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Biology

Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Abstract

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos son generalmente apoyo como no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. En los esfuerzos para el desarrollo de tratamientos y terapias para cuidar de la exposición, puede ser importante comprender los mecanismos moleculares y celulares de estas lesiones. Proponemos que utilización de la detección de RNA (siRNA) inhibitorio pequeño alto rendimiento puede ser una importante herramienta que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. siRNA son doble trenzadas moléculas de ARN que son 19-25 nucleotides largos y utilizan el vía para degradar el mRNA de silenciamiento del gen postranscripcional que tienen homología con el siRNA. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. El desarrollo y validación de modelos de exposición en vitro y métodos para el alto rendimiento (HTS) de detección de fluoruro de hidrógeno (HF) y cloropicrina-(CP) inducida por lesión ocular se presentan en este artículo. Aunque hemos seleccionado estas dos sustancias tóxicas, nuestros métodos son aplicables al estudio de otras sustancias tóxicas, con pequeñas modificaciones en el protocolo de la exposición de sustancias tóxicas. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y la producción de IL-8 fueron seleccionados como puntos finales en el protocolo de investigación. Varios problemas asociaron con el desarrollo de la exposición de sustancias tóxicas y se presentan métodos de cultivo celular adecuados para estudios HTS. El establecimiento de modelos HTS para estas sustancias tóxicas permite estudios adicionales entender mejor el mecanismo de lesión y pantalla para terapéutica potencial para lesión ocular química.

Introduction

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Desafortunadamente, tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos sólo son generalmente apoyo no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. La estrategia actual de tratamiento es inespecífica e incluye principalmente los tratamientos terapéuticos tópicos tales como lubricantes, antibióticos, y ciclopléjicos seguida de antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides) una vez la córnea ha re-epithelialized1 ,2. A pesar del mejor tratamiento terapéutico opciones actuales disponibles, pronóstico a largo plazo es generalmente pobre debido a la opacificación corneal progresiva y neovascularización2,3.

Modelos animales se han utilizado tradicionalmente para investigar la toxicidad química y entender los mecanismos de lesión. Sin embargo, los estudios en animales son lentos y caros. También hay esfuerzos para reducir los ensayos con animales. Por ejemplo, la legislación REACH (CE 1907/2006) en la Unión Europea tiene disposiciones destinadas a reducir los ensayos con animales. Las disposiciones incluyen un requisito que las empresas comparten datos con el fin de evitar pruebas animales y obtener la aprobación de la Agencia Europea de sustancias químicas antes de realizar pruebas propuestas en animales. Bajo las disposiciones de REACH, la experimentación con animales deben ser un último recurso. También es el Reglamento Europeo de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminando la prueba de cosméticos en animales. Cuando se llevan a cabo estudios en animales, son guiados por los principios de las 3Rs (refinamiento, reducción y sustitución), que proporcionan un marco para la investigación animal más humano, reduciendo el número de animales utilizados y uso de alternativas sin animales siempre que sea posible. Por estas razones, el campo de la toxicología ha intentado adoptar en vitro ensayos que permiten comprender mejor los mecanismos moleculares de toxicidad y pueden hacerse en el más alto rendimiento4. Se trata de un enfoque funcional Toxicología donde sustancias tóxicas se definen por su función y no únicamente por su química. Dado un paso más, funcional toxicogenómica busca entender el rol que juegan de genes específicos en los efectos de sustancias tóxicas5. Con la aplicación de la tecnología de siRNA, pantallas para investigar funciones de los genes en las respuestas moleculares y celulares a sustancias tóxicas pueden realizarse en el alto rendimiento. siRNA son doble trenzado RNA moléculas de 19-25 nucleotides largos que, aprovechando el post transcripcional gen silenciamiento vía presente en todas las células mamíferas6. Sintéticamente estos están fabricados y diseñados para un gen específico de destino. Cuando se introduce en una célula, el siRNA se procesa y se carga una sola hebra, la hebra guía, en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA dirige el RISC a una región complementaria de una molécula de mRNA, y el RISC degrada el ARNm. Esto resulta en la reducción de la expresión del gen específico. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. Este enfoque se ha utilizado para entender más los mecanismos de la susceptibilidad de la ricina y la inducción de AHR-dependiente de CYP1A17,8.

La lista de evaluación de riesgo de terrorismo químico (CTRA) y la lista de productos químicos industriales tóxicos (TIC) ha detallada seleccionadas productos químicos por su toxicidad y potencial para ser lanzado durante un terrorista, guerra o accidente de trabajo evento9. Estamos solicitando un siRNA alto rendimiento proyección enfoque de toxicogenomic (HTS) para el estudio de sustancias tóxicas de Ctra lista, que han sido identificados en riesgo alto de uso en un incidente terrorista. La toxicología tradicional intenta comprender los efectos adversos que tienen sustancias químicas sobre organismos vivos; sin embargo, tenemos un deseo de comprender los mecanismos de la lesión con el fin de informar el desarrollo de terapias y enfoques terapéuticos y posiblemente, para descubrir las moléculas que pueden ser objeto de desarrollo terapéutico. Este esfuerzo de alguna manera puede considerarse análoga a la utilización de proyección de alto rendimiento siRNA y análisis celular basado en el descubrimiento de drogas proceso10. Una diferencia importante es que el descubrimiento de medicamentos normalmente busca un destino singular para descubrimiento terapéutico Considerando que nuestro enfoque es un poco improbable que exista un objetivo singular de alto valor terapéutico para el tratamiento de la exposición de sustancias tóxicas. Esperamos que cualquier paradigma de tratamiento eficaz para la exposición de sustancias tóxicas requeriría un enfoque multifacético para alcanzar alto valor terapéutico, y datos de toxicogenomic vital pueden informar a un paradigma de tratamiento eficaz.

Automatización de mesa aporta metodología de alto rendimiento a laboratorios fuera de la industria farmacéutica o biotecnológica. Los estudios en vitro en nuestro Instituto han sido históricamente los análisis tradicionales que son de bajo rendimiento11,12,13. En los últimos años, nuestro laboratorio ha transición al uso de la robótica de sobremesa para realizar proyección de siRNA de alto rendimiento. Adjunto, presentamos el refinamiento de modelos celulares ocular y el desarrollo de in vitro métodos de exposición para el fluoruro de hidrógeno (HF) y la cloropicrina (CP) adecuado para el cribado de alto rendimiento siRNA. Nuestro objetivo es identificar moléculas que regulan el daño celular en respuesta a estas sustancias tóxicas. Los objetivos de la biblioteca de siRNA que se seleccionaron son receptores acoplados a proteína G, proteína quinasas, proteasas, fosfatasas, canales iónicos y otros objetivos potencialmente druggable. HF y CP fueron seleccionados para estudio por agentes de lista CTRA ToxNet informes de accidentes de trabajo de referencias cruzadas para encontrar a los que presentan el mayor riesgo de lesión ocular por medio de vapor exposición9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) fue utilizado originalmente como un gas lacrimógeno en WWI15. Actualmente se utiliza como un fumigante agrícola y funciones como un nematicida, fungicida e insecticida16. Fluoruro de hidrógeno (HF) se utiliza en procesos incluyendo la alquilación en refinerías de petróleo y la fluoración electroquímica de compuestos orgánicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) es un gas pero en su forma acuosa es el ácido fluorhídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Por lo tanto, elegimos utilizar HFA en nuestra celda en modelos de exposición. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y el marcador inflamatorio IL-8 fueron seleccionados como puntos finales porque los objetivos que están implicados en la lesión celular deben reflejarse en la muerte celular y la respuesta inflamatoria. En concreto, si un objetivo debían jugar un papel protector en la exposición de sustancias tóxicas, muerte celular o a la producción de citoquinas inflamatorias debería aumentar cuando se inhibe la expresión de destino por siRNA. Lo contrario sería cierto para blancos que juegan un papel negativo. Asimismo, la inflamación crónica aparece desempeñar un papel en la patología de la córnea después de la exposición y la intervención en las vías de muerte celular pueden mejorar el resultado clínico2,18.

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Protocol

1. célula cultura mantenimiento

  1. Crecer la línea celular SV40 HCEC a 37 ° C, 5% CO2y 90% de humedad en DMEM F-12 con 15% de suero bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, μg/L 10 factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la insulina de 5 mg/L.
  2. Paso de la línea celular cada 3 a 4 días (dependiendo de la densidad de siembra) para asegurar que confluencia nunca supera el 80% durante el mantenimiento de la cultura.
  3. Separar las células de matraces con un desprendimiento (solución 14 mL por cada frasco de 150 cm2 ) e incubación a 37 ° C durante no más de 8 minutos.
  4. Neutralizar la solución de separación con un volumen igual de medio de cultivo celular y de la pelotilla de las células en tubos cónicos de 50 mL por centrifugación durante 7 min a 160 g x.
  5. Resuspenda el precipitado de células en el medio (20 mL en cada frasco de 150 cm2 ).
  6. Contar las células con un contador celular automatizado de mano y semilla en frascos nuevos a una densidad que les permitirá crecer de 3 a 4 días sin superar el 80% de confluencia.

2. placa células para la experimentación

  1. Ver frascos de SV40-HCECs por microscopia ligera de contraste de fase para asegurar esa confluencia es menor al 80% y para evaluar la salud general de la célula.
  2. Separar, pellets, resuspender y contar SV40-HCECs de matraces como se describe en los pasos 1.3 a 1.6 de mantenimiento de la cultura de célula. Utilice medio de HCEC SV40 que contienen hidrocortisona 0.5 μg/mL (medio HCORT) para resuspender las células.
  3. En una botella desechable mediana, preparar una suspensión de SV40-HCECs 17.857 células/ml en medio HCORT precalentado.
    1. Preparar un volumen de suspensión celular suficiente para el número de placas para ser sembradas.
    2. Un mínimo de placas de 14 x 96 pocillos con células para cada placa de la biblioteca de siRNA a estudiar de la semilla.
  4. Agitar la botella para suspender las células uniformemente, verter un volumen suficiente de la suspensión de células en un embalse en el nido de Agitador orbital de un controlador automático de líquido y almacenar la botella que contiene la suspensión de células en a 37 ° C placa de calentamiento durante el recubrimiento de la célula proceso.
  5. Utilizar el controlador líquido automatizado para añadir las células a las placas de una densidad de 1000 células por pocillo (5000 células/cm2) en 70 μl de medio por pozo de una placa de 96 pocillos. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. Ejecute el agitador orbital a 100 rpm constantemente durante el proceso de transferencia.
    2. Mezclar la suspensión tres veces (140 μl mix volumen) utilizando el controlador líquido automatizado.
    3. 140 μl de la suspensión de células de aspirar y dispensar 70 μl en cada pocillo de dos placas de cultivo celular.
    4. Repita los pasos 2.5.3 y 2.5.4 hasta que todas las placas han sido sembradas con las células.
    5. Rellene el depósito de la suspensión de células según sea necesario durante el proceso de transferencia.
  6. Después de que las placas han sido sembradas, eliminarlos desde el controlador de líquido automatizado e Incubar 30 min a temperatura ambiente antes de transferirlas a una incubadora de cultivo celular.
  7. Evaluar la densidad celular de cada pocillo por cada placa a la mañana siguiente con un sistema automatizado de proyección de imagen que se encuentra en una incubadora de cultivo celular y excluir cualquier placa de estudio que tienen pozos interiores que no están entre 15% y 22% confluente.

3. transfectar las células con siRNA

  1. Adquirir placas de siRNA biblioteca del vendedor previamente configurado para contener 80 objetivos de siRNA por placa (véase figura 4), con las columnas 1 y 12 a la izquierda vacía.
  2. Reconstituir la placa de la biblioteca de siRNA con tampón de siRNA a una concentración final de 2 pmol/μl de cada pocillo de siRNA según las instrucciones19 el fabricante.
  3. Transfectar las células 24 h después de la siembra con 4 pmol/pozo de siRNA y 0,3 μL/pocillo de reactivo de transfección. Realizar todos los pasos según protocolo del fabricante de reactivo de transfección (ver figura 4 para el diseño de la placa)20.
    1. Realizar todas las transfecciones con un controlador automático de líquido y utilizar un 25 μl/s de velocidad de pipeteado para todos los pasos. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos que serán transfectados.
    2. Utilice la parte superior de la mitad de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto de seis platos repetidos que se refiere como el "conjunto de placa de arriba" (seis repeticiones por siRNA, n = 6).
    3. Utilizar la parte inferior de la mitad de la placa de la biblioteca para transfectar un conjunto diferente de seis platos repetidos que se refiere como el "conjunto de placa de fondo" (seis repeticiones por siRNA, n = 6).
    4. Utilizar el término "Sistema completo de la placa" para describir las 12 placas de células que han sido transfectadas con siRNA library.
    5. Transfectar pozos B2-B6 de todas las placas en el sistema completo de placa con siRNA piscina negativo después de que todos los juegos de la placa superior e inferior han sido transfectados con siRNA library.
    6. También transfectar pozos B2-B6 de otro dos placas, que no recibe biblioteca siRNA y servirán como controles no expuestos (uno para el conjunto de placa superior) y otro para el conjunto de placa de fondo, con piscina negativo siRNA.
  4. Incubar todas las placas de células en una incubadora de cultivo celular de 4 horas después de que se han añadido todos los mixes de transfección y mezcla por suave aprovechando cada hora.
  5. Uso un controlador líquido automatizado para lavar todos los pocillos de las placas dos veces con precalentado medio HCORT diluido 1:5 en PBS. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en un depósito de residuos.
    2. Añadir a cada pozo 100 μl/pozo con medio HCORT diluido 1:5 PBS en que está contenido en un depósito diferente en un volumen suficiente para el número de placas.
    3. Repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2 para cada placa.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
      2. Rellenar el depósito con medio HCORT había diluido 1:5 en PBS según sea necesario.
    4. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en el depósito de residuos.
  6. Realimentación a todos los pocillos de las placas con 100 μL/pocillo con HCORT medio, que está contenido en un depósito diferente en un volumen suficiente de medio para el número de placas.
    1. Llene el tanque con medio según sea necesario.
  7. Utilizar pocillos C2-C6 de todas las placas como controles no transfectadas.
  8. Mantener pozos B7-B11 y C7-C11 de todas las placas no transfectadas para ser utilizado como controles de drogas y vehículo para la exposición de sustancias tóxicas.

4. realimentación de las células el siguiente día

  1. Utilice un controlador líquido automatizado para realimentación todos los pocillos de las placas. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. 100 μl de cada pocillo de aspirar y descartar en un depósito de residuos.
    2. Alimentar cada pozo con 100 μL/pocillo con HCORT de medio que está contenida en un depósito diferente y tiene un volumen suficiente de medio para el número de placas a ser refed.
    3. Repita los pasos del 4.1.1 y 4.1.2 según sea necesario para la realimentación de todas las placas de la celda.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
      2. Llene el tanque con medio según sea necesario.

5. Control positivo además

  1. Dos días después de transfección y dos horas antes de la exposición, preparar una solución de μm 62.5 de la cardamonin de control positivo en medio HCORT se utiliza para exposiciones HFA y añadir a la fila B de un reservorio de 8 hileras de dilución.
    1. Exposición a CP, preparar y utilizar una solución de 25 μm de SKF 86002.
    2. Preparar un volumen de control positivo suficiente para el número de platos a probar.
  2. Preparar una solución de 0.625% de DMSO en medio HCORT (control del vehículo) y añadir a la fila C del embalse mismo.
    1. Exposición a CP, preparar y utilizar una solución de 0,5% de DMSO.
    2. Preparar un volumen de control del vehículo suficiente para que el número de platos a probar.
  3. Uso el controlador automatizado de líquido agregar los controles positivo y vehículo a pozos B7-B11 y C7-C11 de cada placa de celular y utilizar un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos que se reciben los controles positivo y vehículo.
    1. Saque 10 μl de medio de pozos, B7-B11 y C7-C11 de cada placa de la célula y deseche en filas G y H del tanque de dilución de 8 hileras.
    2. Transferir 10 μl de los controles positivo y vehículo a los pozos y mezcle 3 veces.
  4. Volver estas placas de la celda a la incubadora.
  5. Repita los pasos 5.3 a 5.4 hasta placas de células todos han recibido positivas y controles del vehículo.

6. HF la exposición de las células cultivadas

PRECAUCIÓN: HFA es corrosivo y muy tóxico.

  1. Realizar todas las operaciones de la exposición a sustancias químicas en una campana de vapores químicos, usando guantes de nitrilo doble, una capa del laboratorio, protectores de manga de polietileno desechable y gafas de seguridad.
    1. Adquirir HFA como una solución de 48%.
    2. Diluya el HFA al 1% con agua ultrapura y almacenar en alícuotas de 5 mL en 10 mL frascos de polietileno de pared gruesa para mejorar la seguridad.
    3. Descontaminar las puntas de pipeta y embalses que han entrado en contacto con HFA y cualquier restos líquido HFA con gluconato de calcio 2,5% antes de la eliminación en la corriente de residuos peligrosos.
  2. Por cada placa de la biblioteca del siRNA bajo investigación, preparar una solución de medio de HFA de 0.0036% añadiendo 288 μl de 1% HFA a 80 mL de medio HCORT precalentado en una botella de 150 mL.
    1. Agitar la botella e incubar la HFA diluido en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos durante 10 minutos.
  3. Mezcle la solución de medio de HFA otra vez agitando la botella y añadir la solución de medio de HFA a un reservorio de reactivo sobre una placa caliente.
  4. Realizar la exposición con dos técnicos que trabajan en tándem.
    1. Que el técnico en la derecha aspirado 100 μl de cada uno de los pocillos del interior de una placa celular utilizando una pipeta 12 canales y luego pasar la plancha al técnico a la izquierda.
    2. Que el técnico la izquierda añadir 100 μl por pocillo de la solución de medio de HFA.
    3. Repita los pasos 6.4.1 y 6.4.2 para todas las placas de células que se van a estar expuestos a tóxicos.
    4. También repita 6.4.1 y 6.4.2 de las placas de control no expuestos, utilizando medio HCORT fresco en lugar de la solución de medio de HFA.
  5. Coloque las placas en la incubadora de la campana de vapores químicos durante 20 min y luego devolverlos a la incubadora de la cultura de célula.
  6. Repita el paso de adición de control positivo (pasos 5.1 a 5.5) como se ha demostrado una vez que todas las placas han sido expuestas y volvió a la incubadora de la cultura de célula.

7. CP exposición de las células cultivadas

PRECAUCIÓN: CP es agudo tóxico e irritante.

  1. Realizar todas las operaciones de la exposición a sustancias químicas en una campana de vapores químicos, usando guantes de nitrilo doble, una capa del laboratorio, protectores de manga de polietileno desechable y gafas de seguridad.
    1. Adquirir el CP.
    2. CP de diluir al 5% en DMSO y almacenar en alícuotas de 10 mL en 10 mL viales de centelleo para mejorar la seguridad.
    3. Descontaminar las puntas de pipeta y embalses que han entrado en contacto con CP y cualquier sobrante CP líquido con bisulfito de sodio 2,5% antes de la eliminación en la corriente de residuos peligrosos.
  2. Preparar un volumen suficiente de precalentado medio HCORT que contiene 1 x pluma/Strep y PBS precalentada para el número de placas para ser expuesto.
  3. Para cada conjunto de Tapa placa de sistema o placa base, añadir μl 8.04 5% CP en DMSO a una alícuota de 50 mL de precalentado medio HCORT y mezclar bien para una concentración final del CP de 0.0008%. Cerrar herméticamente el tubo e incubar la solución en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos de 1 h.
    1. Tiempo la incorporación de CP a las alícuotas de 50 mL de medio para que cada uno había expuesto arriba placa Set y Set de placa inferior recibe toxicante exactamente 1 h después de CP fue agregado a la alícuota de 50 mL de medio.
  4. Sacar un Top Set de placa y placa de 1 control no expuesta de la incubadora de cultivo celular y en la campana de humos químicos cerca del final de la incubación.
  5. Mezcle la solución CP por inversión del tubo y luego decantar a un reservorio de reactivo al final del período de incubación de 1 h.
  6. Realizar la exposición con dos técnicos que trabajan en tándem.
    1. Que el técnico en la derecha aspirado 100 μl de cada uno de los pocillos del interior de una placa celular utilizando una pipeta 12 canales y luego pasar la plancha al técnico a la izquierda.
    2. Que el técnico la izquierda añadir 100 μl por pocillo de la solución de medio de CP.
    3. Repita los pasos 7.6.1 y 7.6.2 para todas las placas de la celda del Top placa Set expuestos a tóxicos.
    4. También repita 7.6.1 y 7.6.2 para las placas de control no expuestos, utilizando medio HCORT fresco en lugar de la solución de medio de CP.
  7. Coloque las placas en una incubadora de 37 ° C en la campana de vapores químicos durante 10 minutos.
  8. Añadir un volumen suficiente de medio PBS y HCORT que contiene 1 x pluma/Strep a embalses de reactivo cerca del final de la incubación de 10 minutos.
  9. Retire la solución CP de placas de células utilizando una pipeta 12 canales y reemplazarlo con 100 μl por pocillo de PBS al final de la incubación de 10 minutos.
  10. Quitar inmediatamente el PBS del placas de células y reemplazarlo con 100 μl por pocillo de medio HCORT que contiene 1 x pluma/Strep.
  11. También repita 7.9 y 7.10 para las placas de control no expuestos.
  12. Devolver las placas de la celda a una incubadora de cultivo de célula estándar.
  13. Repita los pasos 7.3 a 7.12 para el conjunto de placa de fondo.
  14. Repita el paso de adición de control positivo (pasos 5.1 a 5.5) como se describió anteriormente una vez que todas las placas han sido expuestas y volvió a la incubadora de la cultura de célula.

8. recolección y análisis de viabilidad de la célula de la muestra

  1. Veinticuatro horas después de la exposición, preparar una solución de sustrato MTT de 0.5 mg/mL en PBS con 10 g/L glucosa y caliente a 37 ° C21. Preparar 10 mL de sustrato de cada placa a ensayarse.
  2. Para el número de placas a ensayar, agregar un volumen suficiente de solución de MTT a un depósito en un controlador de líquido automatizado.
  3. Uso el controlador líquido automatizado para recoger la muestra y añadir substrato MTT usando un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos. Preconfigurar cajas de punta para atender sólo los pozos a ensayarse.
    1. Medio de aspirado 95 μl of desde el internos 60 pozos de la placa de la célula y depósito 42.5 μL en cada uno de dos placas de 384 pozos de almacenamiento.
    2. Añadir 100 μl por pocillo de la solución substrato con MTT a las placas de la celda e incubar a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular de 1,5 h.
    3. Llene el tanque con solución de MTT según sea necesario.
  4. Incubar las placas de células a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular durante 1 hora.
  5. Sellar las placas de almacenamiento de 384 pozos y almacenarlas a-80 ° C para posterior análisis.
  6. Repita los pasos 8.3 a 8.5 para los sistemas de placa superior e inferior y los controles no expuestos asociados.
    1. Reutilizar consejos entre repeticiones si lo desea, pero lavarlos al agregar solución de MTT y cuándo cambiar de placa fija.
  7. Después de la 1 h de incubación, añadir un volumen suficiente de DMSO a un depósito en un controlador de líquido automatizado.
  8. Uso el controlador automatizado de líquido agregar DMSO y utilizar un pipeteo de 50 μl/s de velocidad para todos los pasos.
    1. Aspire 100 μl de cada uno de los pozos internos de las placas de la celda y eliminar la solución de sustrato MTT en un depósito de residuos.
      1. Vaciar el depósito de residuos según sea necesario.
    2. Superposición de cada pozo con 100 μl DMSO.
      1. Rellene el depósito de DMSO según sea necesario.
  9. Agitar las placas en un agitador de placa durante 3 minutos.
  10. Medir la absorbancia a 570 y 690 nm usando un espectrofotómetro de placa.
  11. Reste el fondo y calcular el % de viabilidad de la célula dividiendo los valores de absorbancia expuestos entre los controles no expuestos. Utilice el control de siRNA media piscina negativo expuesto para calcular el % de viabilidad celular para todos los objetivos.

9. medida de IL-8 concentración en sobrenadantes de cultivo celular

  1. Medida de la concentración de IL-8 en los sobrenadantes de cultivo celular usando un no lave ensayo basado en grano según las instrucciones22 el fabricante. Crear un diseño de placa de ensayo para dar cabida a muestras y curva estándar.
  2. Retire las placas de almacenamiento de 384 pozos del congelador de-80 ° C, descongelar a temperatura ambiente y centrifugar brevemente las placas para recolectar la muestra en el fondo de los pozos.
  3. El número de las placas de ensayo a ejecutar, hacer un volumen suficiente de granos de aceptador de anti-IL-8 y la del anticuerpo biotinilado anti-IL-8 en tampon de ensayo incluido en el kit. Utilice el cociente de 50 μl de anti-IL8 granos de aceptador y 50 μl de anticuerpo biotinilado anti-IL8 9,9 mL de tampón de ensayo.
    1. Utilizando una pipeta multicanal, agregue la mezcla de grano anticuerpos a una placa de almacenamiento de 384-pozo negro.
      1. Añadir aceptador grano/anticuerpo en los pocillos destinados al uso para las muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      2. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
  4. Reconstituir el estándar de la IL-8 a 1000 pg/mL con medio de cultivo celular que contiene 354 μm NaCl. Hacer un volumen suficiente para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
  5. Hacer el ocho doble diluciones seriadas de la curva estándar.
  6. Añadir la curva estándar por triplicado a los pocillos adecuados de una placa de almacenamiento de 384-pozo negro según el diseño de la placa de ensayo. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
    1. Del mismo modo, agregar medio de cultivo celular que contiene 354 μm NaCl con no IL-8 para la medida de fondo.
  7. Utilizar un controlador de líquido automatizado para realizar el ensayo. Usar cajas de punta preconfigurado para atender sólo los pozos designados por el diseño de la placa de ensayo. Usar un 50 μl/s velocidad de pipeteado para todos los pasos.
    1. Transferencia de 8 μl de la mezcla de grano-anticuerpo aceptador en los pocillos de las placas de 384 pozos poco profundos análisis bien blanco.
      1. Añadir sólo a los pocillos para muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
    2. Transferencia de 2 μl de la curva estándar a los pocillos de las placas de ensayo de pozo poco profundas según el diseño de la placa de ensayo adecuados.
    3. Preparar una solución de NaCl de 3,54 M y añadir un volumen suficiente para el número de placas a ensayar a un depósito poco profundo en el controlador de líquido automatizado.
    4. Ajustar la concentración de sal de las muestras para que coincida con la de la curva estándar transfiriendo 4.5 μl de la solución de NaCl a las muestras en las placas de almacenamiento de 384-pozo negro.
    5. Mezclar las muestras tres veces con un volumen de 30 μl de mezcla y transferencia 2 μl de las muestras al blanco superficial análisis bien las placas de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      1. Cambio de puntas entre las placas de la muestra.
    6. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
    7. El número de las placas de ensayo a ejecutar, hacer un volumen suficiente de granos aceptador en tampon de ensayo. Utilice la proporción de 200 μL de granos aceptor secundario a 12,3 mL de tampón de ensayo.
    8. Utilizando una pipeta multicanal, añadir granos secundarios a una placa de almacenamiento de 384-pozo negro.
      1. Añadir cuentas secundarias en los pocillos destinados al uso para las muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo.
      2. Añadir un volumen suficiente por bien para el número de las placas de ensayo a ejecutar.
    9. Utilizando el controlador líquido automatizado, transferir 10 μl de las cuentas secundarias en los pocillos de las placas de ensayo bien 384-pozo superficial blanco.
      1. Añadir sólo a los pozos que recibieron muestras y curva estándar de acuerdo con el diseño de la placa de ensayo y lavar las puntas entre cada placa.
    10. Incubar durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente.
  8. El ensayo de placas con claro sellos de placa y escanear con un lector compatible con el ensayo del sello. Utilizar distancia 0,2 mm entre la placa y detector, 180 ms tiempo de excitación y 550 ms tiempo de medición para el análisis.
  9. Importar los datos en bruto de los ensayos de IL-8 en una hoja de cálculo.
  10. Utilice curva automatizada para la curva estándar de los ensayos de IL-8 y luego convertir los datos en bruto a pg/mL para cada muestra.

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Representative Results

Desarrollo de métodos de exposición

Había refinado y evaluar la idoneidad de la línea de células epiteliales corneales humanas SV40 HCEC para su uso en estudios HTS. SV40-HCEC se inmortalizó con el antígeno T grande de SV-40 y fueron un regalo de Dhanajay Pal23. Había demasiadas variables exploradas en el desarrollo de la metodología de exposición para presentar concisamente aquí, y por lo tanto, sólo algunas muestras de los resultados que creemos que pueden ser más ampliamente aplicables a múltiples sustancias tóxicas se presentan.

Exposición de sustancias tóxicas por espiga o intercambio medio

Inicialmente se buscó exponer las células por spiking 5 μl de una concentración de trabajo del toxicante diluido en agua, solución salina o medio en 95 μl de medio ya está presente en cada pocillo de las células en una placa de 96 pocillos para alcanzar la concentración final deseada exposición. SV40-HCEC fueron expuestos mediante este punto exponer/realimentación metodología 1 X LD50 de HFA por 24 h (1 X LD50 = 0,02% HFA por este método cuando la espiga HFA se diluyó en medio), y wells fueron refed con medio fresco 10 min más tarde. Después de 24 h, las células eran overlaid con un sustrato MTT como se describe anteriormente para el ensayo de viabilidad celular. Imágenes fueron capturadas por photomicroscopy antes de la solubilización de los cristales de formazán con DMSO. Examen minucioso de los pozos mostraron que un alto grado de muerte celular fue localizado en un punto, y esto es a pesar de que la placa fue sacudida por 15 s inmediatamente después de la espiga fue agregado a toda la placa (Figura 1a). Este fenómeno fue observado cuando la espiga se agregó a la parte inferior del bien o al valor añadido en el menisco. Una imagen de aumento más alto de esta zona mediante la muestra de contraste de fase que las células todavía están presentes en el área mancha por MTT (Figura 1b). También probamos un intercambio medio exponer/realimentación metodología donde medio fue quitado de los pozos, reemplazados con medio de cultivo celular que contiene el 1 X LD50 de HFA (1 X LD50 = 0.035% HFA por este método) y pozos fueron refed con medio fresco 10 min más adelante. Después de 24 h, las células eran overlaid con un sustrato MTT como se describió anteriormente. Este método logra una aparentemente más incluso celular muerte respuesta de las células en cada pozo (figura 1C y 1D). Controles se proporcionan para la referencia y no Mostrar áreas localizadas de muerte celular (Figura 1e y 1f). Para exposiciones de CP, el método de punto no produjo un alto grado de muerte celular localizada en un punto dentro de cada pozo; sin embargo, la respuesta de muerte celular fue más consistente de una iteración a la siguiente mediante el método de exposición de intercambio medio (datos no mostrados).

Figure 1
Figura 1 : Célula muerte inducida por spike y los métodos de exposición intercambio medio. Todas las imágenes fueron capturada 1,5 h después de la adición de un substrato MTT. Panel (a) es una imagen de campo claro de SV40-HCEC expuesto a spike HFA exponer/realimentación metodología. El panel (b) es un aumento mayor del mismo pozo en el panel (a) con contraste de fase. Panel (c) es una imagen de campo claro de SV40-HCEC expuesto por intercambio medio exponer/realimentación metodología. (D) el panel es un aumento mayor del mismo pozo en el panel (c) con contraste de fase. Paneles (e) y (f) son de un campo bien expuesto, brillante y un aumento mayor de contraste de fase, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Estabilidad de sustancias tóxicas en el medio

Se observó que una vez diluido en el medio, la aparente citotoxicidad de HF y CP cambia y luego se estabiliza. HFA fue había diluido en medio 0.0036% y permitió a incubar a 37 ° C durante 1-60 min antes de exponer el SV40 HCECs como se describió anteriormente. Para HFA, la citotoxicidad aumenta dentro de los primeros 5 min HFA se diluye en medio y luego estable para por lo menos una hora (Figura 2a). Una forma de ANOVA seguido de prueba de comparación múltiple de Dunnett mostró % de viabilidad celular en todos momentos fueron significativamente diferentes desde el punto de tiempo 1 min. No hubo diferencias significativas entre 2.5 a 60 min puntos del tiempo. CP es orgánico y es primero diluida al 5% en DMSO. Luego fue había diluido en medio al 0.0008% y permitió a incubar a 37 ° C durante 5-120 minutos antes de exponer el SV40 HCECs como se describió anteriormente. Una vez diluido en el medio, la citotoxicidad del CP disminuye durante 60 min y luego se estabiliza para por lo menos la siguiente h (figura 2b). Una forma de ANOVA seguido de prueba de comparación múltiple de Dunnett mostró % de viabilidad celular en todos momentos fueron significativamente diferentes desde el punto de tiempo 5 min. No hubo diferencias significativas entre 60 a 120 min puntos del tiempo.

Figure 2
Figura 2 : Pérdida de sustancias tóxicas de la citotoxicidad en las diluciones medianas. Los datos se expresan como la media de la viabilidad por ciento ± SD (n = 6). Panel (a) muestra la estabilidad de la citotoxicidad HFA 0.0036% diluido en medio y se incubaron a temperatura ambiente durante 1-60 min antes de exponer el SV40 HCECs como se describió anteriormente. Panel (b) muestra la estabilidad de la citotoxicidad de CP 0.0008% diluido en medio y permitió a incubar a 37 ° C durante 5-120 minutos antes de exponer el SV40 HCECs como se describió anteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Exponer/realimentación o exponer sólo

Otro factor investigado en metodología de la exposición era si a: A) agregar tóxicos para 10 min, lavar, realimentación, retire las placas de la campana de vapores químicos e incubar 24 h en una incubadora de la cultura de célula estándar (método de exponer/realimentación); o B) agregar toxicante, deja encendido, quite las placas de la campana de humos químicos e incubar 24 h en una incubadora de cultivo celular estándar (único método de exponer). La seguridad es un factor importante que no sea permitido eliminar las placas de las celdas que contienen el tóxico diluido de la campana química porque los tóxicos gases y exponer a personal. Una consideración relacionada es el número de placas para ser expuesto en un momento dado desde las placas más hay, habrá un mayor volumen apagado-gasear. En nuestros métodos HTS, se exponen placas de 48 x 96 pocillos en un día de estudio dado. Colocan placas celulares expuestas en una bolsa sellada y luego utiliza tubos detectores de gas colorimétrico para evaluar CP y HF apagado-gasear de placas expuestas. Encontramos que exponer 48 placas 1 x LD50 de HFA no produjo ningún perceptible HF apagado-gasear (datos no mostrados). De la exposición del CP, se encontró que había suficiente CP apagado-gasear de 48 placas expuestos a 1 x LD50 para presentar al menos alguna preocupación de seguridad (datos no mostrados). Exponer/realimentación y exponer sólo métodos fueron evaluados para exposiciones HFA. Las células SV40 HCEC expusieron a HFA y viabilidad se evaluó por análisis de MTT 24 h después de la exposición. Dosis respuesta iteraciones se realizaron en días diferentes. En comparación con el método de exponer/realimentación (figura 3a), encontramos que el único método de exponer había producido más consistentes resultados de análisis de viabilidad de la célula (figura 3b). Por lo tanto, este método fue seleccionado como parte de la metodología de exposición final. Para CP, cualquier diferencia en la consistencia de los resultados de ensayo de viabilidad celular entre las dos metodologías de exposición diferentes podría ser evaluado no ya que problemas de seguridad impiden retirar las placas CP expuesto de la campana química de 24 h de incubación en una incubadora de cultivo celular estándar.

Figure 3
Figura 3 : Consistencia de la exposición con exponer/realimentación y exponer sólo los métodos. Los datos se expresan como la media de la viabilidad por ciento ± SD (n = 6). (a) HFA fue diluido en medio, se incubó a temperatura ambiente durante 10 min y luego utilizado para exponer las células por el método de exponer/realimentación. (b) HFA fue diluido en medio, se incubó a temperatura ambiente durante 10 min y luego utilizado para exponer SV40 HCEC por el único método de exponer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Refinamiento del modelo de celular

Componentes del medio

Adhiere a las condiciones de cultivo establecidas por los investigadores originarios del paso y el mantenimiento de estas líneas celulares; sin embargo, los modificamos para que las células en la experimentación. El medio de cultivo celular prescrito por los investigadores provenientes de las células SV40 HCEC no incluyen hidrocortisona, pero utilizamos un bajo nivel de hidrocortisona (0,5 μg/mL) durante estudios de exposición para suprimir el punto ocasional en la producción de citoquinas visto en ingenuo SV40-HCEC (datos no mostrados) que afectado a análisis de los datos de una iteración a la siguiente durante los estudios de refinamiento.

Estabilidad fenotípica

Durante nuestros estudios de refinamiento del modelo de celular, encontramos que el SV40-HCEC comienzan a han disminuido la producción de citoquinas en respuesta a la exposición de sustancias tóxicas a partir alrededor de número de paso 60 (datos no mostrados). Por esta razón, mantiene cryostocks de células de paso bajo, había ejecutado todos los estudios con células con el número 60 de paso y controlar la producción de citoquinas durante el proceso de selección.

Diseño de placa

Una fuente importante de variabilidad experimental en estudios de alto rendimiento es efectos de borde de placas de varios pocillos. Encontramos que las respuestas del cytokine de células en los pozos de borde no eran constantes con, o equivalente a, pozos interiores en ambos HFA y CP estudios (datos no mostrados). Esmalte mediana de los datos de un ejercicio estadístico utilizado para minimizar los efectos de borde sobre un conjunto de datos, suficientemente no resolvió el problema (datos no mostrados). Por lo tanto, no hay pozos de borde de placa celular fueron utilizados para la experimentación o los controles (figura 4).

Figure 4
Figura 4 : Diseños de biblioteca y placa celular. Las áreas sombreadas de gris en el Layout de la placa de biblioteca representan pozos que contienen siRNA. Los pozos blancos están vacíos. Los 40 objetivos de filas A-D de la placa de la biblioteca se utilizan en el "conjunto de placa de tapa", y los 40 objetivos de filas E-H de la placa de la biblioteca se utilizan en el "conjunto de placa de fondo". Pozos B2-B6 se utiliza para los controles de siRNA piscina negativo. Pozos de C2-C6 son no transfectadas. B7-B11 de pozos se utilizan para cardamonin o medicamentos de control positivo 86002 SKF como se describe, y pozos C7-C11 son utilizados para el control del vehículo DMSO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la validación del modelo de Vitro para HTS

Utilizamos Z' factor de análisis para determinar la idoneidad de SV40-HCEC para el uso en estudios HTS como esta prueba estadística se usa para determinar la calidad del ensayo para HTS24. Para HF Z' factor de análisis, las células fueron sembradas en 1.25 x 103 células/pozo, transfected con siRNA piscina negativo (como se describe anteriormente) 24 h después de la siembra y expuestos a 48 h después de transfección 0.0036% HFA (1 x LD50), n = 3. Para CP Z' factor de análisis, las células fueron sembradas transfected como se describe anteriormente y expuestos 48 h después de la transfección a 0.0008% CP (1 x LD50), n = 5. Un n mayor fue utilizado para los estudios del CP debido a la mayor variabilidad en este modelo de exposición. Z' factor se calculó para la IL-8 expresión datos de células no expuestos y expuestos y negativo piscina siRNA transfectadas no expuestos vs expuestas las células para exposiciones CP y HFA. También se analizaron las células transfectadas no para determinar si hubo un efecto sobre la calidad del ensayo por transfección de siRNA. Muchas iteraciones de los estudios de validación se realizaron mientras la refinación de las condiciones de exposición y de la cultura en un esfuerzo por maximizar la Z' factor resultados. SV40-HCEC pasó validación y más iteraciones Z' factor valores mayores a 0.50 para exposiciones de HF (tabla 1) y exposiciones de CP (tabla 2). Cada repetición de estas tablas fue de células plateadas en días diferentes.

Grupos de exposición Z'-análisis de factores
República #1 República #2 República #3
Control negativo expuesto HF vs Control negativo no expuesta 0,68 0.5 0,56
HF-expuestos vs ingenuo 0.4 0,68 0,56

Tabla 1: HCEC SV40 HFA exposición Z' Factor análisis de IL-8

Grupos de exposición Z'-análisis de factores
República #1 República #2 República #3
Control negativo expuesto CP vs Control negativo no expuesta 0.6 0.18 0,46
CP-expuestos vs ingenuo 0.42 0.29 0.42

Tabla 2: HCEC SV40 CP exposición Z' Factor análisis de IL-8

SiRNA primario proyección resultados de HFA lesiona las células

Estudios de optimización de la transfección fueron realizados antes de la proyección, y siRNA dirigidas a ciclofilina b fue utilizado para estos estudios. Un análisis de detección en situ RNA fue utilizado para medir los niveles de mRNA de ciclofilina b, y un Gran analizador de contenido se utilizó para cuantificar los resultados. Hemos conseguido cerca de 90%, precipitación de la ciclofilina b y por lo general no más de 5-10% pérdida de la célula con 4 pmol de siRNA/pozo y 0,3 μL/pocillo de la transfección reactivos (datos no mostrados). Mayores cantidades de siRNA en realidad dio lugar a la peor caída en ciclofilina b (datos no mostrados). Se alcanzaron niveles similares de caída con 1.2 pmol/pozo de siRNA y 0.09 reactivo de transfección μL/pocillo, pero hemos elegido usar 4 pmol por pozo para hacer frente a todos los destinos que podrían requerir una mayor cantidad de siRNA para lograr eficaz precipitación. Cinética de precipitación de destino también fueron evaluadas, y se observó que caída de destino era máxima por transfección después de dos días (datos no mostrados). Consistencia precipitación objetivo a través de la placa también fue validados (datos no mostrados). Los medicamentos cardamonin y SKF 86002 se utilizan como controles positivos para la inhibición de la producción de citoquinas para la exposición HFA y CP, respectivamente. Estos fueron seleccionados por prueba una variedad de compuestos con propiedades antiinflamatorias conocidas en las células expuestas. La dosis utilizada en los estudios de detección fue seleccionada por los estudios de optimización de dosis respuesta.

El siRNA de alto rendimiento proyección estrategia utilizamos es estándar y consiste en tres pasos principales: 1) principal proyección, deconvolución 2) Biblioteca y validación 3) objetivo. En el cribado primario, el fenotipo de cada objetivo se evalúa utilizando una mezcla de ARNsi diferentes secuencias como un solo reactivo a cada gene. Objetivos son entonces abajo-seleccionada para la deconvolución de la biblioteca. En este paso, cada una de las secuencias del siRNA diferentes que son agrupadas para cada gene en el cribado primario se prueban por separado. Objetivos se someten a otro abajo-selección en validación de destino en el que el fenotipo blanco es confirmado con drogas, restauración de fenotipo, o siRNA de otro proveedor. Pantalla principal, nos eligió realizar una pantalla sub-genómica enfocada en lugar de una pantalla amplia de genoma por razones de economía. Datos de microarrays de HF y CP heridas córneas de ratón e ingenio vía análisis (IPA) fueron utilizados para enfocar nuestra biblioteca de destino para la pantalla principal (manuscritos en preparación). Brevemente, córneas de ratón fueron expuestas a sustancias tóxicas vapor con una taza de vapor similar a métodos previamente descritos25. Controles y botones de córnea expuesta se cosecharon a tiempo varios puntos post exposición. RNA fue aislado, y la calidad y la cantidad de ARN. Todos los experimentos de microarrays se realizaron según protocolo26 el fabricante. Intensidades de la señal cruda fueron normalizados y analizados por análisis de componentes principales (PCA) para determinar las fuentes significativas de variabilidad en los datos. Genes eran rango ordenado por significación estadística. Los datos fueron extraídos y en comparación con las listas de gen de librerías de siRNA preconfigurados. De estas listas de gen, seleccionamos 3120 objetivos para proyección. Se proyectó la biblioteca de siRNA en células SV40 HCEC (vea la figura 5 para un diagrama de flujo del protocolo HTS para la pantalla principal). Evaluación final incluyeron niveles de IL-8 en medio de cultivo celular por lavado no basados en grano análisis y viabilidad de las células por ensayo MTT. Las células fueron expuestas a 0.0036%HFA, como se describió anteriormente, que es de aproximadamente 1 x LD50. Viabilidad celular fue evaluada por análisis de MTT 24 h después de la exposición. Se analizó el efecto de cada piscina de siRNA en viabilidad celular para significación estadística respecto de la media piscina negativos expuestos para cada placa con la diferencia de medias estandarizada terminantemente (SSMD)27. Una parcela de linterna dual de la viabilidad fold-cambio SSMD y celular se muestra en la figura 6. Los umbrales de éxito de la selección para objetivos que exacerbaron la muerte celular o mejoraron viabilidad celular fueron ≤ SSMD -1,28 y SSMD ≥ 1.28, respectivamente.

Figure 5
Figura 5 : Diagrama de flujo del protocolo HTS de pantalla principal. Este diagrama de flujo muestra los pasos esenciales que se realizan cada día para el protocolo HTS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Linterna doble parcela de siRNA efecto sobre las células de SV40-HCEC Cell Viability of HFA-Exposed. Resultados que se muestran para cada destino son el promedio de seis repeticiones (n = 6). Datos de viabilidad celular se expresan como un cambio de pliegue en relación con el siRNA control de piscina negativa expuesta, y se analizó la significación estadística por SSMD. Objetivos que tenían un ≤ SSMD -1,28 o ≥ 1.28 fueron seleccionados como hits. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se analizó el efecto de cada piscina de siRNA en la producción de IL-8 inducida por HFA para significación estadística respecto de la media piscina negativos expuestos para cada placa. IL-8 en sobrenadante de cultivo celular fue ensayo evaluado 24 h después de la exposición. Una parcela de linterna de doble del doble-cambio SSMD y IL-8 se muestra en la figura 7. Los umbrales de éxito de la selección para objetivos que redujo la producción de IL-8 fueron una disminución de 40% y ≤ SSMD -1,0. Los umbrales de éxito de la selección elegidos para objetivos que aumentaron la producción de IL-8 fueron multiplicado y SSMD > 1.28.

Figure 7
Figura 7 : Linterna doble trama del siRNA efecto sobre la producción de IL-8 por las células de SV40-HCEC HFA-Exposed. Resultados mostrados son el promedio de seis repeticiones (n = 6). Datos a nivel de expresión de IL-8 se expresan como un cambio de pliegue en relación con el siRNA piscina negativa expuesta, y se analizó la significación estadística por SSMD. Hits se definieron como objetivos que tenían un 40% disminución en los niveles de IL-8 y ≤ SSMD -1,0 o una quintuplicación en los niveles de IL-8 y SSMD > 1.28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Adjunto describimos nuestros métodos y resultados en el desarrollo de una célula epitelial de la córnea de alto rendimiento modelo para el estudio de lesiones en HF y CP de detección. También se presentan los resultados de la pantalla de siRNA primario para lesiones de HF. Hubo muchos desafíos para el desarrollo de modelos HTS para el estudio de las lesiones TIC. Métodos que podríamos encontrar en la literatura relacionada con el estudio de HF, HFA o CP en modelos de cultivo celular fueron de poca ayuda. Mayoría en vitro de los estudios sobre el ion fluoruro incluyen células orales y utiliza fluoruro de sodio y no HF o HFA (para ejemplos, ver28,29). Alguna metodología de la exposición en vitro de las células epiteliales bronquiales a CP ha sido publicado por n et al. 30. en última instancia, no encontramos métodos específicos en la literatura relacionada con el estudio HTS de HF, HFA o CP y la mayoría de retos y variables relacionadas con el estudio de estas sustancias tóxicas en el desarrollo de HTS necesaria. Se prestó especial atención para lograr el alto grado de coherencia de la exposición a través del tiempo y numerosas placas de cribado necesarias para un exitoso estudio HTS.

Un tipo de reto encontrado fue relacionada con la aplicación de tóxicos para los sistemas de cultivo celular. Algunos tóxicos son reactivas con o inestable en soluciones acuosas. Los tóxicos que se seleccionaron para el estudio no se consideran estos problemas de inestabilidad. Un estudio agrícolo de investigar photohydrolysis de CP demostró que una solución de 0.001 M de CP en el agua tenía una vida media de 31,1 h cuando se expone a una fuente de luz xenon de 1100 lux (intensidad de la luz del sol de un día nublado) por 10 días, 12 h por día31. No había ninguna hidrólisis medibles durante el mismo período de 10 días cuando la solución se almacenó en la oscuridad. El protón y fluoruro iones de HFA son claramente estables en agua. Sin embargo, hay consideraciones de estabilidad adicional en cuanto a las diluciones de sustancias tóxicas en el medio de cultivo celular. Encontramos que había un cambio inicial de la citotoxicidad en cierto grado cuando los toxicantes primero se diluyeron en medio de cultivo celular que luego se estabiliza después de un breve periodo de tiempo. Creemos que esto es debido a la Unión de sustancias tóxicas o formación de complejos con los componentes en el medio. Medio de celular contiene calcio, magnesio, proteínas, etc. que son conocidos por interactuar con los iones de fluoruro32,33. CP es conocido por tener reacciones oxidativas con tioles biológicas, pero también pueden obligar a ADN, proteínas y otros nucleófilos34,35. Una vez que estas reacciones y las interacciones han completado o alcanzado el equilibrio, la cantidad de tóxicos disponibles estabiliza y la aparente citotoxicidad se estabiliza así. Inicialmente se analizó el uso de solución salina y agua diluciones de sustancias tóxicas para las acciones de trabajo utilizado para exposiciones para evitar sustancias tóxicas interacciones con medio componentes en diluciones de trabajo. El uso de solución salina también preservaría el componente ácido de la lesión HFA para exposiciones realizadas por intercambio medio. Encontramos que las respuestas de muerte celular a sustancias tóxicas en el agua y las diluciones Salinas eran más variables que el método que utiliza diluciones de células de medio de cultivo con intercambio medio (datos no mostrados). En relación con el método de exposición de spike con HFA, la variabilidad puede ser debido a la inconsistencia en la espiga de dispersión en el bien hacia dianas celulares que compiten con los mandantes de medio para los iones de fluoruro disponible. Las razones de la variabilidad en las exposiciones por medio intercambio con diluciones Salinas HFA HFA no están totalmente claros. En cualquier caso, los métodos de exposición usando diluciones Salinas para HFA fueron abandonados y no explorados para CP. La toxicidad de nuestras diluciones HFA en medio imita probablemente cerca estudios utilizando fluoruro de sodio porque el medio celular neutraliza los protones libres en nuestras diluciones de HFA.

Otros desafíos que encontramos estaban relacionados con el refinamiento de los modelos de cultura de célula para el uso en el HTS. Encontramos necesario modificar a los componentes del medio de cultivo celular para las células en experimentación, específicamente hidrocortisona y antibióticos. Se utilizó un nivel bajo de hidrocortisona (0,5 μg/mL) durante estudios de exposición para suprimir el punto ocasional en la producción de citoquinas en ingenuo HCEC SV40. Esta baja cantidad de hidrocortisona no afectó negativamente a las respuestas de las células a la sustancia tóxica y estaba por debajo de los niveles normalmente utilizados para suprimir la producción de citoquinas por las células cultivadas en respuesta a estimulantes36,37. No se conocen las razones exactas de por qué las células ingenuas SV40 HCEC ocasionalmente producen citoquinas exceso, pero es posible que las células son variable sensibles a los estresores menores que se producen durante los pases y la galjanoplastia de la célula. Muchos laboratorios incluyen rutinariamente antibióticos en medio de mantenimiento del cultivo celular, pero algunos antibióticos, tetraciclinas en particular, se han demostrado para exhibir efectos antiinflamatorios en cultivos de células incluyendo células epiteliales corneales38. En general, nuestro laboratorio evita el uso de antibióticos siempre que sea posible ya que estos pueden potencialmente confundir los estudios. También investigamos la fenotípica deriva en múltiples pasajes de nuestras células en cultivo. Es común para las células inmortalizadas a deriva genética y fenotípica en múltiples pasajes, si no mantiene en la fase exponencial, si permite llegar a confluencia, o si se expone a ciertos factores estresantes ambientales39,40 ,41. Por lo tanto, es fundamental durante una pantalla de alto rendimiento que las líneas celulares se mantienen correctamente y que la pantalla se completa con un número de paso de células que mantienen la respuesta fenotípica conocida. Efectos de borde de placa multi-así es el fenómeno que las células cultivadas en los pozos del perímetro exterior de las placas de varios pocillos con frecuencia no responden a la misma o con la misma consistencia que las células cultivadas en interior pozos42. Hay ejercicios estadísticos, como la cera mediana, que puede ser utilizada para minimizar los efectos de borde en un conjunto de datos43. Sin embargo, no existe ningún ejercicio estadístico que puede eliminar efectos de borde sobre un objetivo particular o un control si siempre se prueba en un pozo de borde y variando el diseño de la placa entre Replica para pasar a objetivos o controles de pozos de borde no es logísticamente práctico o rentable. Es nuestra opinión que la decisión de incluir el uso de pozos de borde en ensayos celulares HTS debe hacerse con cautela. Encontramos necesario para eliminar el uso de las células cultivadas en pozos de borde de los controles y objetivos.

Nuestra metodología HTS celular modelo y exposición en vitro lesión HF fue utilizado para completar con éxito la pantalla de siRNA primarios de 3120 objetivos. SSMD fue utilizado para la selección de golpe porque se propuso específicamente para medir la magnitud de la diferencia entre un control y un siRNA27. Nuestros resultados para viabilidad celular demuestran que existía una relación lineal en la trama de linterna de doble entre SSMD y doble cambio para prácticamente todos los objetivos. Por esta razón, se utilizó el criterio único de SSMD para la selección exitosa de este extremo. Los datos de IL-8 diferenciaron en que algunos objetivos tuvieron efectos débiles pero constantes mientras que otros mostraron efectos fuertes pero inconsistentes. Por lo tanto, utilizamos doble cambio y SSMD para criterios de selección exitosa de este extremo. Los valores SSMD utilizados para la selección exitosa de ambos viabilidad celular y datos de IL-8 fueron elegidos porque cortes entre 1 y 1.645 (o -1 y-1.65) lograr descubrimiento falsa baja y tasas de descubrimiento no44. Hubo algunos objetivos que fueron éxitos en la viabilidad celular y datos de IL-8. En estos casos, para su inclusión en la biblioteca de deconvolución se preferencia a esos objetivos que ejercen sus efectos en la misma dirección de mejorar la salud general (mejora de la viabilidad y disminución de IL-8) o exacerbar lesiones (aumento de muerte celular y mayor IL-8). En general, se seleccionaron un total de 250 objetivos entre la viabilidad celular y la IL-8 criterios de valoración para la biblioteca de deconvolución para lesiones de HF. La pantalla principal de lesiones en vitro CP está en curso.

En Resumen, hemos desarrollado la exposición y la cultura condiciones adecuadas para el estudio HTS de lesión ocular por HF y CP. Varias variables en condiciones de exposición y de la cultura fueron refinadas y optimizadas, y los modelos fueron validados para ser conveniente para los estudios HTS de Z' análisis factorial. Además hemos comprobado la utilidad de estos modelos completando la pantalla principal de una biblioteca de siRNA en el modelo de HF. Hay muchas lesiones y enfermedades que son de no o interés limitado al farmacéutico o industria biotecnológica, sustancias tóxicas lesiones por CP y HF incluidos y la llegada de la robótica de sobremesa facilita el estudio HTS de las lesiones y enfermedades en prácticamente cualquier laboratorio . Datos genómicos de alto rendimiento sistemas pueden contribuir considerablemente a la comprensión de los roles que juegan los genes específicos en lesiones o enfermedades que pueden ayudar a enfocar más eficientemente siguen estudios en vitro o en vivo .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Descargo de responsabilidad: las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan la política oficial del Departamento del ejército, Departamento de la defensa o el gobierno de Estados Unidos. Esta investigación fue apoyada por un convenio interinstitucional entre NIH/NIAID y el USAMRICD y en parte por una cita para el programa de participación de investigación postgrado en los Estados Unidos Ejército médico investigación Instituto de defensa química administrada por el roble Instituto de Ridge para la ciencia y la educación a través de un acuerdo interagencial entre el Departamento de energía de Estados Unidos y USAMRMC.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el nacional institutos de salud contrarrestar Programa Interinstitucional Convenio # AOD13015-001. Nos gustaría agradecer a Stephanie Froberg y Peter Hurst por sus esfuerzos y conocimientos en producción de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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References

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Biología número 136 cloropicrina fluoruro de hidrógeno células epiteliales corneales lesión corneal siRNA proyección de alto rendimiento
Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno
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Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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