siRNA do fornecedor pré-configurado para conter 80 alvos de siRNA por placa (ver Figura 4), com colunas 1 e 12 deixou vazio.
- Reconstitua a placa de biblioteca de siRNA com buffer de siRNA para uma concentração final de 2 pmol / µ l para cada poço de siRNA de acordo com instruções19 as indicações do fabricante.
- Transfect as células 24 h após a semeadura com 4 pmol/poço de siRNA e 0,3 µ l/poço de reagente de transfeccao. Executar todas as etapas de acordo com o protocolo do fabricante reagente de transfeccao (ver Figura 4 para layout de placa)20.
- Executar todas as transfections usando um manipulador de líquido automático e usar um 25 µ l/s de velocidade de pipetagem para todas as etapas. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços que serão transfected.
- Usamos a parte superior metade da placa da biblioteca de transfect um conjunto de seis pratos replicar referido como o "Top Plate Set" (seis réplicas por siRNA, n = 6).
- Use o fundo metade da placa da biblioteca de transfect um conjunto diferente de seis placas replicar referido como o "fundo Plate Set" (seis réplicas por siRNA, n = 6).
- Use o termo "Conjunto de prato cheio" para descrever as 12 placas de célula que tem sido transfected com biblioteca siRNA.
- Transfect poços B2-B6 de todas as placas na placa completo conjunto com siRNA piscina negativo depois de todos os conjuntos de chapa superior e inferior tem sido transfected com biblioteca siRNA.
- Também transfect poços B2-B6 de outra duas placas, que não recebem biblioteca siRNA e servirão como controles não expostos (um para o conjunto da placa superior) e outro para o conjunto de placa de fundo, com piscina negativo siRNA.
- Incube todas as placas de célula em uma incubadora de cultura de células 4 horas depois de todas as misturas de transfeccao foram adicionadas e a mistura de gentil tocando a cada hora.
- Uso um manipulador de líquido automático para lavar todos os poços das placas duas vezes com o medium HCORT diluído 1:5 em PBS. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
- Aspirar a 100 µ l de cada poço e descarte o que dentro de um reservatório de resíduos.
- Adicionar a cada bem 100 µ l/poço previamente aquecido médio HCORT diluído 1:5 PBS em que está contido em um reservatório diferente em um volume suficiente para o número de placas de.
- Repita as etapas 3.5.1 e 3.5.2 para cada placa.
- Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
- Encher o reservatório com média HCORT diluído 1:5 em PBS, conforme necessário.
- Aspirar a 100 µ l de cada poço e descartar que no reservatório de resíduos.
- Refeed todos os poços das placas com 100 µ l/poço HCORT medium, que está contido em um reservatório diferente em um volume suficiente de média para o número de placas.
- Encha novamente o reservatório com médio conforme necessário.
- Use poços C6-C2 de todas as placas como controles não-transfectadas.
- Mantenha poços B7-B11 e C11-C7 de todas as placas não-transfectadas para serem utilizados como controles de droga e o veículo para a exposição tóxica.
4. refeed as células o seguinte dia
- Use um manipulador de líquido automático para refeed todos os poços das placas. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
- Aspirar a 100 µ l de cada poço e descarte o que dentro de um reservatório de resíduos.
- Cada um refeed bem com 100 µ l/poço HCORT medium que está contido em um reservatório diferente e tem um volume suficiente de média para o número de placas para ser entrarão.
- Repita as etapas 4.1.1 e 4.1.2 conforme necessário para refeed todas as placas da célula.
- Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
- Encha novamente o reservatório com médio conforme necessário.
5. adição de controle positivo
- Dois dias depois do transfection e duas horas antes da exposição, preparar uma solução µM 62,5 do controlo positivo cardamonin médio HCORT ser usado para exposições do HFA e adicionar a linha B de um reservatório de 8-linha de diluição.
- Para a exposição de CP, preparar e usar uma solução de 25 µM de SKF 86002.
- Prepare um volume de controle positivo suficiente para o número de placas para ser testado.
- Preparar uma solução de 0.625% de DMSO em meio HCORT (controle de veículo) e adicione a linha C do mesmo reservatório.
- Para a exposição de CP, preparar e usar uma solução de 0,5% de DMSO.
- Prepare um volume de controle do veículo suficiente para o número de placas para ser testado.
- Uso o manipulador de líquido automático adicionar controles positivo e veículo para poços B7-B11 e C11-C7 de cada placa de células e usar um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços que receberão os controles positivo e veículo.
- Remover 10 µ l de meio de poços B7-B11 e C11-C7 de cada placa de células e descartá-lo em linhas G e H do reservatório 8-linha de diluição.
- 10 µ l dos controles positivo e veículo de transferência para esses poços e misture 3 vezes.
- Retorne estas placas de célula para a incubadora.
- Repita etapas 5.3 para 5.4 até ter recebido todas as placas da célula positivo e controles do veículo.
6. HF exposição de culturas de células
Cuidado: HFA é extremamente tóxico e corrosivo.
- Realizar todas as operações de exposição química em uma coifa química usando luvas de nitrilo duplo, um casaco de laboratório, protetores de manga de polietileno descartáveis e óculos de segurança.
- Adquira HFA como uma solução de 48%.
- Diluir o HFA para 1% com água ultrapura e armazenar em alíquotas de 5 mL em frascos de polietileno de parede grossa de 10 mL para melhorar a segurança.
- Descontaminar pontas de pipetas e reservatórios que tem contacto com HFA e qualquer sobra HFA líquido com gluconato de cálcio 2.5% antes do descarte no fluxo de resíduos perigosos.
- Para cada placa de biblioteca de siRNA sob investigação, preparar uma solução de médio de HFA 0.0036% adicionando 288 µ l de 1% HFA para 80 mL de meio de HCORT previamente aquecido em um frasco de 150 mL.
- Agite a garrafa e incubar a HFA diluído em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 10 min.
- Misture a solução média HFA novamente agitando o recipiente e adicione a solução média HFA para um reservatório de reagente em um prato quente.
- Realize a exposição com dois técnicos que trabalham em conjunto.
- Ter o técnico sobre o µ l aspirado certa de 100 de cada um dos poços de uma placa de células usando uma pipeta de 12 canais interiores e passar a placa para o técnico à esquerda.
- Já o técnico da esquerda Adicione 100 μl por poço da solução médio HFA.
- Repita as etapas 6.4.1 e 6.4.2 para todas as placas de células que são para ser exposto a toxicidade.
- Também, repita as etapas 6.4.1 e 6.4.2 para placas de controle não expostos, utilizando o meio HCORT fresco em vez da solução médio HFA.
- Colocar as placas na incubadora de capa das emanações químicas por 20 min e depois devolvê-las para a incubadora de cultura de células.
- Repita a etapa de adição de controlo positivo (etapas 5.1 a 5.5) como anteriormente mostrada uma vez que todas as placas foram expostas e retornadas para a incubadora de cultura de células.
7. CP exposição de culturas de células
Cuidado: CP aguda é tóxico e irritante.
- Realizar todas as operações de exposição química em uma coifa química usando luvas de nitrilo duplo, um casaco de laboratório, protetores de manga de polietileno descartáveis e óculos de segurança.
- Adquira o CP.
- Diluir o CP para 5% em DMSO e armazenar em alíquotas de 10 mL em frascos de 10 mL cintilação para melhorar a segurança.
- Descontaminar pontas de pipetas e reservatórios que tem contacto com CP e qualquer sobra líquido CP com bissulfito de sódio 2,5% antes do descarte no fluxo de resíduos perigosos.
- Prepare um volume suficiente de pré-aquecido médio HCORT contendo 1 x caneta/Strep e PBS pré-aquecido para o número de placas para ser exposto.
- Para cada conjunto de conjunto de placa de topo ou placa de fundo, adicionar 8.04 µ l de 5% CP em DMSO a uma alíquota de 50 mL de pré-aquecido médio HCORT e misture bem para uma concentração final de CP de 0,0008%. Tampar o tubo firmemente e incubar a solução em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 1h.
- Tempo a adição de CP para as alíquotas de 50 mL de meio para que cada um exposto superior placa definida e conjunto de placa de fundo recebe toxicant exatamente 1 h depois CP foi adicionado à alíquota de 50 mL de meio.
- Remover um conjunto de placa de topo e 1 controlo unexposed placa da incubadora de cultura celular e colocá-los na coifa química perto do final do período de incubação.
- Misturar a solução de CP por inversão do tubo e então decantá-lo para um reservatório de reagente no final do período de incubação de 1 h.
- Realize a exposição com dois técnicos que trabalham em conjunto.
- Ter o técnico sobre o µ l aspirado certa de 100 de cada um dos poços de uma placa de células usando uma pipeta de 12 canais interiores e passar a placa para o técnico à esquerda.
- Já o técnico da esquerda Adicione 100 μl por poço da solução CP médio.
- Repita as etapas 7.6.1 e 7.6.2 para todas as placas de células da placa Top Set para ser exposto a toxicidade.
- Também, repita as etapas 7.6.1 e 7.6.2 para placas de controle não expostos, utilizando o meio HCORT fresco em vez da solução de CP médio.
- Coloque as placas em uma incubadora de 37 ° C na coifa química por 10 min.
- Adicionar um volume suficiente de PBS e HCORT meio contendo 1 x caneta/Strep a reservatórios de reagente perto do final do período de incubação de 10 min.
- Retire a solução CP chapas de célula usando uma pipeta de 12 canais e substituí-lo com 100 µ l por alvéolo de PBS no final do período de incubação de 10 min.
- Imediatamente retire a PBS célula chapas e substituí-lo com 100 µ l por alvéolo de meio de HCORT contendo 1 x caneta/Strep.
- Também, repita as etapas de 7.9 e 7.10 para as placas de controle não expostos.
- Entregue as chapas de célula para uma incubadora de cultura de célula padrão.
- Repita as etapas de 7,3 para 7.12 para o conjunto da placa de fundo.
- Repita a etapa de adição de controlo positivo (etapas 5.1 a 5.5) como descrita anteriormente uma vez que todas as placas foram expostas e retornadas para a incubadora de cultura de células.
8. recolha e ensaio da viabilidade celular da amostra
- Vinte e quatro horas após a exposição, preparar uma solução de substrato MTT 0,5 mg/mL em PBS contendo 10 g/L de glicose e aquecer a 37 ° C21. Prepare-se 10 mL de substrato para cada placa ser analisada.
- Para o número de placas para ser analisada, adicione um volume suficiente de solução de substrato MTT para um reservatório em um manipulador de líquido automático.
- Uso o manipulador de líquido automático para coletar a amostra e Adicionar substrato MTT usando um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas. Pré-configure caixas de ponta para atender apenas os poços para ser analisada.
- Médio de aspirado 95 µ l dos interna 60 poços da placa de células e depósito 42,5 µ l em cada uma das duas placas de armazenamento 384-bem.
- Imediatamente adicionar 100 µ l por poço da solução de substrato de MTT para as placas da célula e incube-os a 37 ° C numa incubadora de cultura celular para 1,5 h.
- Encha novamente o reservatório com solução de substrato MTT conforme necessário.
- Incube as placas de célula a 37 ° C numa incubadora de cultura celular por 1h.
- Selar as placas de armazenamento 384-bem e armazená-los a-80 ° C para posterior análise.
- Repita as etapas de 8,3 a 8,5 para todos os conjuntos de chapa superior e inferior e o associado controles não exposto.
- Se desejar, mas lavá-los ao adicionar solução de substrato MTT e quando alternar entre placa define, reutilize dicas entre repetições.
- Após a incubação de 1 h, adicione um volume suficiente de DMSO para um reservatório em um manipulador de líquido automático.
- Uso o manipulador de líquido automático adicionar DMSO e usar um 50 µ l/s pipetagem velocidade para todas as etapas.
- Aspirar a 100 µ l de cada um dos poços das placas célula internos e descartar a solução de substrato MTT em um reservatório de resíduos.
- Esvazie o reservatório de resíduos conforme necessário.
- Sobreposição de cada poço com 100 µ l de DMSO.
- Encha novamente o reservatório de DMSO conforme necessário.
- Aspirar a 100 µ l de cada um dos poços das placas célula internos e descartar a solução de substrato MTT em um reservatório de resíduos.
- Agite as placas num agitador de placa por 3 min.
- Medir a absorvância a 570 e 690 nm utilizando um Espectrofotômetro de placa.
- Subtrair o fundo e calcular a viabilidade celular % dividindo os valores de absorvância expostas pelos controles não expostos. Use o controle de siRNA de média unexposed piscina negativo para calcular a viabilidade de celular % para todos os destinos.
9. medida de IL-8 concentração em sobrenadantes de cultura celular
- Medida a concentração de IL-8 nos sobrenadantes de cultura de células usando um não lavar ensaio baseado em grânulo de acordo com instruções22 as indicações do fabricante. Crie um layout de placa de ensaio para acomodar amostras e curva padrão.
- Retire as placas de 384 poços de armazenamento do freezer-80 ° C, descongelar à temperatura ambiente e brevemente, Centrifugar as placas para coletar a amostra no fundo dos poços.
- Para o número de placas de ensaio a ser executado, faça um volume suficiente de grânulos aceitador anti-IL-8 e biotinilado anti-IL-8 em buffer de ensaio incluído no kit. Use a proporção de 50 µ l de grânulos de aceitador de anti-IL8 e 50 µ l de biotinilado anti-IL8 para 9,9 mL de tampão de ensaio.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione a mistura do grânulo/anticorpo para uma placa de armazenamento de 384-bem preto.
- Adicione o aceitador do grânulo/anticorpo aos poços para o uso de amostras e a curva de calibração de acordo com o layout de placa de ensaio.
- Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione a mistura do grânulo/anticorpo para uma placa de armazenamento de 384-bem preto.
- Reconstituir a IL-8 padrão de 1000 pg/mL, utilizando o meio de cultura celular contendo 354 µM NaCl. Fazer um volume suficiente para o número de placas de ensaio a ser executado.
- Fazer oito diluições seriais da curva padrão.
- Adicione a curva padrão em triplicado aos poços de uma placa de armazenamento de 384-bem preto de acordo com o layout de placa de ensaio adequados. Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
- Da mesma forma, adicionar o meio de cultura celular contendo 354 µM NaCl com nenhum IL-8 para medição de fundo.
- Use um manipulador de líquido automático para realizar o ensaio. Use caixas de ponta pré-configurado para abordar apenas os poços designados pelo layout de placa de ensaio. Use um 50 µ l/s velocidade de pipetagem para todas as etapas.
- Transferência 8 µ l da mistura do grânulo-anticorpo aceitador aos poços das placas 384-poço raso ensaio bem branco.
- Adicione somente nos poços designados para amostras e curva padrão de acordo com o layout de placa de ensaio.
- Transferi 2 µ l da curva padrão para os poços apropriados das placas de acordo com o layout de placa de ensaio ensaio bem superficial.
- Preparar uma solução de NaCl de 3,54 M e adicionar um volume suficiente para o número de placas para ser analisada para um reservatório superficial no manipulador de líquido automático.
- Ajuste a concentração de sal das amostras para coincidir com a curva padrão ao transferir 4,5 µ l da solução de NaCl para as amostras nas placas de armazenamento de 384-poço preto.
- Misturar as amostras três vezes usando um volume de 30 µ l de misturando, e transferência 2 µ l das amostras para o branco raso bem do ensaio de placas de acordo com o layout de placa de ensaio.
- Trocar dicas entre as placas de amostra.
- Incube durante 1 h no escuro à temperatura ambiente.
- Para o número de placas de ensaio a ser executado, faça um volume suficiente de grânulos aceitador no buffer de ensaio. Use a proporção de 200 µ l de grânulos secundários aceitador para 12,3 mL de tampão de ensaio.
- Usando uma pipeta multicanal, adicione contas secundárias para uma placa de armazenamento de 384-bem preto.
- Adicione contas secundárias aos poços para o uso de amostras e a curva de calibração de acordo com o layout de placa de ensaio.
- Adicione um volume suficiente por alvéolo para o número de placas de ensaio a ser executado.
- Usando o manipulador de líquido automático, transferi 10 µ l dos grânulos secundários aos poços das placas brancas 384-poço raso ensaio bem.
- Adicionar somente nos poços que recebeu amostras e curva padrão de acordo com o layout de placa de ensaio e lavar as pontas entre cada prato.
- Incube durante mais uma hora no escuro à temperatura ambiente.
- Transferência 8 µ l da mistura do grânulo-anticorpo aceitador aos poços das placas 384-poço raso ensaio bem branco.
- Sele o ensaio de placas com limpar selos de chapa e digitalizar usando um leitor de placa compatível com o ensaio. Use 0,2 mm distância entre placa e detector, tempo de excitação de 180 ms e tempo de medição de 550 ms para a verificação.
- Importe os dados brutos de ensaios os IL-8 em uma planilha.
- Use curva automatizada de encaixe para a curva padrão dos ensaios IL-8 e em seguida, converter os dados brutos para pg/mL para cada amostra.
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Representative Results
Desenvolvimento do método de exposição
Nós refinado e avaliamos a adequação da linha de células epiteliais da córnea humana SV40-HCEC para uso em estudos HTS. SV40-HCEC foram imortalizados usando o antígeno de T grande SV-40 e foi um presente do amigo Dhanajay23. Havia muitas variáveis exploradas no desenvolvimento de metodologia de exposição para apresentar de forma concisa neste documento, e então, somente alguns exemplos de resultados, que acreditamos que podem ser mais amplamente aplicáveis para várias substâncias tóxicas são apresentadas.
Exposição tóxica por Spike ou câmbio médio
Nós inicialmente procurou expor as células por cravação 5 µ l de uma concentração de trabalho do toxicant diluído em água, solução salina ou médio em 95 µ l do meio já está presente em cada poço de células em uma placa de 96 poços para obter a concentração final de exposição desejada. SV40-HCEC foram expostos usando este pico de expor/refeed metodologia para 1 X LD50 de HFA para 24 h (1 X LD50 = 0.02% HFA por esse método quando o pico HFA foi diluído no meio), e poços foram entrarão com fresco médio 10 min mais tarde. Após 24 h, as células foram sobrepostas com substrato MTT conforme descrito acima para o ensaio da viabilidade celular. Imagens foram capturadas por microfotografia antes da solubilização dos cristais formazan com DMSO. Um exame atento dos poços mostrou que um elevado grau de morte celular era localizado em um ponto, e isto é apesar do fato de que a placa foi sacudida por 15 s imediatamente após o pico foi adicionado para o prato inteiro (Figura 1a). Este fenômeno foi observado quando o espigão foi adicionado à parte inferior do bem ou quando adicionado no menisco. Uma imagem de ampliação mais elevada desta área usando programas de contraste de fase que as células ainda estão presentes na área de inocente por MTT (Figura 1b). Nós também testamos um câmbio médio expor/refeed metodologia onde médio foi removido dos poços, substituído com meio de cultura celular contendo 1 X LD50 de HFA (1 X LD50 = 0,035% HFA por esse método) e poços foram entrarão com fresco médio 10 min mais tarde. Após 24 h, as células foram sobrepostas com substrato MTT conforme descrito acima. Esse método alcançado uma aparentemente mais nem morte resposta celular de células dentro de cada poço (Figura 1C e 1D). Controles não expostos são fornecidas para referência e não mostram nenhuma área localizada de morte celular (Figura 1e e 1f). Para exposições de CP, o método de pico não resultou em um grande grau de morte celular, localizada em um ponto dentro de cada poço; no entanto, a resposta de morte celular era mais consistente de uma iteração para outra usando o método de exposição de câmbio médio (dados não mostrados).
Figura 1 : Célula morte induzida por spike e métodos de exposição de câmbio médio. Todas as imagens foram capturada 1,5 h depois da adição do substrato MTT. Painel (a) é uma imagem de campo brilhante de SV40-HCEC exposto ao HFA spike expor/refeed metodologia. Painel (b) é uma maior ampliação do mesmo poço no painel (a) usando o contraste de fase. Painel (c) é uma imagem de campo brilhante de SV40-HCEC exposto pelo câmbio médio expor/refeed metodologia. (D) o painel é uma maior ampliação do mesmo poço no painel (c) usando o contraste de fase. Painéis (e) e (f) são de um campo bem unexposed, brilhante e fase contraste maior ampliação, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Estabilidade tóxica no meio
Observou-se que, uma vez diluído em média, a citotoxicidade aparente do HF e CP muda e depois estabiliza. HFA foi diluída em meio a 0.0036% e permissão para incubar a 37 ° C, durante 1-60 min antes de expor o SV40-HCECs, conforme descrito acima. Para HFA, a citotoxicidade aumenta dentro o primeiro 5 min que HFA dilui-se no meio e é então estável pelo menos uma hora (Figura 2a). Uma maneira ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett mostrou a viabilidade de celular % em todos os pontos de tempo foram significativamente diferentes do ponto de tempo de 1 min. Não houve nenhuma diferença significativa entre o 2.5-60 min tempo pontos. CP é orgânico e primeiro é diluído a 5% em DMSO. Em seguida, foi diluído em meio a 0,0008% e permitido para incubar a 37 ° C, durante 5-120 min antes de expor o SV40-HCECs, conforme descrito acima. Uma vez diluído em média, a citotoxicidade de CP diminui mais de 60 min e depois estabiliza para pelo menos o próximo h (Figura 2b). Uma maneira ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett mostrou a viabilidade de celular % em todos os pontos de tempo foram significativamente diferentes do ponto de tempo de 5 min. Lá não houve diferenças significativas entre o 60 a 120 min tempo pontos.
Figura 2 : Perda tóxica de citotoxicidade nas diluições médias. Os dados são expressos como a média da porcentagem de viabilidade ± SD (n = 6). Painel (a) mostra a estabilidade da citotoxicidade HFA 0.0036% quando diluído em médio e incubadas a temperatura ambiente por 1-60 min antes de expor o SV40-HCECs, conforme descrito acima. Painel (b) mostra a estabilidade da citotoxicidade de CP 0,0008% quando diluído em médio e permissão para incubar a 37 ° C, durante 5-120 min antes de expor o SV40-HCECs, conforme descrito acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Exposição/Refeed ou expor apenas
Outro fator investigado na metodologia de exposição foi se deve: A) toxicidade para adicionar por 10 min, lavagem, refeed, retire a coifa químicos, placas e incubar 24h em uma incubadora de cultura de célula padrão (método de expor/refeed); ou B) adicionar toxicant, deixá-lo ligado, retire a coifa química placas e incubar 24 h em uma incubadora de cultura de célula padrão (método de expor somente). Segurança é um fator importante que não seja admissível para remover placas das células que contêm toxicant diluído da coifa química porque a toxicidade vai gás de escape e expor o pessoal. Uma consideração relacionada é o número de placas para ser exposto em um determinado momento desde as placas mais existem, haverá um maior volume fora-gasificação. Em nossos métodos HTS, expomos as placas de 48 x 96 poços em um dia determinado estudo. Temos colocado placas de cultura de células expostas em um saco selado e usado tubos de detector de gás colorimétrico para avaliar CP e HF fora-gasificação de placas expostas. Nós achamos que expondo 48 placas de 1 x LD50 de HFA não resultou em qualquer detectáveis HF fora-gasificação (dados não mostrados). Para exposições de CP, achamos que não havia suficiente CP fora-gasificação de 48 pratos expostos a 1 x LD50 de apresentar pelo menos alguma preocupação de segurança (dados não mostrados). Exposição/refeed e expor apenas os métodos foram avaliados para exposições do HFA. Células de SV40-HCEC foram expostas ao HFA e viabilidade foi avaliada pelo ensaio de MTT 24 h após a exposição. Dose resposta iterações foram realizadas em dias diferentes. Em comparação com o método de expor/refeed (Figura 3a), achamos que o único método de expor produziu resultados de ensaio de viabilidade de células mais consistentes (Figura 3b). Portanto, esse método foi selecionado como parte da metodologia de exposição final. Para CP, quaisquer diferenças na consistência dos resultados de ensaio de viabilidade celular entre as duas metodologias diferentes de exposição não poderiam ser avaliadas desde as preocupações de segurança impediam de retirar as placas do CP exposto a coifa química para a incubação de 24 h em um incubadora de cultura de célula padrão.
Figura 3 : Consistência de exposição com expor/refeed e expor apenas os métodos. Os dados são expressos como a média da porcentagem de viabilidade ± SD (n = 6). (a) HFA foi diluído em meio, incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos e então usado para expor as células pelo método de expor/refeed. (b) HFA foi diluído em meio, incubado à temperatura ambiente por 10 min e usado para expor SV40-HCEC pelo único método de expor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Refinamento do modelo de célula
Constituintes médios
Nós cumpridas as condições de cultura estabelecidas pelos investigadores originários para a passagem e manutenção destas linhas de célula; no entanto, nós modificamos-los para as células em experimentação. O meio de cultura celular prescrito pelos investigadores originários das células SV40-HCEC não inclui hidrocortisona, mas utilizamos um baixo nível de hidrocortisona (0,5 µ g/mL) durante os estudos de exposição para suprimir o pico ocasional na produção de citocinas visto em ingênuo SV40-HCEC (dados não mostrados) que prejudicada a análise de dados de uma iteração ao seguinte durante os estudos de refinamento.
Estabilidade fenotípica
Durante nossos estudos de refinamento de modelo de célula, descobrimos que o SV40-HCEC começam a ter diminuído a produção de citocinas em resposta à exposição tóxica, começando em torno do número de passagem 60 (dados não mostrados). Por esta razão, nós mantido cryostocks de células de baixa passagem, executado todos os estudos utilizando células sob número de passagem 60 e monitorado a produção de citocinas durante o processo de seleção.
Layout da placa
Uma fonte importante de variabilidade experimental em estudos de alta taxa de transferência é efeitos de borda das placas multi bem. Descobrimos que as respostas de citocinas de células em poços de borda não eram consistentes com, ou equivalente, poços interiores em ambos HFA e CP estudos (dados não mostrados). Polonês mediana dos dados, um exercício estatístico utilizado para minimizar os efeitos de borda sobre um conjunto de dados, suficientemente não resolver o problema (dados não mostrados). Portanto, não há poços de borda de placa de células foram utilizados para experimentação ou controles (Figura 4).
Figura 4 : Biblioteca e placa de células layouts. As áreas sombreadas cinzas no Layout de placa de biblioteca representam poços que contêm siRNA. Os poços de brancos estão vazios. Os 40 alvos de linhas A-D da placa da biblioteca são usados no "Top Plate Set", e os 40 alvos das linhas E-H da placa da biblioteca são usados no "Fundo Plate Set". B2-B6 de poços são utilizados para controles de siRNA piscina negativo. Poços C2-C6 são não-transfectadas. B7-B11 de poços são usados para cardamonin ou drogas de controle positivo 86002 SKF como descrito, e poços C7-C11 são utilizados para o controle do veículo DMSO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Na validação do modelo de Vitro para HTS
Nós usamos Z' fator de análise para determinar a adequação do SV40-HCEC para uso em estudos HTS como este teste estatístico é usado para determinar a qualidade do ensaio para HTS24. Para HF Z' fator de análise, as células foram semeadas em 1,25 x 103 células/poço, transfected com siRNA piscina negativa (como descrito acima) 24 h após a semeadura e exposta 48 h após a transfeccao 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. Para CP Z' fator de análise, as células foram semeadas transfectadas como descrito acima e expostos a 48 h após a transfeccao de 0,0008% CP (1x LD50), n = 5. Um maior n foi utilizado para os estudos de CP devido a maior variabilidade neste modelo de exposição. Z' fator foi calculada para dados de células não expostos vs expostos e piscina negativo siRNA transfectadas não impressionados vs expostos células IL-8 expressão para CP e HFA exposições. Analisamos também as células não transfectadas para determinar se houve um efeito na qualidade de ensaio devido a transfeccao siRNA. Muitas iterações de estudos de validação foram realizadas durante a refinação de condições de exposição e cultura em um esforço para maximizar o Z' fator resultados. SV40-HCEC passou na validação e maioria das iterações tinham Z' fator valores maiores que 0,50 para exposições de HF (tabela 1) e de exposições de CP (tabela 2). Cada replicar nessas tabelas era de células chapeadas em dias diferentes.
| Grupos de exposição | Z'-análise do fator | ||
| Rep. #1 | Rep. #2 | Rep. #3 | |
| HF-expostos controlo negativo vs controle negativo não exposto | 0,68 | 0,5 | 0,56 |
| HF-expostos vs ingênuo | 0.4 | 0,68 | 0,56 |
Tabela 1: SV40-HCEC HFA exposição Z' fator análise de IL-8
| Grupos de exposição | Z'-análise do fator | ||
| Rep. #1 | Rep. #2 | Rep. #3 | |
| CP-expostos controlo negativo vs controle negativo não exposto | 0.6 | 0.18 | 0.46 |
| CP-expostos vs ingênuo | 0.42 | 0,29 | 0.42 |
Tabela 2: SV40-HCEC CP exposição Z' fator análise de IL-8
SiRNA primário triagem resultados de HFA ferido células
Estudos de otimização de transfeccao foram realizados antes da triagem e siRNA direcionamento ciclofilina b foi usado para estes estudos. Um ensaio de deteção em situ RNA foi usado para medir os níveis de RNAm de b ciclofilina e um analisador de conteúdo alto foi usado para quantificar os resultados. Atingimos quase 90 por cento knockdown de b ciclofilina e normalmente não mais do que 5-10% de perda de célula com 4 pmol de siRNA/poço e reagente de transfeccao µ l/poço de 0,3 (dados não mostrados). Quantidades mais elevadas de siRNA realmente resultaram na derrubada de b mais pobre ciclofilina (dados não mostrados). Níveis semelhantes de nocaute foram alcançados com 1,2 pmol/poço de siRNA e 0.09 reagente de transfeccao µ l/poço, mas eleito para usar 4 pmol por alvéolo para abordar todos os alvos que possam exigir uma quantidade maior de siRNA para conseguir o nocaute eficaz. "Knockdown" cinética alvo também foram avaliados, e observou que aquele knockdown alvo foi máxima por transfecção depois de dois dias (dados não mostrados). Alvo knockdown consistência em toda a placa também foi validados (dados não mostrados). O cardamonin de drogas anti-inflammatory e SKF 86002 são utilizados como controles positivos para a inibição da produção de citocinas para exposição HFA e CP, respectivamente. Estes foram selecionados por meio de testes de uma variedade de compostos com propriedades anti-inflamatórias conhecidos nas células expostas. A dose utilizada em estudos de triagem foi selecionada pelos estudos de otimização de resposta de dose.
O alto throughput siRNA triagem estratégia que utilizamos é o padrão do setor e envolve três etapas principais: seleção 1) primária, deconvolução 2) biblioteca e validação 3) alvo. No rastreio primário, o fenótipo de cada destino é avaliado utilizando uma mistura de siRNA diferentes sequências como um reagente único para cada gene-alvo. Alvos são então selecionados para baixo a deconvolução da biblioteca. Nesta etapa, cada uma das sequências de siRNA diferentes que são agrupadas para direcionar cada gene no rastreio primário são testados separadamente. Alvos são submetidos a outra para baixo-seleção para validação de destino em que o fenótipo de destino é confirmado com drogas, restauração de fenótipo, e/ou siRNA de outro fornecedor. Para nossa tela principal, eleito para executar uma tela subgenômica focada em vez de uma tela ampla de genoma por razões de economia. Dados de Microarray do HF e CP ferido córneas de rato e engenhosidade Pathway Analysis (IPA) foram usados para concentrar a nossa biblioteca de destino para a tela principal (manuscritos em preparação). Brevemente, córneas do mouse foram expostas ao vapor tóxica utilizando um copo de vapor semelhante a métodos anteriormente descritos25. Controles e botões de córnea expostas foram colhidas no tempo vários pontos pós exposição. RNA foi isolado, e a qualidade e a quantidade de RNA monitorados. Todos os experimentos de microarray foram realizados de acordo com protocolo26 do fabricante. Intensidades de sinal bruto foram normalizadas e analisadas pela análise de componentes principais (PCA) para determinar as fontes significativas de variabilidade nos dados. Os genes foram rank ordenado por significância estatística. Os dados foram minados e comparados com listas de gene de bibliotecas de siRNA pré-configurados. Estas listas de gene, selecionamos 3120 alvos para a seleção. A biblioteca de siRNA foi exibida em células SV40-HCEC (consulte a Figura 5 para um gráfico de fluxo do protocolo HTS para a tela principal). Avaliações de ponto de extremidade incluíam os níveis de IL-8 em meio de cultura celular por não-lavagem do grânulo-baseado do ensaio e viabilidade celular por ensaio de MTT. As células foram expostas a 0.0036%HFA, conforme descrito anteriormente, que é de aproximadamente 1 x LD50. Viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de MTT 24 h após a exposição. O efeito de cada pool de siRNA na viabilidade celular foi analisado para significância estatística em relação à média de piscina negativos expostos por cada placa usando diferença média padronizada estritamente (SSMD)27. Uma trama de dual-lanterna da SSMD e célula viabilidade dobra-mudança é mostrada na Figura 6. Os limiares de seleção sucesso escolhidos para destinos que exacerbaram a morte celular ou melhoraram viabilidade celular foram SSMD ≤-1.28 e ≥ SSMD 1.28, respectivamente.
Figura 5 : Fluxograma de protocolo primário tela HTS. Este gráfico mostra as etapas essenciais que são executadas em cada dia para o protocolo HTS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Dual-lanterna enredo do siRNA efeito sobre as células de SV40-HCEC Cell Viability of HFA-Exposed. Resultados mostrados para cada destino são a média de seis repetições (n = 6). Dados de viabilidade celular são expressos como uma dobra-mudança em relação a piscina negativos expostos controle siRNA e significância estatística foi analisada pelo SSMD. Metas que tinham um SSMD ≤-1.28 ou ≥ 1.28 foram selecionadas como sucessos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O efeito de cada pool de siRNA na produção de IL-8 induzida pelo HFA foi analisado para significância estatística em relação à média de piscina negativos expostos por cada placa. IL-8 em sobrenadante de cultura celular foi avaliado ensaio 24 h após a exposição. Uma trama de dual-lanterna da dobra-mudança SSMD e IL-8 é mostrada na Figura 7. Os limiares de seleção sucesso escolhidos para destinos que diminuíram a produção de IL-8 foram uma diminuição de 40% e ≤ SSMD -1,0. Os limiares de seleção sucesso escolhidos para que o aumento da produção de IL-8 alvos foram um aumento de cinco vezes e SSMD > 1.28.
Figura 7 : Dual-lanterna trama do siRNA efeito na produção de IL-8 pelas células de SV40-HCEC HFA-Exposed. Resultados mostrados são a média de seis repetições (n = 6). Dados de níveis de expressão de IL-8 são expressos como uma dobra-mudança em relação a piscina negativos expostos siRNA e significância estatística foi analisada pelo SSMD. Sucessos foram definidos como alvos que tinham um 40% diminuição de níveis de IL-8 e ≤ SSMD -1,0 ou um aumento de cinco vezes nos níveis de IL-8 e SSMD > 1.28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste documento descrevemos nossos métodos e resultados no desenvolvimento de uma célula epitelial de alto throughput córnea triagem modelo para o estudo das lesões HF e CP. Também apresentamos os resultados a partir da tela de siRNA primário para lesão de HF. Havia muitos desafios para o desenvolvimento de modelos HTS para o estudo das lesões TIC. Métodos que encontramos na literatura relacionada ao estudo de HF, HFA ou CP em modelos de cultura de células foram de pouca ajuda. A maioria dos estudos em vitro no íon fluoreto envolvem células orais e utilizaram o fluoreto de sódio e não HF ou HFA (para alguns exemplos, veja28,29). Uma metodologia sobre a em vitro exposição de células epiteliais brônquicas ao CP foi publicada por Pesonen et al 30. em última análise, encontramos sem métodos específicos na literatura relacionada com o estudo HTS de HF, HFA ou CP e a grande maioria dos desafios e variáveis relacionadas ao estudo dessas substâncias tóxicas em desenvolvimento HTS exigido. Foi dada especial atenção para alcançar o alto grau de consistência da exposição através do tempo e numerosas placas de triagem necessárias para um estudo bem sucedido de HTS.
Um tipo de desafio encontrado foi relacionado com a aplicação do toxicant para sistemas de cultura de células. Algumas substâncias tóxicas são reativas com ou instáveis em soluções aquosas. Os tóxicos que selecionamos para estudo não são considerados como tendo esses problemas de instabilidade. Um estudo agrícola investiga photohydrolysis de CP mostrou que uma solução 0,001 M de CP na água tinha uma meia-vida de 31,1 h quando expostos a uma fonte de luz de xenônio de 1100 lux (intensidade da luz do sol de um dia nublado) para 10 dias, 12h por dia31. Não havia nenhuma hidrólise mensurável durante o mesmo período de 10 dias, quando a solução foi armazenada no escuro. O íon fluoreto e proton da HFA são claramente estável na água. No entanto, existem considerações adicionais de estabilidade em matéria tóxicas diluições em meio de cultura celular. Achamos que houve uma mudança inicial de citotoxicidade em algum grau, quando as substâncias tóxicas primeiro foram diluídas em meio de cultura celular que então se estabiliza após um breve período de tempo. Acreditamos que este é devido à ligação tóxica ou complexantes com eleitores no meio. Meio celular contém cálcio, magnésio, proteína, etc ., que são conhecidos para interagir com o íon de fluoreto32,33. CP é conhecido por ter reações oxidativas com tióis biológicas, mas também pode vincular o DNA, proteínas e outros nucleófilos34,35. Uma vez que estas reações e interações tem concluído ou alcançado o equilíbrio, a quantidade do toxicant disponível estabiliza e assim estabiliza a citotoxicidade aparente. Inicialmente exploramos o uso de soro fisiológico e água diluições de substâncias tóxicas para as ações de trabalho usado para exposições para evitar interações tóxicas com constituintes médios nas diluições de trabalho. O uso de solução salina também preservaria o componente ácido da lesão HFA para exposições realizadas pelo câmbio médio. Descobrimos que as respostas de morte celular de substâncias tóxicas na água e solução Salinas diluições eram mais variável do que o método usado diluições de meio de cultura celular com câmbio médio (dados não mostrados). Em relação ao método de exposição de espiga com HFA, a variabilidade pode ser devido a inconsistência em dispersão no bem levando a alvos celulares, competindo com os eleitores médios para o íon fluoreto disponível a espiga. As razões para a variabilidade em exposições HFA pelo câmbio médio com diluições Salinas HFA não são inteiramente claras. Em qualquer caso, métodos de exposição usando diluições do soro para HFA foram abandonados e não explorados para CP. A toxicidade de nossas diluições HFA médio provavelmente estreitamente imita estudos usando fluoreto de sódio, porque o meio celular amortecedores o próton livre em nossas diluições do HFA.
Outros desafios que nós encontramos foram relacionados ao refinamento dos modelos de cultura celular para uso em HTS Achamos necessário modificar os constituintes do meio de cultura celular de células na experimentação, especificamente, hidrocortisona e antibióticos. Utilizamos um baixo nível de hidrocortisona (0,5 µ g/mL) durante os estudos de exposição para suprimir o pico ocasional na produção de citocinas, visto em ingênuo SV40-HCEC. Esta baixa quantidade de hidrocortisona não afetou negativamente as respostas das células à toxicidade e estava abaixo dos níveis normalmente usados para suprimir a produção de citocinas por células cultivadas em resposta a estimulante36,37. As razões exatas porque células ingênuo SV40-HCEC ocasionalmente produzem citocinas em excesso não são conhecidas, mas é possível que as células são variavelmente sensíveis para os menores estressores que ocorrem durante a passagem e o chapeamento de célula. Muitos laboratórios incluem rotineiramente antibióticos em meio de manutenção de cultura celular, mas alguns antibióticos, tetraciclinas em particular, demonstraram que apresentam efeitos anti-inflamatórios em pilhas cultivadas, incluindo células epiteliais da córnea38. Em geral, nosso laboratório evita o uso de antibióticos, sempre que possível, desde que estas potencialmente podem confundir estudos. Também investigamos a fenotípica deriva ao longo de várias passagens de nossas células em cultura. É comum as células imortalizadas submeter-se a deriva genética e/ou fenotípica ao longo de várias passagens, se não mantida na fase exponencial, se pode chegar a confluência, ou se exposto a certos estressores ambientais39,40 ,,41. Portanto, é crítico durante uma tela de alta taxa de transferência que linhas celulares são mantidas adequadamente e que a tela é concluída usando o número de passagem de células que mantêm a conhecida resposta fenotípica. Efeitos de borda de placa multi bem é o fenômeno que células cultivadas em poços de perímetro exterior das placas multi bem muitas vezes não responder a mesma ou com a mesma consistência como células cultivadas em interior poços42. Há exercícios estatísticos, tais como mediana polonês, que podem ser utilizados para minimizar os efeitos de borda sobre um conjunto de dados43. No entanto, não há nenhum exercício estatístico que pode eliminar o efeito de borda em um destino específico ou controle se ele sempre é testado em um poço de borda e variar o layout da placa entre Replica para mover alvos ou controles fora de poços de borda não é logisticamente prático ou custo efetivo. É nossa opinião que a decisão de incluir o uso de poços de borda em ensaios cell-based do HTS deve ser feita com cautela. Achamos necessário para eliminar o uso de células cultivadas em poços de borda para controles e metas.
Nossa metodologia HTS de modelo e exposição de célula em vitro prejuízo HF foi usada para completar com sucesso a tela principal siRNA de 3120 alvos. SSMD foi usado para a seleção de sucesso porque foi proposto especificamente para medir a magnitude da diferença entre um controle e um siRNA27. Nossos resultados para viabilidade celular mostram que houve uma relação linear na trama dual-lanterna entre SSMD e dobra-mudança para praticamente todos os destinos. Por este motivo, usamos o critério único do SSMD para a seleção de sucesso para esse ponto de extremidade. Os IL-8 dados diferem em que alguns alvos tinham efeitos fracos mas consistentes, enquanto outros mostraram efeitos fortes mas inconsistentes. Portanto, usamos tanto dobra-mudança e SSMD os critérios de seleção de sucesso para esse ponto de extremidade. Os valores do SSMD usado para a seleção de sucesso para ambas as viabilidade celular e IL-8 dados foram escolhidos porque cortes entre 1 e 1.645 (ou -1 e-1.65) atingir descoberta falsa baixa e taxas de não-descoberta44. Havia algumas metas que foram sucessos na viabilidade celular e dados de IL-8. Nesses casos, foi dada preferência para inclusão na biblioteca de deconvolução para esses destinos que exerceram seus efeitos na mesma direção de melhoria da saúde global (viabilidade melhorada e diminuição da IL-8) ou agravar lesões (aumento da morte celular e aumento IL-8). No geral, nós selecionamos um total de 250 alvos entre a viabilidade celular e IL-8 pontos de extremidade que compõem a biblioteca de deconvolução para lesão de HF. A tela principal para lesão em vitro CP está em andamento.
Em resumo, nós desenvolvemos condições de exposição e cultura apropriadas para o estudo HTS de lesão ocular por HF e CP. Diversas variáveis nas condições de exposição e cultura foram refinadas e otimizadas, e os modelos foram validados para ser apropriado para estudos HTS por Z' fator de análise. Temos mais provas a utilidade destes modelos preenchendo a tela principal de uma biblioteca de siRNA no modelo HF. Existem muitas lesões e doenças que são não ou interesse limitado ao farmacêutico ou indústria de biotecnologia, lesão tóxica por CP e HF incluído e o advento da robótica de bancada facilita o estudo HTS de lesões e doenças em praticamente qualquer laboratório . Dados genomic alto throughput, moda pode contribuir muito para a compreensão dos papéis que genes específicos jogar em lesão ou doença que pode ajudar de forma mais eficiente de foco seguem em estudos em vitro , ou na vivo .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
DISCLAIMER: as opiniões expressadas neste artigo são dos autores e não refletem a política oficial do departamento do exército, departamento de defesa ou o governo dos EUA. Esta pesquisa foi apoiada por um acordo interinstitucional entre NIAID/NIH e o USAMRICD e em parte por uma entrevista para o programa de participação de pesquisa pós-graduação em defesa dos Estados Unidos exército médico pesquisa Instituto de química administrada pelo carvalho Cume Instituto de ciência e educação através de um acordo interinstitucional entre o departamento de energia dos EUA e USAMRMC.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo nacional institutos de saúde neutralizar programa interagências acordo # AOD13015-001. Gostaríamos de agradecer a Stephanie Froberg e Peter Hurst esforços e expertise na produção de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
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