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Biology

Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.

Abstract

Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique sont généralement favorables car aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. Dans les efforts pour développer des traitements et thérapies pour s’occuper de l’exposition, il peut être important de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de ces blessures. Nous proposons que l’utilisation de criblage à ARN (siRNA) inhibiteur petit haut débit peut être un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides de long et utilisent le silençage voie pour dégrader les ARNm de gènes post-transcriptionnels ayant une homologie avec le siARN. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Le développement et la validation des modèles d’exposition in vitro et des méthodes pour le haut débit (HTS) de dépistage de fluorure d’hydrogène (HF) et chloropicrine-(CP) induites par des blessures oculaires sont présentés dans cet article. Même si nous avons choisi ces deux des substances toxiques, nos méthodes sont applicables à l’étude des autres substances toxiques avec des modifications mineures au protocole exposition toxique. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et la production d’IL-8 ont été choisis comme points de terminaison dans le protocole de dépistage. Plusieurs défis associés au développement de l’exposition de produits toxique et les méthodes de culture cellulaire adaptés aux études HTS sont présentés. La création de modèles HTS pour ces substances toxiques permet pour d’autres études pour mieux comprendre le mécanisme de blessure et d’écran potentiel thérapeutique pour des lésions oculaires chimiques.

Introduction

Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Malheureusement, les traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique ne sont généralement favorables comme aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. L’actuelle stratégie de traitement est non spécifique et comprend principalement des traitements thérapeutiques topiques tels que les lubrifiants, antibiotiques, et cycloplegics suivie d’anti-inflammatoires (par exemple, stéroïdes) une fois la cornée a re-epithelialized1 ,2. Malgré les meilleur traitement thérapeutique options actuelles disponibles, le pronostic à long terme est généralement médiocre en raison d’une opacification cornéenne progressive et une néovascularisation2,3.

Modèles animaux ont traditionnellement été utilisés pour étudier la toxicité chimique et comprendre les mécanismes des blessures. Cependant, les études chez l’animal sont fastidieux et coûteux. Il y a aussi des efforts pour réduire les essais sur les animaux. Par exemple, la législation REACH (EC 1907/2006) dans l’Union européenne a dispositions visant à réduire les essais sur les animaux. Les dispositions comprennent une exigence que compagnies de partagent des données afin d’éviter les animaux tests et obtenir l’approbation de l’Agence des produits chimiques avant d’effectuer les tests proposés sur les animaux. En vertu des dispositions du règlement REACH, l’expérimentation animale doit être un dernier recours. Il y a aussi la réglementation européenne de cosmétiques (ce 1223/2009) qui a éliminé les tests des cosmétiques chez les animaux. Lorsque des études chez l’animal sont effectués, ils sont guidés par les principes des 3R (raffinement, réduction et remplacement), qui établit un cadre pour effectuant des recherches sur les animaux plus humaine, ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés et en utilisant des solutions de rechange non animale Lorsque c’est possible. Pour ces raisons, le domaine de la toxicologie a cherché à adopter les dosages in vitro qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de toxicité et peuvent se faire à plus haut débit4. Il s’agit d’une approche fonctionnelle de toxicologie où les substances toxiques sont définis par leur fonction, et non uniquement par leur composition chimique. Fait un pas de plus, fonctionnelle toxicogénomique cherche à comprendre le rôle que jouent les gènes spécifiques dans les effets des substances toxiques,5. Avec l’application de la technologie de siARN, écrans pour étudier la fonction des gènes dans les réponses moléculaires et cellulaires aux substances toxiques peuvent être faits à haut débit. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides qui profiter du post transcriptionnelle de gènes silencieux parcours présent dans toutes les cellules de mammifères,6. Celles-ci sont synthétiquement faits et conçus pour cibler un gène spécifique. Lorsque introduit dans une cellule, le siARN est traitée et un brin, le brin de guide, est chargé dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC). Le siARN dirige le RISC à une région complémentaire dans une molécule d’ARNm et le RISC dégrade l’ARNm. Cela se traduit par la réduction de l’expression du gène spécifique. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Une telle approche a été utilisée afin de mieux comprendre les mécanismes de la susceptibilité de la ricine et l’induction de la procréation assistée dépendante du CYP1A17,8.

La liste de produits chimiques le terrorisme risque évaluation (CTRA) et les listes de produits chimiques industriels toxiques (TIC) ont détaillé certains produits chimiques basés sur leur toxicité et le potentiel d’être libéré au cours d’un terroriste, guerre ou accident industriel événement9. Nous appliquons un siARN criblage à haute approche toxicogénomiques (HTS) à l’étude de la CTRA liste des substances toxiques, qui ont été identifiés à risque élevé d’usage lors d’un incident terroriste. Toxicologie traditionnelle cherche à comprendre les effets indésirables ayant des produits chimiques sur les organismes vivants ; Cependant, nous avons un désir supplémentaire pour comprendre les mécanismes des blessures afin d’informer de la mise au point des thérapeutiques et des approches thérapeutiques et, éventuellement, à découvrir des molécules qui peuvent être ciblées pour le développement thérapeutique. Cet effort d’une certaine façon peut être considéré comme analogue à l’utilisation de siRNA criblage à haut débit et des essais sur des cellules de base dans la drogue découverte processus10. Une différence majeure est que la découverte de médicaments généralement cherche une cible du singulier pour la découverte thérapeutique alors que dans notre approche, il est assez improbable qu’il y aurait une cible du singulier à haute valeur thérapeutique pour le traitement de l’exposition toxique. Nous prévoyons que tout paradigme de traitement efficace pour l’exposition toxique nécessiterait une approche multi-facettes pour atteindre la haute valeur thérapeutique, et données toxicogénomiques peuvent informer vitale d’un paradigme de traitement efficace.

Benchtop automation apporte la méthodologie haut débit aux laboratoires en dehors de l’industrie pharmaceutique ou de biotechnologie. Les études in vitro à notre Institut ont été historiquement les dosages traditionnels qui sont de faible débit11,12,13. En quelques années, notre laboratoire est passée à l’utilisation de la robotique de benchtop pour effectuer des siARN criblage à haut débit. Nous présentons ici, le raffinement des modèles de cellules oculaires et le développement de in vitro des méthodes d’exposition à l’acide fluorhydrique (HF) et de la chloropicrine (CP) adapté aux siARN criblage à haut débit. Notre objectif est d’identifier des molécules qui régulent la lésion cellulaire en réponse à ces substances toxiques. Les objectifs de la bibliothèque de siARN, que nous avons sélectionné incluent les récepteurs couplés aux protéines G, protéines kinases, phosphatases, protéases, canaux ioniques et autres cibles potentiellement thérapeutiques. HF et le CP ont été sélectionnés pour l’étude en renvoyant les agents liste CTRA avec les rapports ToxNet des accidents industriels pour trouver ceux qui présentent le plus grand risque de blessure oculaire par vapeur exposition9,14. CP (formule chimique Cl3ONC2, numéro CAS 76-06-2) a été utilisé comme un gaz lacrymogène dans WWI15. Il est actuellement utilisé comme un fumigant agricole et fonctions comme un nématicide, fongicide et insecticide16. Fluorure d’hydrogène (HF) est utilisé dans les processus y compris alkylation dans les raffineries de pétrole et de la fluoration électrochimique de composés organiques17. HF (formule chimique HF, numéro CAS 62778-11-4) est un gaz, mais dans sa forme aqueuse est acide fluorhydrique (HFA numéro CAS 7664-39-3). Par conséquent, nous avons choisi d’utiliser HFA dans notre cellule en modèles d’exposition. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et les marqueurs inflammatoires IL-8 ont été choisis comme points de terminaison, parce que les cibles qui sont impliqués dans la lésion cellulaire devraient être reflétées dans la mort cellulaire et la réponse inflammatoire. Plus précisément, si une cible devait jouer un rôle protecteur dans l’exposition toxique, mort cellulaire et/ou la production de cytokines inflammatoires devrait augmenter lorsque l’expression cible est inhibée par les siARN. L’inverse serait vrai pour les cibles qui jouent un rôle négatif. En outre, inflammation chronique semble jouer un rôle dans la pathologie de la cornée après que exposition et intervention dans les voies de la mort cellulaire peuvent améliorer les résultats cliniques2,18.

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Protocol

1. entretien de Culture cellulaire

  1. Croissance de la lignée cellulaire SV40-HCEC à 37 ° C, 5 % de CO2et 90 % d’humidité en DMEM F-12 à 15 % sérum fœtal (SVF), 1 % L-glutamine, 10 facteur de croissance épidermique (EGF) µg/L et de 5 mg/L d’insuline.
  2. Passage de la lignée cellulaire tous les 3 à 4 jours (selon la densité de semis) afin d’assurer que confluence ne dépasse jamais 80 % au cours de l’entretien de la culture.
  3. Détacher les cellules de ballons en utilisant une solution de détachement (14 mL de solution pour chaque flacon de2 150 cm) et une incubation à 37 ° C pendant pas plus de 8 min.
  4. Neutraliser la solution de détachement avec un volume égal de milieu de culture cellulaire et les cellules de tubes coniques de 50 mL de granule par centrifugation pendant 7 min à 160 x g.
  5. Resuspendre le culot dans un milieu (20 mL pour chaque flacon de2 150 cm).
  6. Compter les cellules avec un compteur de cellules portatif automatisé et de semences dans des flacons de nouveau à une densité qui leur permettra de se développer pendant 3 à 4 jours sans dépasser 80 % confluence.

2. les cellules plaque d’expérimentation

  1. Vérifier les flacons du SV40-HCECs par microscopie lumineuse de contraste de phase pour assurer cette confluence est inférieur à 80 % et à évaluer la santé générale de cellule.
  2. Détacher, pellet, resuspendre et compter SV40-HCECs de flacons comme décrit aux points 1.3 à 1.6 d’entretien de la culture cellulaire. Milieu de SV40-HCEC contenant hydrocortisone 0,5 µg/mL (moyenne HCORT) permet de remettre en suspension les cellules.
  3. Dans une bouteille jetable de moyenne, préparer une suspension de SV40-HCECs à 17 857 cellules/mL dans le milieu HCORT préchauffé.
    1. Préparer un volume de suspension cellulaire suffisant pour le nombre de plateaux pour l’ensemencement.
    2. Un minimum de 14 x 96 plats avec des cellules pour chaque plaque de bibliothèque de siARN à étudier les semences.
  4. Agiter le flacon pour suspendre les cellules uniformément, versez un volume suffisant de la suspension cellulaire dans un réservoir sur le nid de l’agitateur orbital d’un gestionnaire automatisé de liquid et conservez le flacon contenant la suspension de cellules sur un 37 ° C, le plateau de réchauffement au cours de l’électrodéposition de cellule processus.
  5. Utiliser le gestionnaire de liquid automatique pour ajouter des cellules à plaques à une densité de 1000 cellules par puits (5000 cellules/cm2) en 70 µL de milieu / puits d’une plaque de 96 puits. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
    1. Exécutez l’agitateur orbital à 100 tr/min sans cesse durant le processus d’amorçage.
    2. Mélanger la suspension cellulaire trois fois (140 µL mix volume) en utilisant le gestionnaire automatisé de liquid.
    3. Aspirer 140 µL de la suspension cellulaire et administrer 70 µL dans chaque puits de deux plaques de culture cellulaire.
    4. Répétez les étapes 2.5.3 et 2.5.4 jusqu'à ce que toutes les plaques ont été ensemencées avec des cellules.
    5. Remplir le réservoir de suspension de cellules que nécessaire au cours du processus d’amorçage.
  6. Après que les plaques ont été ensemencés, retirer le gestionnaire automatisé de liquid et les incuber 30 min à température ambiante avant de les transférer dans un incubateur de culture cellulaire.
  7. Évaluer la densité cellulaire de chaque puits pour chaque plaque le lendemain matin, à l’aide d’un système automatisé d’imagerie qui est logé dans un incubateur de culture cellulaire et exclure les plaques de l’étude qui ont des puits intérieurs qui ne sont pas entre 15 % et 22 % anastomosé.

3. transfecter les cellules avec des siARN

  1. Acquérir des plaques bibliothèque siARN auprès du fournisseur pré configuré pour contenir 80 cibles de siARN par plaque (voir Figure 4), avec des colonnes 1 et 12 reste vide.
  2. Reconstituer la plaque de bibliothèque de siARN avec siARN tampon à une concentration finale de 2 pmol/µL à chaque puits d’ARNsi selon instructions19 les directives du fabricant.
  3. Transfecter les cellules 24h après l’ensemencement avec 4 pmol/puits de siRNA et 0,3 µL/puits de réactif de transfection. Exécutez toutes les étapes selon le protocole du fabricant transfection réactif (voir Figure 4 schéma)20.
    1. Effectuer toutes les transfections à l’aide d’un gestionnaire automatisé de liquid et utiliser un 25 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits qui vont être transfectées.
    2. Utiliser le dessus la moitié de la plaque de bibliothèque à transfecter une série de six planches répétées s’est dénommée le « Top plaque Set » (six réplicats par siRNA, n = 6).
    3. Utilisez le fond de la moitié de la plaque de bibliothèque à transfecter un ensemble différent de six planches répétées s’est dénommée le « bas plaque Set » (six réplicats par siRNA, n = 6).
    4. Utiliser le terme « Plaque Full Set » pour décrire les 12 plaques cellulaires qui ont été transfectées avec les siARN bibliothèque.
    5. Transfecter puits B2-B6 de toutes les plaques dans la plaque pleine sertie de siARN mélange négatifs après que tous les jeux de plaque supérieure et inférieure ont été transfectées avec le siARN de bibliothèque.
    6. Aussi transfecter puits B2-B6, d’un autre deux plaques, qui ne reçoivent pas de bibliothèque siRNA et serviront de témoins non exposés (un pour l’ensemble de la plaque supérieure) et un pour le jeu de plaque inférieur, avec piscine négatif siRNA.
  4. Incuber toutes les plaques de cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant 4heures après que tous les mélanges de transfection ont été ajoutés et le mélange par gentle touchant toutes les heures.
  5. Utiliser un gestionnaire automatisé liquid pour laver toutes les loges des plaques deux fois avec pré chauffé HCORT milieu dilué 1:5 dans du PBS. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
    1. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans un réservoir de déchets.
    2. Ajouter à chaque bien 100 µL/puits préchauffé moyen HCORT dilué 1:5 PBS en laquelle est contenue dans un réservoir différent à un volume suffisant de pour le nombre de plaques.
    3. Répétez les étapes 3.5.1 et 3.5.2, pour chaque plaque.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
      2. Remplissage du réservoir avec support HCORT dilué 1:5 dans du PBS selon les besoins.
    4. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans le réservoir de déchets.
  6. Refeed tous les puits des plaques avec 100 µL/puits préchauffé HCORT moyen, ce qui est contenu dans un réservoir différent à un volume suffisant de support pour le nombre d’assiettes.
    1. Remplir le réservoir avec support si nécessaire.
  7. Utilisation de puits C2-C6 de toutes les plaques comme témoins non transfectées.
  8. Garder le puits B7-B11 et C7-C11 de toutes les plaques non transfectées pour être utilisé comme médicament et véhicule contrôles d’exposition toxique.

4. refeed les cellules suivantes jour

  1. Utilisez un gestionnaire automatisé de liquid pour refeed tous les puits des plaques. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
    1. Aspirer 100 µL de chaque puits et que jeter dans un réservoir de déchets.
    2. Chaque refeed bien avec 100 µL/puits préchauffé HCORT moyen qui est contenue dans un réservoir différent et a un volume suffisant de support pour le nombre d’assiettes à être réalimentés.
    3. Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 au besoin pour refeed toutes les plaques de la cellule.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
      2. Remplir le réservoir avec support si nécessaire.

5. contrôle positif Addition

  1. Deux jours après la transfection et deux heures avant l’exposition, préparer une solution de 62,5 µM de la cardamonin de contrôle positif dans le milieu de la HCORT être utilisé pour des expositions HFA et ajouter à la ligne B d’un réservoir de dilution de 8 rangs.
    1. Pour l’exposition de CP, préparer et utiliser une solution de 25 µM de SKF 86002.
    2. Préparer un volume de contrôle positif suffisant pour le nombre de plaques à tester.
  2. Préparer une solution de 0,625 % de DMSO dans un milieu HCORT (contrôle du véhicule) et ajouter à la ligne C du même réservoir.
    1. Pour l’exposition de CP, préparer et utiliser une solution de 0,5 % de DMSO.
    2. Préparer un volume de contrôle du véhicule suffisante pour que le nombre d’assiettes à tester.
  3. Utiliser le gestionnaire automatisé de liquid pour ajouter des contrôles positifs et véhicule à puits B7-B11 et C7-C11 de chaque plaque cellulaire et utiliser une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits qui recevront les contrôles positifs et véhicule.
    1. Retirer 10 µL de milieu de puits B7-B11 et C7-C11 de chaque plaque cellulaire et jetez-le en lignes G et H du réservoir dilution de 8 rangs.
    2. Transférer 10 µL des contrôles positifs et véhicule dans ces puits et mélanger 3 fois.
  4. Remettez ces plaques cellulaires dans l’incubateur.
  5. Répétez les étapes 5.3 à 5,4 jusqu'à ce que toutes les plaques de la cellule ont reçu positifs et les commandes du véhicule.

6. HF exposition des cellules en culture

ATTENTION : HFA est corrosifs et toxiques.

  1. Effectuer toutes les opérations de l’exposition aux produits chimiques dans une hotte chimique, port de gants en nitrile double, un manteau de laboratoire, les lustrines jetables en polyéthylène et lunettes de sécurité.
    1. Acquérir HFA comme une solution de 48 %.
    2. Diluer la HFA à 1 % avec de l’eau ultrapure et stocker en aliquotes de 5 mL en flacons de 10 mL mur épais polyéthylène pour améliorer la sécurité.
    3. Décontaminer les pointes de pipette et réservoirs qui ont contact avec HFA et les reste HFA liquide avec 2,5 % gluconate de calcium avant son élimination dans le flux de déchets dangereux.
  2. Pour chaque plaque de bibliothèque de siARN incriminés, préparer une solution de moyen de HFA 0,0036 % en ajoutant 288 µL de 1 % HFA à 80 mL de milieu HCORT pré chauffé dans un flacon de 150 mL.
    1. Agiter le flacon et laisser incuber la HFA diluée dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 10 min.
  3. Mélanger la solution moyenne HFA encore en agitant le flacon et ajoutez la solution moyenne HFA à un réservoir de réactif sur un chauffe-plat.
  4. Effectuer l’exposition avec deux techniciens travaillant en tandem.
    1. Avoir le technicien sur le µL d’aspiration droite 100 dans chacun des puits intérieurs d’une plaque de cellules à l’aide d’une pipette à 12 canal et passez ensuite la plaque pour le technicien sur la gauche.
    2. Avoir le technicien à gauche ajouter 100 µL / puits de la solution moyenne HFA.
    3. Répétez les étapes 6.4.1 et 6.4.2 pour toutes les plaques de cellules susceptibles d’être exposés à la substance toxique.
    4. Aussi répéter les étapes 6.4.1 et 6.4.2 pour plaques de commande non exposés, utilisant un milieu frais HCORT au lieu de la solution moyenne HFA.
  5. Placer les plaques dans l’incubateur de hotte des fumées chimiques pendant 20 min et puis retournez-les à l’incubateur de culture cellulaire.
  6. Répétez l’étape d’addition du contrôle positif (pas de 5.1 à 5.5) comme précédemment indiqué une fois que toutes les plaques ont été exposés et retournés à l’incubateur de culture cellulaire.

7. CP exposition des cellules en culture

ATTENTION : Le CP est extrêmement toxique et irritant.

  1. Effectuer toutes les opérations de l’exposition aux produits chimiques dans une hotte chimique, port de gants en nitrile double, un manteau de laboratoire, les lustrines jetables en polyéthylène et lunettes de sécurité.
    1. Acquérir des CP.
    2. Diluer le CP à 5 % dans le DMSO et stocker en portions de 10 mL en flacons de 10 mL à scintillation pour améliorer la sécurité.
    3. Décontaminer les pointes de pipette et réservoirs qui sont venus en contact avec des CP et des reste CP liquide avec du bisulfite de sodium 2,5 % avant leur élimination dans le flux de déchets dangereux.
  2. Préparer un volume suffisant de préchauffé moyen HCORT contenant 1 x Pen/Strep et PBS préchauffé pour le nombre de plateaux d’être exposés.
  3. Pour chaque jeu Top Set plaque ou plaque de fond, ajouter 8,04 µL de 5 % CP dans le DMSO à une portion de 50 mL de préchauffé moyen HCORT et mélanger bien pour une concentration finale de CP de 0,0008 %. Boucher le tube hermétiquement et incuber la solution dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 1 h.
    1. L’ajout du CP à la 50 ml de milieu du temps afin que chacun exposé Top plaque Set et la valeur de la plaque de fond reçoit toxique exactement 1 h après que le CP a été ajouté à l’aliquote de 50 mL de milieu.
  4. Enlever un Top Set plaque et la plaque de 1 contrôle non exposés de l’incubateur de culture cellulaire et placez-les dans la hotte de laboratoire chimique vers la fin de la période d’incubation.
  5. Mélanger la solution de CP en renversant le tube et décanter ensuite à un réservoir à la fin de la période d’incubation de 1 h.
  6. Effectuer l’exposition avec deux techniciens travaillant en tandem.
    1. Avoir le technicien sur le µL d’aspiration droite 100 dans chacun des puits intérieurs d’une plaque de cellules à l’aide d’une pipette à 12 canal et passez ensuite la plaque pour le technicien sur la gauche.
    2. Avoir le technicien à gauche ajouter 100 µL / puits de la solution de milieu de CP.
    3. Répétez les étapes 7.6.1 et 7.6.2 pour toutes les plaques de la cellule de la plaque Top Set d’être exposés à la substance toxique.
    4. Aussi répéter les étapes 7.6.1 et 7.6.2 pour plaques de commande non exposés, utilisant un milieu frais HCORT au lieu de la solution de milieu de CP.
  7. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C sous la hotte chimique pendant 10 min.
  8. Ajouter un volume suffisant de PBS et HCORT support contenant 1 x Pen/Strep pour réservoirs à réactifs vers la fin de la période d’incubation de 10 min.
  9. Enlever la solution de CP de plaques cellulaires à l’aide d’une pipette à 12 canal et remplacez-le par 100 µL / puits de PBS à la fin de la période d’incubation de 10 min.
  10. Immédiatement retirer les PBS de plaques cellulaires et remplacez-le par 100 µL / puits de milieu HCORT contenant 1 x Pen/Strep.
  11. Aussi répéter les étapes 7.9 et 7.10 pour les plaques de contrôle non exposés.
  12. Retourner les plaques de la cellule à un incubateur de culture cellulaire standard.
  13. Répétez les étapes 7.3 à 7.12 pour le jeu de plaque de fond.
  14. Répétez l’étape d’addition du contrôle positif (pas de 5.1 à 5.5) comme décrit plus haut une fois que toutes les plaques ont été exposés et retournés à l’incubateur de culture cellulaire.

8. collecte et analyse de viabilité de cellules de l’échantillon

  1. Vingt-quatre heures après l’exposition, préparer une solution de substrat MTT de 0,5 mg/mL dans du PBS contenant 10 g/L de glucose et chauffé à 37 ° C,21. Préparer 10 mL de substrat pour chaque plaque à doser.
  2. Pour le nombre de plaques à doser, ajouter un volume suffisant de solution de substrat MTT jusqu'à un réservoir sur un gestionnaire automatisé de liquid.
  3. Utilisation au maître liquid automatisé pour recueillir l’échantillon et ajoutez le substrat MTT au moyen d’une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes. Préconfigurer des boîtes de pointe pour traiter uniquement ces puits à doser.
    1. Moyen d’aspirat 95 µL du provenant des puits de 60 intérieures de la plaque cellulaire et dépôt 42,5 µL dans chacune des deux plaques 384 puits de stockage.
    2. Immédiatement ajouter 100 µL / puits de la solution de substrat MTT dans les plaques de la cellule et les incuber à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 1,5 h.
    3. Remplir le réservoir avec la solution de substrat MTT selon les besoins.
  4. Incuber les plaques de la cellule à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 1 h.
  5. Sceller les plaques 384 puits de stockage et les stocker à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
  6. Répétez les étapes 8.3 à 8.5 pour tous les jeux de plaque supérieure et inférieure et les contrôles associés non exposés.
    1. Réutiliser les conseils entre les répétitions si vous le souhaitez, mais Lavez-les lors de l’ajout de solution de substrat MTT et quand passer la plaque fixe.
  7. Après l’incubation de 1 h, ajouter un volume suffisant de DMSO à un réservoir sur un gestionnaire automatisé de liquid.
  8. Utiliser le gestionnaire automatisé de liquid pour ajouter DMSO et utiliser une pipette de 50 µL/s de vitesse pour toutes les étapes.
    1. Aspirer 100 µL dans chacun des puits intérieurs des plaques cellulaires et jeter la solution de substrat MTT dans un réservoir de déchets.
      1. Vider le réservoir de déchets selon les besoins.
    2. Superposer chaque puits avec 100 µL DMSO.
      1. Remplissez le réservoir de DMSO comme nécessaire.
  9. Agiter les plaques sur un agitateur de plaque pendant 3 min.
  10. Mesurer l’absorbance à 570 et 690 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque.
  11. Soustraire l’arrière-plan et calculer la % de la viabilité cellulaire en divisant les valeurs d’absorbance exposées par les témoins non exposés. Utilisez le contrôle de siARN moyen mélange négatifs non exposés pour calculer la viabilité cellulaire % pour toutes les cibles.

9. IL mesure-8 Concentration dans les surnageants de Culture cellulaire

  1. Mesure la concentration d’IL-8 dans les surnageants de culture de cellules en utilisant un non laver axée sur la perle de dosage selon instructions22 les directives du fabricant. Créer une disposition de plaque de dosage pour accueillir les échantillons et la courbe d’étalonnage.
  2. Enlever les plaques 384 puits de stockage du congélateur-80 ° C, décongeler à température ambiante et centrifuger brièvement les plaques pour recueillir l’échantillon dans le fond des puits.
  3. Pour le nombre de plaques d’essai à exécuter, faire un volume suffisant d’accepteurs anti-IL-8 perles et des anticorps anti-IL-8 biotinylé dans du tampon fourni dans le kit. Utiliser le ratio de 50 µL de perles accepteur anti-IL8 et 50 µL d’anticorps anti-IL8 biotinylé à 9,9 mL de tampon.
    1. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter le mélange de perle/anticorps à une plaque noire 384 puits stockage.
      1. Ajouter accepteur perle/anticorps aux puits désignées pour être utilisée pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
      2. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
  4. Reconstituer le standard de l’IL-8 à 1000 pg/mL à l’aide de milieu de culture cellulaire contenant µM 354 NaCl. Faire un volume suffisant pour le nombre de plaques de test à exécuter.
  5. Faire huit double série de dilutions de la courbe standard.
  6. Ajouter la courbe d’étalonnage en triple exemplaire aux puits d’une plaque noir stockage 384 puits selon le schéma dosage appropriés. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
    1. De même, ajoute le milieu de culture cellulaire contenant µM 354 NaCl avec aucun IL-8 pour la mesure de l’arrière-plan.
  7. Utilisez un gestionnaire automatisé de liquid pour effectuer le test. Utilisez les boîtes de pointe préconfiguré pour traiter uniquement les puits désignés par le schéma test. Utiliser un 50 µL/s vitesse de pipetage pour toutes les étapes.
    1. Transfert 8 µL du mélange accepteur perle-anticorps dans les puits des plaques 384 puits peu profonds dosage bien blanc.
      1. Ajouter uniquement dans les puits désignés pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
    2. Transfert 2 µL de la courbe d’étalonnage dans les puits appropriés des plaques selon le schéma dosage dosage de puits peu profonds.
    3. Préparer une solution de NaCl de 3,54 M et ajouter un volume suffisant pour le nombre de plaques à doser pour un réservoir profond sur le gestionnaire automatisé de liquid.
    4. Ajuster la concentration en sel des échantillons doit correspondre à celui de la courbe d’étalonnage en transférant 4,5 µL de la solution de NaCl sur les échantillons dans les plaques noires 384 puits stockage.
    5. Mélanger les échantillons trois fois en utilisant un mélange volume 30 µL et transfert 2 µL des échantillons pour le blanc peu profond bien doser plaques selon le schéma test.
      1. Changer de conseils entre les plaques de l’échantillon.
    6. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 1 heure.
    7. Pour le nombre de plaques d’essai à exécuter, faire un volume suffisant de perles accepteur dans du tampon d’essai. Utiliser le ratio de 200 µL de perles accepteur secondaire à 12,3 mL de tampon.
    8. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter perles secondaires à une plaque noire 384 puits stockage.
      1. Ajouter les perles secondaires aux puits désignées pour être utilisée pour les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test.
      2. Ajouter un volume suffisant par puits pour le nombre de plaques de test à exécuter.
    9. En utilisant le gestionnaire automatisé de liquid, transférer 10 µL de perles secondaires dans les puits des plaques blanches dosage bien 384 puits peu profonds.
      1. Ajouter uniquement dans les puits qui ont reçu les échantillons et la courbe d’étalonnage selon le schéma test et lavez les pointes entre chaque plaque.
    10. Incuber pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante.
  8. Sceller le dosage plaques avec clairement des joints de plaque et numériser à l’aide d’un lecteur compatible avec le test. Utilisez 0,2 mm distance entre la plaque et détecteur et temps d’excitation de ms 180 550 ms temps de mesure pour l’analyse.
  9. Importer les données brutes de l’IL-8 épreuves dans un tableur.
  10. Utiliser la courbe automatisé pour la courbe d’étalonnage de l’IL-8 épreuves et puis convertir les fichiers RAW en pg/mL pour chaque échantillon.

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Representative Results

Élaboration de méthodes d’exposition

Nous avons affiné et évalué la pertinence de la ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines SV40-HCEC pour utilisation dans les études HTS. SV40-HCEC ont été immortalisé à l’aide de l’antigène de T grand SV-40 et étaient un cadeau du namawa Pal23. Il y avait trop de variables explorées dans le développement de méthodologie exposition de présenter avec concision dans les présentes, et donc, seulement quelques échantillons des constatations que nous pensons peuvent être plus largement applicables à plusieurs substances toxiques sont présentés.

Exposition toxique par Spike ou échange moyen

Au départ, nous avons cherché à exposer les cellules de fortification 5 µL d’un travail de concentration de substance toxique, dilué dans l’eau, une solution saline ou un support en 95 µL de milieu déjà présent dans chaque puits de cellules dans une plaque à 96 puits pour atteindre la concentration finale souhaitée. SV40-HCEC ont été exposés à l’aide de ce pic exposer/refeed méthodologie à 1 X LD50 de HFA pendant 24 h (1 X DL50 = 0,02 % HFA par cette méthode lorsque la pointe de la santé pour tous a été diluée dans le milieu), et le puits ont été réalimentés avec frais moyen 10 min plus tard. Après 24 h, les cellules ont été superposées avec substrat MTT, tel que décrit ci-dessus pour l’analyse de viabilité de cellules. Images ont été capturées par photomicrographie avant la solubilisation des cristaux de formazan avec le DMSO. Un examen attentif des puits a montré qu’une grande partie de la mort cellulaire a été localisée au même endroit, et c’est en dépit du fait que la plaque a été agitée pendant 15 s immédiatement après le crampon a été ajouté à la plaque entière (Figure 1 a). Ce phénomène a été observé lorsque l’épi a été ajouté à la partie inférieure de la bien ou quand ajouté au ménisque. Une image de grossissement plus élevée de cette zone à l’aide de spectacles de contraste de phase que les cellules sont encore présents dans la zone non souillées enregistrée par MTT (Figure 1 b). Nous avons aussi testé un échange moyen exposer/refeed méthodologie où moyen a été enlevée par les puits, remplacés par le milieu de culture cellulaire contenant la 1 X DL50 de HFA (1 X DL50 = 0,035 % HFA par cette méthode) et puits ont été réalimentés avec frais moyen 10 min par la suite. Après 24 h, les cellules ont été superposées avec substrat MTT, tel que décrit ci-dessus. Cette méthode atteint une apparemment plus même mort réponse cellulaire des cellules dans chaque puits (Figure 1C et 1D). Témoins non exposés sont fournis comme référence et ne montrent aucune des zones localisées de la mort cellulaire (Figure 1e et 1f). Pour les expositions de CP, la méthode spike n’a pas entraîné dans une large mesure de la mort cellulaire localisée au même endroit dans chaque puits ; Cependant, la réponse de mort cellulaire était plus logique d’une itération à l’autre en utilisant la méthode d’exposition moyenne change (données non présentées).

Figure 1
Figure 1 : La mort induite par spike et méthodes change moyen de l’exposition des cellules. Toutes les images ont été capturée 1,5 h après addition du substrat MTT. Panneau (a) est une image du champ lumineux de SV40-HCEC exposé à la pointe HFA exposer/refeed méthodologie. Panneau (b) est un grossissement plus élevé du puits même dans panneau (a) à l’aide de contraste de phase. Panneau (c) est une image de champ lumineux de SV40-HCEC exposé par échange moyen exposer/refeed méthodologie. Panneau (d) est un grossissement plus élevé du puits même dans panneau (c) à l’aide de contraste de phase. Panneaux (e) et (f) sont d’un champ non bien exposé, lumineux et un grossissement supérieur contraste phase, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Stabilité de produits toxique dans le milieu

On a fait observer que, une fois dilué dans le milieu, la cytotoxicité apparente de HF et CP change et puis se stabilise. HFA a été dilué dans un milieu à 0,0036 % et incubé à 37 ° C pendant 1 à 60 min avant d’exposer le SV40-HCECs comme décrit ci-dessus. Pour HFA, la cytotoxicité augmente au cours des 5 premières minutes que HFA est dilué dans le milieu et est ensuite stable pendant au moins une heure (Figure 2 a). Une façon ANOVA suivie de Test de comparaison Multiple de Dunnett a montré que la viabilité cellulaire % à tous les points dans le temps ne différaient significativement depuis le point de temps 1 min. Il n’y a aucune différence significative entre le min de 2.5 à 60 points dans le temps. CP est organique et est tout d’abord dilué à 5 % dans le DMSO. Il a été ensuite dilué dans un milieu 0,0008 % et incubé à 37 ° C pendant 5 à 120 min avant d’exposer le SV40-HCECs comme décrit ci-dessus. Une fois dilué dans le milieu, la cytotoxicité du CP diminue de plus de 60 min et puis se stabilise pendant au moins la prochaine h (Figure 2 b). Une façon ANOVA suivie de Test de comparaison Multiple de Dunnett a montré que la viabilité cellulaire % à tous les points dans le temps ne différaient significativement depuis le point de temps 5 min. Il n’y a aucune différence significative entre le min de 60 à 120 points dans le temps.

Figure 2
Figure 2 : Perte toxique de cytotoxicité dans les moyennes dilutions. Les données sont exprimées en moyenne le pourcentage de viabilité ± SD (n = 6). Panneau (a) montre la stabilité de la cytotoxicité HFA 0,0036 % lorsque dilué dans le milieu et incubé à température ambiante pendant 1 à 60 min avant d’exposer le SV40-HCECs comme décrit ci-dessus. Panneau (b) montre la stabilité de la cytotoxicité de CP de 0,0008 % lorsque dilué dans le milieu et incubés à 37 ° C pendant 5 à 120 min avant d’exposer le SV40-HCECs comme décrit ci-dessus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

/ Refeed d’exposer ou d’exposer uniquement

Un autre facteur étudié dans la méthodologie de l’exposition était s’il faut : A) ajouter la substance toxique pour 10 min, laver, refeed, enlever les plaques de la hotte chimique et incuber pendant 24 heures dans une étuve de culture cellulaire standard (méthode exposer/refeed) ; ou B) ajouter la substance toxique, laissez-le sur, enlever les plaques de la hotte chimique et incuber pendant 24 heures dans une étuve de culture cellulaire standard (exposer seule méthode). La sécurité est un facteur important qu’il ne soit pas permis d’enlever les plaques de cellules qui contiennent toxique dilué de la hotte chimique parce que la substance toxique est gazeux et exposer le personnel. Un examen connexe est le nombre de plateaux d’être exposés à un moment donné depuis les plaques plus il y a, il y aura un plus grand volume les émissions gazeuses. Dans nos méthodes HTS, nous exposons les plaques de 48 x 96 puits dans une journée d’étude donnée. Nous avons placé des plaques de culture cellulaire exposée dans un sac scellé et puis utilisé tubes détecteurs gaz colorimétrique pour évaluer CP et HF dégagement de plaques apparentes. Nous avons trouvé que l’exposant 48 plaques 1 x DL50 de HFA n’entraînait pas dans n’importe quel détectable HF dégagement (données non présentées). Pour les expositions de CP, nous avons constaté qu’il y avait assez CP dégagement de 48 plaques exposés à 1 x DL50 de présenter au moins une certaine préoccupation de sécurité (données non présentées). Exposer/refeed tant exposer uniquement les méthodes ont été évalués pour les risques de santé pour tous. SV40-HCEC cellules ont été exposées à la HFA et viabilité a été évaluée par analyse de MTT 24 h après l’exposition. Dose réponse itérations ont été effectuées à des dates différentes. Par rapport à la méthode à exposer/refeed (Figure 3 a), nous avons constaté que le seul moyen d’exposer produit plus uniformes résultats d’analyse viabilité cellulaire (Figure 3 b). Par conséquent, cette méthode a été sélectionnée dans le cadre de la méthodologie de l’exposition finale. Pour le CP, des différences dans la cohérence des résultats de test de viabilité cellulaire entre les deux méthodes d’exposition différents pas peuvent être évaluées puisque les préoccupations de sécurité empêchaient de retirer les plaques de CP exposé de la hotte chimique pour 24 h d’incubation dans un incubateur de culture cellulaire standard.

Figure 3
Figure 3 : Cohérence d’exposition avec exposer/refeed et exposer uniquement les méthodes. Les données sont exprimées en moyenne le pourcentage de viabilité ± SD (n = 6). (a) HFA a été dilué dans un milieu, incubé à température ambiante pendant 10 min et ensuite utilisé pour exposer des cellules par la méthode à exposer/refeed. (b) HFA a été dilué dans un milieu, incubé à température ambiante pendant 10 min et ensuite utilisé pour exposer le SV40-HCEC par la seule méthode d’exposer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Affinement du modèle cellulaire

Constituants moyens

Nous avons respecté les conditions de culture mis en place par les enquêteurs originaires de passage et d’entretien de ces lignées cellulaires ; Cependant, nous avons modifié les pour les cellules de l’expérimentation. Le milieu de culture cellulaire, selon les enquêteurs d’origine pour les cellules de SV40-HCEC n’inclut pas d’hydrocortisone, mais nous avons eu recours à un faible niveau d’hydrocortisone (0,5 µg/mL) au cours d’études sur l’exposition pour réprimer le crampon occasionnel dans la production de cytokines chez naïve SV40-HCEC (données non présentées) qui lésés d’analyse des données d’une itération à l’autre durant les études de raffinement.

Stabilité phénotypique

Au cours de nos études de raffinement modèle cellulaire, nous avons constaté que le SV40-HCEC commencent à ont diminué la production de cytokines en réponse à l’exposition de produits toxique vers le numéro de passage 60 (données non présentées). Pour cette raison, nous maintenu cryostocks des cellules de passage bas, exécuté toutes les études utilisant des cellules sous le numéro de passage 60 et surveiller la production de cytokines pendant le processus de présélection.

Présentation de la plaque

Une source importante de la variabilité expérimentale dans des études de haut débit est effets de lisière de plaques multipuits. Nous avons constaté que les cytokines des cellules dans les puits de bord ne concordaient pas avec, ou équivalent à, puits intérieurs dans les deux HFA et CP studies (données non présentées). Médian polonais des données, un exercice statistique utilisé pour minimiser les effets de bord sur un ensemble de données, n’a pas suffisamment résolu le problème (données non présentées). Donc, aucun puits de bord de plaque cellulaire ont été utilisés pour l’expérimentation ou de contrôles (Figure 4).

Figure 4
Figure 4 : Bibliothèque et plaque cellulaire mises en. Les zones ombragées grises dans le schéma bibliothèque représentent les puits contenant des siARN. Les puits blancs sont vides. Les 40 cibles de lignes A-D de la plaque de la bibliothèque sont utilisés dans le « Top plaque Set », et les 40 cibles de lignes E à H de la plaque de la bibliothèque sont utilisés dans le « bas plaque Set ». Puits B2-B6 sont utilisés pour les contrôles de siARN mélange négatifs. Puits C2-C6 sont non transfectées. Puits B7-B11 sont utilisés pour cardamonin ou médicaments de contrôle positif 86002 SKF tel que décrit, et puits C7-C11 sont utilisés pour le contrôle de DMSO. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans la Validation des modèles in Vitro pour HTS

Nous avons utilisé des Z' facteur analyse visant à déterminer la pertinence du SV40-HCEC pour utilisation dans les études HTS car ce test statistique est utilisé pour déterminer la qualité de dosage pour HTS24. Pour HF Z' facteur de l’analyse, les cellules ont été injectées à 1,25 x 103 cellules/puits, transfectées avec siARN mélange négatifs (comme décrit ci-dessus) 24 h après l’ensemencement et exposée à 48 h après la transfection à 0,0036 % HFA (1 x DL50), n = 3. Pour CP Z' facteur de l’analyse, les cellules ont été ensemencées transfectées comme décrit ci-dessus et exposés 48 h après la transfection de 0,0008 % CP (1 x DL50), n = 5. Un grand n a été utilisé pour les études de CP en raison de la plus grande variabilité dans ce modèle d’exposition. Z' facteur a été calculé pour l’IL-8 expression données provenant des cellules non exposées vs exposés et mélange négatifs siARN transfectés vierges vs exposés cellules pour les expositions de CP et de la santé pour tous. Nous avons aussi analysé pour déterminer s’il y avait un effet sur la qualité de l’analyse en raison de la transfection de siARN des cellules non transfectées. Nombre d’itérations de l’études de validation effectuée tout en affinant les conditions d’exposition et de la culture dans le but de maximiser le Z' facteur de résultats. SV40-HCEC passé validation et la plupart des itérations Z' facteur à une valeur supérieure à 0,50 pour les expositions de HF (tableau 1) et les expositions de CP (tableau 2). Chaque réplicat dans ces tableaux provenait de cellules cultivées sur des jours différents.

Groupes d’exposition Z'-Factor Analysis
Rép. #1 Rép. #2 Rép. #3
Contrôle négatif HF-exposés vs non exposé contrôle négatif 0,68 0,5 0,56
HF-exposés vs naïf 0,4 0,68 0,56

Tableau 1 : Exposition HFA SV40-HCEC Z' facteur analyse d’IL-8

Groupes d’exposition Z'-Factor Analysis
Rép. #1 Rép. #2 Rép. #3
Contrôle négatif CP-exposés vs non exposé contrôle négatif 0,6 0,18 0,46
CP-exposés vs naïf 0,42 0,29 0,42

Tableau 2 : SV40-HCEC CP exposition Z' facteur analyse d’IL-8

SiARN primaire dépistage résultats de HFA cellules endommagées

Études d’optimisation de transfection ont été exécutés avant le dépistage, et siARN ciblant la cyclophiline b a été utilisé pour ces études. Un test de détection in situ ARN a été utilisé pour mesurer les niveaux d’ARNm cyclophiline b, et un analyseur de contenu élevé a été utilisé pour quantifier les résultats. Nous avons atteint près de 90 % coup de masse de la cyclophiline b et ne dépasse généralement pas de perte de cellules de 5 à 10 % avec 4 pmol d’ARNsi/puits et réactif de transfection µL/puits de 0,3 (données non présentées). Des quantités plus élevées de siARN a réellement pauvres cyclophiline knockdown de b (données non présentées). Des niveaux similaires de précipitation ont été atteints avec 1,2 pmol/puits de siARN et réactif de transfection µL/puits de 0,09, mais nous avons décidé d’utiliser 4 pmol / puits afin de répondre à toutes les cibles qui pourraient exiger une plus grande quantité de siARN pour atteindre knockdown efficace. Cinétique knockdown cible ont également été évaluées, et il a été constaté que knockdown cible maximale par transfection après deux jours (données non présentées). Cible knockdown uniformité entre la plaque a été également validées (données non présentées). Les anti-inflammatoires non stéroïdiens cardamonin et SKF 86002 sont utilisés comme témoins positifs pour l’inhibition de la production de cytokines pour exposition HFA et CP, respectivement. Ces dernières ont été sélectionnées en testant une variété de composés ayant des propriétés anti-inflammatoires connues dans les cellules exposées. La dose utilisée lors des études de dépistage a été sélectionnée par les études d’optimisation de dose réponse.

Le siARN haut débit stratégie, nous avons utilisé de dépistage est normalisé et comporte trois étapes principales : dépistage 1) primaire, déconvolution bibliothèque 2) et la validation de la cible 3). Dans le dépistage primaire, le phénotype de chaque cible est évalué en utilisant un mélange de siARN différentes séquences comme réactif unique pour cibler chaque gène. Les cibles sont ensuite sélectionnés vers le bas à déconvolution de bibliothèque. Dans cette étape, chacun des siARN différentes séquences qui sont mis en commun pour cibler chaque gène dans le dépistage primaire sont testés séparément. Cibles de subissent une autre sélection en validation de cibles dont le phénotype de la cible est confirmé avec la drogue, restauration de phénotype et/ou des siARN d’un autre fournisseur. Pour notre écran principal, nous avons élu effectuer un écran sup-génomique ciblé plutôt que d’un écran large de génome pour des raisons d’économie. Données de microarray de HF et CP blessé cornées de souris et Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ont été utilisées pour concentrer notre bibliothèque cible pour l’écran principal (manuscrits en préparation). Brièvement, cornées de souris ont été exposées à des vapeurs toxique à l’aide d’une coupe vapeur similaire aux méthodes précédemment décrites,25. Cornée apparentes boutons et contrôles ont été récoltés à divers temps points après l’exposition. L’ARN a été isolé, et la qualité et la quantité d’ARN surveillé. Toutes les expériences de microarray ont été réalisés selon protocole26 les directives du fabricant. Intensités du signal brut ont été normalisées et analysées par analyse en composantes principales (PCA) pour déterminer les sources importantes de variabilité des données. Les gènes sont rang ordonné de signification statistique. Les données ont été minées et par rapport aux listes de gène des bibliothèques de siARN préconfiguré. Ces listes de gène, nous avons choisi 3120 cibles pour le dépistage. Le siARN a été criblée dans les cellules de SV40-HCEC (voir la Figure 5 pour un organigramme du protocole HTS pour l’écran principal). Évaluations du point de terminaison inclus IL-8 niveaux en milieu de culture cellulaire par l’essai de non-laver reposant sur la perle et la viabilité cellulaire par test MTT. Les cellules ont été exposées à la 0.0036%HFA, comme décrit précédemment, qui est environ 1 x DL50. La viabilité cellulaire a été évaluée par analyse de MTT 24 h après l’exposition. L’effet de chaque pool de siARN sur la viabilité cellulaire a été analysé pour statistiquement significative par rapport à la moyenne négative exposées pour chaque plaque en utilisant la différence moyenne strictement normalisée (SSMD)27. Une parcelle de double-lampe de poche du SSMD et cellule viabilité pli-changement illustrée à la Figure 6. Les seuils de sélection coup choisis pour les cibles qui a exacerbé la mort cellulaire ou amélioré la viabilité cellulaire étaient SSMD ≤-1.28 et SSMD ≥ 1.28, respectivement.

Figure 5
Figure 5 : Organigramme du protocole principal écran HTS. Cet organigramme montre les étapes essentielles qui sont effectués chaque jour pour le protocole HTS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Terrain double-lampe de poche des siARN effet sur les cellules de SV40-HCEC Cell Viability of HFA-Exposed. Résultats affichés pour chaque cible sont la moyenne des six réplicats (n = 6). Données sur la viabilité des cellules sont exprimées comme un pli-changement par rapport à des siARN contrôle de mélange négatifs exposés, et signification statistique a été analysée par SSMD. Cibles qui avaient un SSMD ≤-1.28 ou ≥ 1.28 ont été sélectionnés comme des grands succès. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’effet de chaque pool de siARN sur la production induite par la HFA IL-8 a été analysé pour statistiquement significative par rapport à la moyenne négative exposées pour chaque plaque. IL-8 dans le surnageant de culture cellulaire a été évaluée test 24h après l’exposition. Une parcelle de double-lampe de poche du pli-changement SSMD et IL-8 est montrée dans la Figure 7. Les seuils de sélection coup choisis pour les cibles qui diminue la production d’IL-8 ont été une diminution de 40 % et ≤ SSMD -1,0. Les seuils de sélection coup retenus pour les cibles qui ont augmenté la production d’IL-8 étaient un quintuplé et SSMD > 1,28.

Figure 7
Figure 7 : Terrain de double-lampe de poche de l’effet des siARN sur la Production d’IL-8 par les cellules de SV40-HCEC HFA-Exposed. Résultats affichés sont la moyenne des six réplicats (n = 6). Expression d’IL-8 niveau données est exprimées comme un pli-changement par rapport à des siARN mélange négatifs exposés et statistiquement significative a été analysée par SSMD. Visites ont été définies comme cibles qui avaient un 40 % diminuent des niveaux d’IL-8 et SSMD ≤ -1,0 ou un quintuplé dans les niveaux d’IL-8 et SSMD > 1,28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans les présentes, nous décrivons nos méthodes et nos résultats sur le développement d’une cellule épithéliale de haut débit cornée, modèle pour l’étude des lésions HF et CP de dépistage. Nous présentons aussi les résultats de l’écran de siARN primaires pour blessure de HF. Il y avait de nombreux défis pour le développement de modèles HTS pour l’étude des blessures TIC. Les méthodes que nous pourrions trouver dans la littérature concernant l’étude de HF, HFA ou CP dans les modèles de culture cellulaire ont été d’un grand secours. La plupart études in vitro sur l’ion fluorure impliquent des cellules par voie orale et utilisé le fluorure de sodium et pas HF ou HFA (pour des exemples, voir,du28,29). Une méthodologie sur l’exposition in vitro de cellules épithéliales bronchiques au CP a été publié par Pesonen et al. 30. en fin de compte, nous avons ne trouvé aucune méthode spécifique dans la documentation liée à l’étude HTS de HF, HFA ou CP et la grande majorité des défis et des variables liées à l’étude de ces substances toxiques dans le développement de l’HTS requis. Une attention particulière a été payée pour atteindre le degré élevé de cohérence de l’exposition dans le temps et les nombreuses plaques de projection nécessaires à une étude HTS réussie.

Un seul type de défi rencontré était lié à l’application de la substance toxique aux systèmes de cultures cellulaires. Certaines substances toxiques sont réactives avec ou instable en solution aqueuse. Les substances toxiques, que nous avons sélectionnés pour l’étude ne sont pas considérées comme ayant ces problèmes d’instabilité. Une étude agricole photohydrolyse de CP a montré qu’une solution de 0,001 M du CP dans l’eau a une demi-vie de 31,1 h lorsqu’il est exposé à une source de lumière de xénon de 1100 lux (intensité de la lumière du soleil d’une journée nuageuse) pendant 10 jours, 12 h par jour31. Il n’y avait aucune hydrolyse mesurable sur la même période de 10 jours lorsque la solution a été conservée dans l’obscurité. Le proton et le fluorure ion de HFA sont clairement stables dans l’eau. Il y a, cependant, des considérations de stabilité supplémentaire en ce qui concerne les dilutions toxiques en milieu de culture cellulaire. Nous avons constaté qu’il y avait un changement initial de cytotoxicité dans une certaine mesure lorsque les substances toxiques ont été tout d’abord dilués dans un milieu de culture cellulaire qui stabilise puis après une brève période de temps. Nous pensons que cela est dû à la liaison de produits toxique ou complexation avec les mandants dans le milieu. Un milieu cellulaire contient calcium, magnésium, protéines, etc. , qui sont connus pour interagir avec le fluorure ion32,33. CP est connu pour avoir des réactions d’oxydation avec les thiols biologiques, mais il peut également lier l’ADN, les protéines et autres nucléophiles34,35. Une fois que ces réactions et ces interactions ont achevé ou atteint un équilibre, la quantité de substance toxique disponible stabilise et donc la cytotoxicité apparente se stabilise. Au départ, nous avons exploré l’utilisation de sérum physiologique et eau dilutions de substances toxiques pour les stocks de travail utilisés pour les expositions d’éviter des interactions toxiques avec des constituants moyens dans les dilutions de travail. L’utilisation d’une solution saline préserverait également le composant acide de blessure HFA pour l’exposition réalisée par échange moyen. Nous avons constaté que les réponses de mort cellulaire à des substances toxiques dans l’eau et des dilutions salines étaient plus variable que la méthode utilisée des dilutions de milieu de culture cellulaire avec échange moyenne (données non présentées). Quant à la méthode d’exposition spike avec HFA, la variabilité peut être en raison de l’incohérence dans l’épi se disperser dans le bien conduisant à des cibles cellulaires en concurrence avec des constituants moyennes pour l’ion fluorure disponible. Les raisons de la variabilité de l’exposition moyenne échange avec des dilutions salines HFA HFA ne sont pas entièrement claires. En tout état de cause, les méthodes d’exposition à l’aide de dilutions salines pour HFA ont été abandonnés et pas explorés pour le CP. La toxicité de nos dilutions HFA dans un milieu imite probablement étroitement les études utilisant le fluorure de sodium, parce que le milieu de la cellule met en mémoire tampon le proton libre dans notre dilutions HFA.

Autres défis que nous avons rencontrés étaient liés au raffinement des modèles de culture cellulaire pour utilisation en HTS Nous avons jugé nécessaire de modifier les constituants cellulaires de milieu de culture pour les cellules de l’expérimentation, spécifiquement hydrocortisone et antibiotiques. Nous avons utilisé un faible niveau d’hydrocortisone (0,5 µg/mL) au cours d’études sur l’exposition pour réprimer le crampon occasionnel dans la production de cytokines chez naïve SV40-HCEC. Cette faible quantité d’hydrocortisone n’affecte pas négativement les réponses des cellules à substance toxique et était inférieur à des niveaux généralement utilisées pour supprimer la production de cytokines par les cellules cultivées en réponse à stimulant36,37. Les raisons exactes pourquoi cellules naïves SV40-HCEC produisent occasionnellement des cytokines excès ne sont pas connues, mais il est possible que les cellules sont variablement sensibles à des facteurs de stress mineures qui se produisent pendant la cellule passage et plaquant. Nombreux laboratoires comprennent systématiquement antibiotiques en milieu d’entretien de culture cellulaire, mais certains antibiotiques, tétracyclines en particulier, ont démontré que présentent des effets anti-inflammatoires sur des cellules cultivées, y compris les cellules épithéliales cornéennes38. En général, notre laboratoire évite l’utilisation d’antibiotiques lorsque c’est possible puisque ceux-ci peuvent potentiellement confondre études. Nous avons également étudié la dérive phénotypique sur plusieurs passages de nos cellules en culture. Il est fréquent que des cellules immortalisées à subir la dérive génétique et phénotypique au fil de multiples passages, sinon maintenu en phase exponentielle, si autorisé à rejoindre la confluence ou exposés à certains facteurs de stress environnementaux39,40 ,,41. Par conséquent, il est essentiel durant un écran haut débit que les lignées cellulaires sont convenablement entretenues et l’écran est terminée à l’aide de nombre de passage de cellules qui maintiennent la réponse phénotypique connue. Effets de bordure de plaque multipuits est le phénomène que les cellules cultivées dans les puits de périmètre extérieur des plaques multipuits souvent ne répondent pas les mêmes ou avec la même consistance que les cellules cultivées en intérieur, puits42. Il y a des exercices statistiques, tels que les vernis médian, qui peuvent être utilisés pour minimiser les effets de bordure sur un ensemble de données43. Cependant, il n’y a aucun exercice statistique qui permet d’éliminer les effets de bordure sur un contrôle ou une cible particulière si elle est toujours testée dans un puits de bord et varier le schéma entre réplique pour déplacer les cibles ou contrôles hors puits de bord n’est pas sur le plan logistique pratique ni rentable. Il est de notre avis que la décision d’inclure l’utilisation des puits de bord en HTS analyses cellulaires devrait être prise avec prudence. Nous l’avons trouvé nécessaire d’éliminer l’utilisation de cellules cultivées dans les puits de bord pour les commandes et les cibles.

Notre HTS cellule modèle et exposition in vitro le préjudice de HF a été utilisée pour mener à bien l’écran siARN primaires de 3120 cibles. SSMD servait pour la sélection de succès parce qu’il a été proposé spécifiquement pour mesurer l’ampleur de la différence entre un contrôle et un siARN27. Nos résultats pour la viabilité cellulaire montrent qu’il y avait une relation linéaire de la placette dual-lampe de poche entre SSMD et pli-changement pour pratiquement toutes les cibles. Pour cette raison, nous avons utilisé le critère unique de SSMD hit sélectionnés pour ce point de terminaison. Les données de l’IL-8 diffèrent en ce que certaines cibles avaient des effets faibles mais régulier, tandis que d’autres ont montré des effets forts mais incompatibles. Par conséquent, nous avons utilisé pli-changement tant SSMD critères de sélection de succès pour ce point de terminaison. Les valeurs SSMD utilisées pour la sélection de succès pour les deux la viabilité cellulaire et IL-8 données ont été choisies parce que les seuils entre 1 et 1.645 (ou -1 et-1.65) atteindre découverte faux faible et des taux de non-découverte44. Il y avait quelques cibles qui ont connu un succès dans les données de l’IL-8 et la viabilité des cellules. Dans ces cas, ont exprimé une préférence pour l’inclusion dans la bibliothèque de déconvolution vers ces cibles qui exercent leurs effets dans le même sens d’améliorer la santé générale (amélioration de la viabilité et une diminution de IL-8) ou aggraver les blessures (augmente la mort cellulaire et plus IL-8). Dans l’ensemble, nous avons sélectionné un total de 250 cibles entre la viabilité cellulaire et IL-8 points de terminaison pour composer la bibliothèque de déconvolution pour blessure de HF. L’écran principal pour in vitro CP blessure est en cours.

En résumé, nous avons développé l’exposition et la culture conditions propices à l’étude HTS des blessures oculaires HF et du CP. Plusieurs variables dans des conditions d’exposition et de la culture ont été affinés et optimisés, et les modèles ont été validés pour convenir aux études HTS par Z' analyse de facteur. Nous avons encore prouvé l’utilité de ces modèles en remplissant l’écran principal d’une bibliothèque de siARN dans le modèle HF. Il y a beaucoup de blessures et de maladies qui ne revêtent pas ou peu d’intérêt pharmaceutique ou biotechnologique, blessure toxique par CP et HF inclus et l’avènement de la robotique de benchtop facilite l’étude HTS de blessures et de maladies dans pratiquement n’importe quel laboratoire . Suivent les données génomiques haut débit ensembles peuvent contribuer grandement à la compréhension des rôles que jouent les gènes spécifiques de blessures ou de maladies qui peuvent aider à mieux se concentrer sur des études in vitro ou in vivo .

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Clause de non-responsabilité: les opinions exprimées dans cet article sont ceux des auteurs et ne reflètent pas la politique officielle du département de l’armée, ministère de la défense ou le gouvernement des États-Unis. Cette recherche a été soutenue par un accord interinstitutions entre NIH/NIAID et le USAMRICD et en partie par une nomination au Programme Postgraduate Research Participation à l’US armée médical recherche Institut de défense chimique administrée par le chêne Crête d’Institut pour la Science et l’éducation à travers un accord interinstitutions entre le U.S. Department of Energy et USAMRMC.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le National instituts de santé contrecarrer programme interagences accord # AOD13015-001. Nous tenons à remercier Stephanie Froberg et Peter Hurst pour leurs efforts et leur expertise en matière de production vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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Biologie numéro 136 chloropicrine fluorure d’hydrogène les cellules épithéliales cornéennes lésion de la cornée siRNA criblage à haut débit
Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène
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Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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