Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокая пропускная способность SiRNA скрининга для хлорпикрина и фтористый водород индуцированной роговицы травм эпителиальных клеток

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/57372
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

Summary

Высокая пропускная способность небольшой тормозящий РНК скрининга является важным средством, которое могло бы способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. Здесь мы представляем, разработки и проверки воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности скрининга индуцированной фтористого водорода и хлорпикрина эпителиальных травмы роговицы.

Abstract

Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. Лечение для токсикант индуцированной повреждение роговицы в целом поддерживают как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. В усилиях по разработке методов лечения и терапии для ухода за воздействия он может быть важно понимать молекулярных и клеточных механизмов этих травм. Мы предлагаем, что использование высокой пропускной способности небольшой тормозящий РНК (siRNA) скрининга может быть важным инструментом, который может способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. siRNA, двойной мель молекулы РНК которые длиной 19-25 нуклеотидов и использовать post-transcriptional экспрессию путь к деградации мРНК гена имеющие гомологичностью к siRNA. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. В этой статье представлены разработки и проверки в vitro воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности, скрининг (HTS)-фтористый водород (HF) и хлорпикрина (CP) индуцированной глазные травмы. Хотя мы выбрали этих двух токсикантов, наши методы применимы к изучению других ядовитых веществ с незначительными изменениями в протоколе токсиканта экспозиции. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и производства ИЛ-8 были выбраны в качестве конечных точек в протоколе проверки. Представлены методы культуры клетки, подходящие для HTS исследования и несколько проблем, связанных с развитием токсиканта воздействия. Создание моделей HTS для этих ядовитых веществ позволяет дальнейшие исследования, чтобы лучше понять механизм травмы и экран для потенциальных терапии для химических глазные травмы.

Introduction

Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. К сожалению лечение токсикант индуцированной повреждение роговицы только в целом поддерживают, как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. Текущая стратегия лечения неспецифических и главным образом включает в себя актуальные терапевтических процедур, таких как смазки, антибиотики, и cycloplegics следуют противовоспалительные средства (например, стероиды) когда роговица заново грануломах1 ,2. Несмотря на лучших текущие терапевтического лечения вариантов Долгосрочный прогноз обычно плохо из-за прогрессивного помутнение роговицы и неоваскуляризации2,3.

Животные модели традиционно использовались для изучения токсичности химических и понять механизмы повреждения. Однако исследования на животных, трудоемким и дорогим. Есть также усилия по сокращению животных испытаний. Например законодательство REACH (ЕС 1907/2006) в Европейском союзе имеет положения, призванные уменьшить животных испытаний. Положения включают требование компании обмениваться данными с целью избежать животных тестирования и получения одобрения от Европейского Химического Агентства до выполнения предложенных испытаний на животных. Согласно положениям ДОСЯГАЕМОСТИ испытания на животных должно быть последним средством. Существует также Европейский Косметика Регламент (EC 1223/2009), поэтапное тестирование косметики в животных. Когда проводятся исследования на животных, они руководствуются принципами 3Rs (уточнение, сокращение и замены), которые обеспечивают основу для выполнения более гуманных исследований на животных, уменьшая количество животных, используемых и использования альтернатив без использования животных там, где это возможно. По этим причинам поле токсикологии стремилась принять в vitro анализов, которые может обеспечить понимание молекулярных механизмов токсичности и может быть сделано в более высокой пропускной способностью4. Это подход, функциональные токсикологии, где токсикантов определены их функции, а не только их химии. Шаг дальше, функциональные токсикогеномике стремятся понять роль(и), что конкретные гены играют в воздействии ядовитых веществ5. С применением технологии siRNA экраны расследовать ген функции в молекулярных и клеточных ответов токсикантов может быть сделано с высокой пропускной способностью. двойной мель молекулы РНК, которые 19-25 нуклеотидов, длинные, что воспользоваться пост транскрипционный анализ гена глушителей пути в всех mammalian клеток6siRNA. Эти синтетически сделал и направленная на конкретный ген. Когда введена в ячейку, обрабатывается siRNA и одной нити, нити руководства, загружается в РНК-комплекс (RISC). SiRNA направляет RISC на взаимодополняющих региона в молекуле мРНК, и RISC снижается мРНК. Это приводит к снижению экспрессии определенных генов. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. Такой подход был использован для более глубокого понимания механизмов рицин восприимчивость и индукции AHR-зависимые CYP1A17,8.

Оценки риска химического терроризма (CTRA) список и токсических промышленных химикатов (TIC) списки расписаны выберите химических веществ на основе их токсичность и потенциал, чтобы быть выпущен во время террористической, войны или промышленной аварии событий9. Мы применяем siRNA высокой пропускной способности, скрининг (HTS) toxicogenomic подход к изучению CTRA список ядовитых веществ, которые были определены на высокий риск использования в террористических целях. Традиционные токсикологии стремится понять неблагоприятные воздействия химических веществ на живых организмов; Однако, у нас есть еще желание понять механизмы повреждения с целью информирования развитие терапии и терапевтических подходов и, возможно, обнаружить молекул, которые могут быть направлены терапевтических развития. Эти усилия в некоторых отношениях можно считать аналогично использованию высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга и ячейки на основе анализов в процесс обнаружения наркотиков10. Основное отличие бы что что лекарств обычно стремится особой мишенью для терапевтических обнаружения, в то время как в наш подход несколько маловероятно, что будет сингулярных цели с высокую терапевтическую ценность для лечения токсиканта воздействия. Мы ожидаем, что любой парадигмы эффективного лечения для экспозиции токсиканта потребует многогранного подхода к достижению высокую терапевтическую ценность, и toxicogenomic данных жизненно могут сообщить парадигмы эффективного лечения.

Benchtop автоматизации приносит высокую пропускную способность методологии в лабораториях за пределами фармацевтической и биотехнологической промышленности. В vitro исследования в нашем институте исторически традиционной анализов, которые имеют низкую пропускную способность11,12,13. В последние несколько лет наша лаборатория перешел к использованию benchtop робототехники для выполнения высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Здесь мы представляем уточнение модели глазной клеток и развитие в vitro методы воздействия фтористого водорода (HF) и хлорпикрина (CP) подходит для высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Наша цель – определить молекулы, которые регулируют клеточных повреждений в ответ на эти токсикантов. Целей siRNA библиотеки, которую мы выбрали включают G белка-рецепторы, протеинкиназы, протеаз, фосфатаз, ионных каналов и других потенциально druggable целей. ВЧ и CP были отобраны для исследования перекрестных CTRA список агентов с ToxNet доклады промышленных аварий найти тех, которые представляют наибольшую опасность глазных травм через пара воздействия9,14. CP (химическая формула Cl3CNO2, номер КАС 76-06-2) первоначально использовался как слезоточивый газ в первой мировой войне15. В настоящее время он используется в качестве сельскохозяйственного фумигант и функции как нематоцидной, фунгицидов и инсектицидов16. Фтористый водород (HF) используется в процессах, включая алкилирования нефтеперерабатывающих и электрохимическое фторирование органических соединений17. ВЧ (химическая формула HF, номер КАС 62778-11-4) газ, но в виде водного раствора кислоты фтористоводородной раствор (ЗДВ, CAS номер 7664-39-3). Таким образом, мы избрали использование ЗДВ в нашей в ячейки модели воздействия. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и воспалительных маркер ИЛ-8 были отобраны как конечные точки, потому что цели, которые участвуют в клеточном травмы должны быть отражены в смерти клетки и воспалительной реакции. В частности если целевой играть защитную роль в экспозиции токсиканта, гибель клеток и/или воспалительных цитокинов производства следует увеличить когда целевое выражение тормозится siRNA. Обратное было бы верно для целей, которые играют негативную роль. Кроме того хроническое воспаление, как представляется, играть определенную роль в патологии роговицы после облучения и вмешательство в pathways смерти клетки может улучшить клинические исходы2,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. клетки культуры обслуживания

  1. Расти клеток линии SV40-НСЕС при 37 ° C, 5% CO2и 90% влажности в среде DMEM F-12 с 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% L-глютамином, 10 мкг/Л эпидермального фактора роста (EGF) и 5 мг/Л инсулина.
  2. Проход линия клетки каждые 3 до 4 дней (в зависимости от густоты посева) для обеспечения, что confluency никогда не превышает 80% во время культуры обслуживания.
  3. Отсоедините клетки из колбы с помощью отряда (14 мл раствор для каждый флакон2 150 см) и инкубации при 37 ° C не более 8 мин.
  4. Нейтрализовать отряд решение с равным объемом клеток питательной среды и Пелле клетки в 50 мл конические трубы центрифугированием за 7 минут при 160 x g.
  5. Вновь приостановите Пелле клеток в средних (20 мл на каждый флакон2 150 см).
  6. Подсчет количества ячеек с счетчик автоматизированной ручной клеток и семян в новые колбы в плотности, что позволит им расти 3 до 4 дней не превышает 80% confluency.

2. плита клетки для экспериментов

  1. Проверьте, фляги SV40-HCECs, свет фазово-контрастной микроскопии для обеспечения что confluency меньше чем 80% и оценить общую камеру здоровья.
  2. Отсоединить, пеллет, Ресуспензируйте и рассчитывать SV40-HCECs из колбы, как описано в шагах 1.3-1.6 клетки культуры обслуживания. Используйте SV40-НСЕС носитель, содержащий гидрокортизона 0,5 мкг/мл (средний HCORT) для Ресуспензируйте клетки.
  3. В одноразовые средних бутылку Подготовьте подвеска SV40-HCECs на 17,857 клеток/мл в подогретым HCORT среде.
    1. Подготовьте достаточное количество суспензию клеток количество пластин для заполнения.
    2. Семя минимум 14 x 96-луночных плит с ячейками для каждый siRNA библиотека пластины необходимо изучить.
  4. Вихрем бутылку, чтобы равномерно приостановить клетки, налить достаточного объема суспензию клеток в водохранилище на орбитальный шейкер гнездо обработчика автоматизированной жидких и хранить флакон, содержащий суспензию клеток на 37 ° C потепления тарелку в ячейки покрытия процесс.
  5. Используйте автоматизированных жидких обработчик для добавления ячеек в 70 мкл среднего за хорошо 96-луночных плиты пластины на плотности 1000 ячеек на колодец (5000 клеток/см2). Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Постоянно во время процесса инициализации запустите орбитальный шейкер при 100 об/мин.
    2. Перемешать суспензию клеток, три раза (140 мкл микс тома) с помощью автоматического жидкого обработчика.
    3. Аспирационная 140 мкл суспензии клеток и отказаться от 70 мкл в каждой скважине двух плит культуры клеток.
    4. Повторите шаги 2.5.3 и 2.5.4, до тех пор, пока все пластины были посеяны с ячейками.
    5. Пополните водохранилище подвеска клеток, при необходимости во время процесса инициализации.
  6. После того, как пластины были посеяны, удалите их из обработчика автоматизированных жидких и инкубировать их на 30 минут при комнатной температуре до их перевода в инкубатор культуры клеток.
  7. Оцените плотность ячеек каждый хорошо для каждой пластины следующее утро с использованием автоматизированной системы обработки изображений, которая размещается в инкубатор культуры клеток и исключить любые пластины из исследования, которые имеют интерьер скважин, которые не находятся между 15% и 22% притока.

3. transfect клетки с малых интерферирующих РНК

  1. Приобрести siRNA библиотека пластины от поставщика, предварительно настроен для содержат 80 siRNA целей каждой пластины (см. Рисунок 4), с колоннами 1 и 12 оставлено пустым.
  2. Воссоздать пластину библиотека siRNA с siRNA буфера до конечной концентрации 2 пмоль/мкл для каждой скважины siRNA согласно инструкции производителя19.
  3. Transfect клетки 24 ч после посева с 4 пмоль/хорошо интерферирующей РНК и 0,3 мкл/хорошо трансфекции реагента. Выполните все шаги согласно протокол transfection реагент производителя (см. Рисунок 4 пластины макета)20.
    1. Выполнять все transfections, с помощью обработчика автоматизированной жидкость и использовать 25 мкл/с скорость дозирования для всех шагов. Использование предварительно настроенных кончик коробки для решения только скважин, которые будут transfected.
    2. Используйте топ, половина из библиотеки пластины для transfect набор из шести реплицировать пластин называют «Верхней пластины набор» (шесть реплицирует в siRNA, n = 6).
    3. Использование нижней половины библиотека плиты к transfect другой набор из шести реплицировать пластин называют «Нижняя плита набор» (шесть реплицирует в siRNA, n = 6).
    4. Используйте термин «Полный набор плита» для описания 12 клеток пластины, которые были transfected с библиотек siRNA.
    5. Transfect скважин B2-B6 всех плит в полный набор плита с отрицательным бассейн siRNA, после того, как все наборы верхней и нижней плиты были transfected с библиотек siRNA.
    6. Также transfect скважин B2-B6 еще две пластины, которые не получают библиотек siRNA и будет служить в качестве неэкспонированные управления (один для набора плиту) и один для нижней плиты набора, с отрицательным бассейн siRNA.
  4. Инкубируйте все ячейки пластины в инкубатор культуры клеток 4 часа после того, как были добавлены все трансфекции смеси и перемешать, нежный, выстукивать каждый час.
  5. Используйте обработчик автоматизированных жидких мыть все скважины пластин дважды с подогретым среднего HCORT развести 1:5 в PBS. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
    2. Добавить в каждый хорошо 100 мкл/также подогретым среднего HCORT разводят в PBS 1:5, которая содержится в различных водохранилище на достаточный объем для количество пластин.
    3. Повторите шаги 3.5.1 и 3.5.2 для каждой пластины.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
      2. Пополнения резервуара с HCORT среднего разводят 1:5 в PBS при необходимости.
    4. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
  6. Refeed все скважины пластин с 100 мкл/также подогретым HCORT среда, которая содержится в различных водохранилище на достаточный объем средств количество пластин.
    1. Наполните резервуар с среднего при необходимости.
  7. Использование скважин С2-С6 всех плит как не transfected элементы управления.
  8. Держите скважин B7-B11 и C7-C11 всех плит transfected использоваться как элементы управления наркотиков и транспортных средств для экспозиции токсиканта.

4. refeed клетки следующий день

  1. Используйте обработчик автоматизированной жидкость для refeed все скважины плит. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
    2. Каждый refeed, хорошо с 100 мкл/также подогретым HCORT среда, которая содержится в различных водохранилище и имеет достаточный объем среднего числа пластины, чтобы быть refed.
    3. Повторите шаги 4.1.1 и 4.1.2 для refeed всех клеток пластины.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
      2. Наполните резервуар с среднего при необходимости.

5. позитивные управления сложения

  1. Два дня после transfection и два часа до облучения, подготовить 62,5 мкм решение позитивного управления cardamonin в среде HCORT использоваться для HFA воздействия и добавить строку B 8-рядных разрежения водохранилища.
    1. Для экспозиции CP готовить и использовать раствор 25 мкм SKF 86002.
    2. Подготовка тома позитивного управления достаточное количество пластин для проверки.
  2. Приготовляют раствор 0.625% ДМСО в HCORT среде (управления транспортного средства) и добавить строку C же водохранилище.
    1. Для экспозиции CP готовить и использовать 0,5% раствор в ДМСО.
    2. Подготовка тома достаточное количество пластин испытываемого транспортного средства управления.
  3. Используйте обработчик автоматизированных жидкость добавить положительный и транспортное средство контроля скважин B7-B11 и C7-C11 каждой ячейки пластины и использовать 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов. Предварительно настроенные подсказка поля используйте для решения только скважин, которые будут получать положительные и транспортного средства контроля.
    1. Удаление 10 мкл среднего из скважин B7-B11 и C7-C11 каждой ячейки пластины и отбросить его в ряды G и H 8-рядных разрежения водохранилища.
    2. Передача 10 мкл положительные и транспортное средство контроля для этих скважин и смешайте 3 раза.
  4. Возвращение этих клеток плит в инкубатор.
  5. Повторите шаги 5.3 до 5,4 до тех пор, пока все ячейки пластины получили позитивные и управления транспортного средства.

6. ВЧ экспозиция культивируемых клеток

Предупреждение: ЗДВ коррозионные и острой токсичностью.

  1. Выполните все операции воздействия химических веществ в химической Зонта, нося двойной нитриловые перчатки, лабораторный халат, одноразовые полиэтиленовые рукава пленки и защитные очки.
    1. Приобрести ЗДВ как 48% раствор.
    2. Разбавляют HFA до 1% сверхчистого водой и хранить в 5 мл аликвоты в 10 мл толстостенные Полиэтиленовые флаконы для повышения безопасности.
    3. Обеззараживанию наконечники и водохранилищ, которые вступили в контакт с ЗДВ и любые остатки жидкости HFA с 2,5% кальция глюконата до удаления в потоке отходов.
  2. Для каждой пластины библиотек siRNA под следствием, подготовить решение средних ЗДВ 0,0036%, добавив 288 мкл 1% ЗДВ по 80 мл подогретым HCORT среды в 150 мл.
    1. Вихрем бутылку и инкубировать и разбавленных ЗДВ в инкубатор 37 ° C в Химический вытяжной шкаф на 10 мин.
  3. Mix решение средних ЗДВ снова закрученного бутылки и добавьте решение средних ЗДВ реагент водохранилища на плиты теплее.
  4. Выполните экспозиции с двух техников, работающих в тандеме.
    1. Техник на правой аспирата 100 мкл каждого из внутренних скважин ячейки пластину, используя канал 12 дозаторов и затем передать пластину техник на левой стороне.
    2. У специалиста на левой стороне 100 мкл на хорошо решение средних ЗДВ.
    3. Повторите шаги 6.4.1 и 6.4.2 для всех клеток пластин, которые должны подвергаться токсикант.
    4. Также повторите шаги 6.4.1 и 6.4.2 экспонированию пластин, используя свежие среднего HCORT вместо решение средних ЗДВ.
  5. Поместите пластины в инкубаторе химического дыма капот для 20 мин и затем вернуть их в инкубатор культуры клеток.
  6. Повторите шаг дополнение положительный контроль (шаги 5.1 до 5,5), как ранее показано раз все пластины были подвержены и вернулся в инкубатор культуры клеток.

7. CP экспозиция культивируемых клеток

Предупреждение: CP является остро токсичные и раздражение.

  1. Выполните все операции воздействия химических веществ в химической Зонта, нося двойной нитриловые перчатки, лабораторный халат, одноразовые полиэтиленовые рукава пленки и защитные очки.
    1. Приобрести CP.
    2. Разбавляют CP до 5% в ДМСО и хранить в 10 мл аликвоты в 10 мл сцинтилляционные флаконы для повышения безопасности.
    3. Обеззараживанию наконечники и водохранилищ, которые вступили в контакт с CP и любые остатки жидкости CP с бисульфит натрия 2,5% до удаления в потоке отходов.
  2. Готовить достаточное количество подогретым HCORT среде, содержащей 1 х перо/воспаление и подогретым PBS для количество пластин подвергаются.
  3. Для каждого набора Топ плита набор или днище, мкл 8,04% 5 CP в ДМСО в 50 мл Алиготе подогретым HCORT среднего и перемешать хорошо для окончательного CP 0,0008% концентрации. Крышка трубки плотно и инкубировать решение в 37 ° C инкубатора в Химический вытяжной шкаф за 1 час.
    1. Время Добавление CP 50 мл аликвоты средних, так что каждый подвергается Топ плита набор и Нижняя плита набор получает токсикант точно 1 час после CP был добавлен в 50 мл Алиготе среды.
  4. Удалить набор верхней пластины и 1 экспонированию пластина из инкубатора культуры клеток и поместите их в химической зонта в конце инкубационного периода.
  5. Mix решение CP, инвертирование трубки и затем декантируют его реагент водохранилище в конце периода инкубации 1 h.
  6. Выполните экспозиции с двух техников, работающих в тандеме.
    1. Техник на правой аспирата 100 мкл каждого из внутренних скважин ячейки пластину, используя канал 12 дозаторов и затем передать пластину техник на левой стороне.
    2. У специалиста на левой стороне 100 мкл на хорошо решение средних CP.
    3. Повторите шаги 7.6.1 и 7.6.2 для всех клеток пластины Top плита набор подвергаться воздействию токсикант.
    4. Также повторите шаги 7.6.1 и 7.6.2 экспонированию пластин, используя свежие среднего HCORT вместо решение средних CP.
  7. Поместите пластины в инкубатор 37 ° C в Химический вытяжной шкаф на 10 мин.
  8. Добавить достаточный объем PBS и HCORT среды, содержащие 1 х перо/Strep реагент резервуаров в конце инкубационного периода 10 мин.
  9. Удаление решения CP из пластин ячейки с помощью дозаторов 12 канал и заменить его 100 мкл на хорошо PBS в конце инкубационного периода 10 мин.
  10. Немедленно удалить PBS из клеток плит и заменить его с 100 мкл на хорошо HCORT среды, содержащие 1 х перо/воспаление.
  11. Также повторите шаги 7.9 и 7.10 для пластин экспонированию.
  12. Возвращение пластин ячейки в инкубатор культуры стандартной ячейки.
  13. Повторите шаги с 7,3 до 7.12 для нижней плиты установить.
  14. Повторите шаг добавление положительный контроль (шаги 5.1 до 5,5), как описано, как только все пластины были подвержены и вернулся в инкубатор культуры клеток.

8. образец коллекции и жизнеспособности Assay клетки

  1. Двадцать четыре часа после облучения, приготовляют раствор 0.5 мг/мл МТТ субстрата в PBS, содержащие 10 г/Л глюкозы и нагреть до 37 ° C21. Подготовка субстрата для каждой пластины быть assayed 10 мл.
  2. Количество пластин для быть assayed добавьте достаточного объема раствора субстрата МТТ водохранилища на обработчик автоматизированной жидкость.
  3. Использование автоматизированных жидких обработчик для сбора образцов и добавления МТТ субстрат с использованием 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов. Предварительная настройка кончик коробки, чтобы решить только те скважин, чтобы быть assayed.
    1. Аспирационная 95 µL из среднего от внутренний 60 скважин клетки пластины, и депозит 42,5 мкл в каждый из двух пластин, 384-ну хранения.
    2. Сразу же 100 мкл за хорошо раствора субстрата MTT на клетки тарелки и инкубировать их при 37 ° C в инкубатор культуры клеток для 1,5 ч.
    3. Наполните резервуар с МТТ раствора субстрата при необходимости.
  4. Инкубируйте сотовый плит при 37 ° C в инкубатор культуры клеток за 1 ч.
  5. Уплотнение 384-ну хранения плит и хранить их в-80 ° C для последующего анализа.
  6. Повторите шаги с 8,3 до 8,5 для всех наборов верхней и нижней плиты и неэкспонированные связанные элементы управления.
    1. Повторное использование советы между реплицирует, если желаемого, но мыть их при добавлении раствора субстрата МТТ и когда переключение между пластиной устанавливает.
  7. После инкубации 1 h добавьте достаточного объема ДМСО в водохранилище на обработчик автоматизированной жидкость.
  8. Использование автоматизированных жидких обработчик для добавления ДМСО и использовать 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл каждого из внутренних скважин сотовый плит и отбросить МТТ раствора субстрата в резервуар для отходов.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
    2. Наложение каждой скважины с 100 мкл ДМСО.
      1. При необходимости пополните ДМСО водохранилище.
  9. Встряхните пластины на пластины шейкер 3 мин.
  10. Измерьте absorbance на 570 и 690 нм, используя спектрофотометр пластины.
  11. Вычитание фона и рассчитать % жизнеспособность клеток путем деления значения подвергаются поглощения неэкспонированные элементов управления. Используйте элемент siRNA средняя неэкспонированные негативные бассейн для вычисления % жизнеспособность клеток для всех целей.

9. мера ИЛ-8 концентрация в Supernatants культуры клеток

  1. Измерение концентрации ИЛ-8 в supernatants культуры клеток с помощью no мыть на основе бисера пробирного согласно инструкции производителя22. Создание макета пробирного пластины для размещения образцов и калибровочной кривой.
  2. Снимите крышки 384-ну хранения от-80 ° C морозильник, разморозить при комнатной температуре и кратко центрифуга пластины для сбора образцов в нижней части скважины.
  3. Для количество пробирного пластин для запуска сделайте достаточный объем акцептора анти ИЛ-8 шариков и биотинилированным антитела анти ИЛ-8 в assay buffer входит в комплект. Используйте отношение 50 мкл бусины акцептора анти-ИЛ 8 и 50 мкл антител анти-ИЛ 8 биотинилированным 9.9 мл аналитического буфера.
    1. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте смесь из бисера/антитела к пластине черный 384-ну хранения.
      1. Добавьте акцептора шарик/антитела для скважин, предназначенных для использования образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
      2. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
  4. Воссоздания ИЛ-8 стандарт до 1000 пг/мл с использованием клеток питательной среды, содержащие 354 мкм NaCl. Сделайте достаточный объем для количество пробирного пластин для запуска.
  5. Сделайте восемь двойной серийных разведений стандартной кривой.
  6. Добавьте калибровочной кривой в трех экземплярах соответствующие лунки черный 384-ну хранения плиты по данным Пробирной пластины макет. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
    1. Аналогично, добавьте носитель культуры клеток, содержащий 354 мкм NaCl, не ИЛ-8 для измерения фон.
  7. Используйте обработчик автоматизированной жидкость для выполнения assay. Предварительно настроенные подсказка поля используйте для решения только колодцев, макет пластины пробирного назначенных. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Передача 8 мкл смеси шарик антитела акцептора лунки белый мелкий 384-Ну хорошо пробирного плит.
      1. Добавьте только для скважин, предназначенных для образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
    2. Передать соответствующие лунки мелкой хорошо пробирного плит согласно пробирного пластины макет 2 мкл калибровочной кривой.
    3. Приготовляют раствор NaCl 3.54 M и добавить достаточный объем для количество пластин к assayed мелкой водохранилище на обработчик автоматизированных жидкость.
    4. Отрегулируйте соль концентрация образцов, чтобы соответствовать стандартной кривой путем передачи 4.5 мкл раствора NaCl образцы в черный 384-ну хранения плит.
    5. Смешайте образцов, три раза с помощью смешивания объем 30 мкл, и передачи 2 мкл образцов в мелкий белый хорошо пробирного пластины по данным Пробирной пластины макет.
      1. Изменить советы между образца пластины.
    6. Инкубируйте 1 час в темноте при комнатной температуре.
    7. Для количество пробирного пластин для запуска сделайте достаточного объема акцептора бусины в assay buffer. Используйте отношение 200 мкл вторичных акцептора бисера 12.3 мл аналитического буфера.
    8. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте средних бусин черный 384-ну хранения пластины.
      1. Добавление вторичного бусины скважин, предназначенных для использования образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
      2. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
    9. Используя обработчик автоматизированных жидкость, передачи 10 мкл вторичного бусы из лунки белый мелкий 384-Ну хорошо пробирного плит.
      1. Добавить только для скважин, которые получены образцы и стандартные кривой по данным Пробирной пластины макет и вымыть советы между каждой плиты.
    10. Инкубируйте еще час в темноте при комнатной температуре.
  8. Уплотнение assay пластины с очистить пластины печатей и сканирование с помощью пластины читатель совместим с assay. Используйте 0,2 мм расстояние между пластиной и детектор, время возбуждения 180 МС и МС 550 измерения времени для сканирования.
  9. Импорт необработанных данных из анализов ИЛ-8 в электронную таблицу.
  10. Использование автоматизированных кривой для стандартной кривой анализов ИЛ-8 и затем преобразовать необработанные данные в ПГ/мл для каждого образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Разработка метода воздействия

Мы изысканный и оценку пригодности человека роговицы эпителиальных клеток линии SV40 НСЕС для использования в исследованиях HTS. SV40 НСЕС были увековечены с помощью большой T антигена SV-40 и были в подарок от Dhanajay Pal23. Там были изучены в экспозиции методологии развития представить кратко здесь слишком много переменных, и таким образом, только некоторые примеры результатов, которые мы считаем, могут применяться более широко представлены на несколько токсикантов.

Экспозиции токсиканта шипованные или средний обмен

Мы изначально стремились подвергать клетки на пики 5 мкл рабочей концентрации токсикант разводят в воде, физраствора или среднего в 95 мкл среды уже присутствует в каждой скважине клеток в 96-луночных пластины для достижения окончательного желаемой экспозиции концентрации. SV40 НСЕС подвергаются, используя этот всплеск подвергать/refeed методологии 1 X LD50 ЗДВ на 24 часа (1 X LD50 = 0,02% ЗДВ на этот метод, когда Спайк ЗДВ был разведен в среде), и колодцы были refed с свежие средние 10 мин позже. После 24 часов клетки были обложил с МТТ субстрата, как описано выше для assay жизнеспособности клетки. Изображения были захвачены photomicroscopy перед солюбилизация Формазаны кристаллов с ДМСО. Тщательное исследование скважин показали, что в значительной степени клеточной смерти было локализовано в одном месте, и это несмотря на тот факт, что пластины был потрясен 15 s сразу же после всплеска был добавлен весь пластины (рис. 1a). Это явление было отмечено, когда Спайк была добавлена к нижней части хорошо или когда добавлен в мениска. Более высокое увеличение изображения этой области с использованием фазы контраст показывает, что клетки по-прежнему присутствуют в районе незапятнанное MTT (рисунок 1b). Мы также протестировали средний обмен подвергать/refeed методологии где среднего был удален из скважин, заменены клеток питательной среды, содержащие в 1 X LD50 ЗДВ (1 X LD50 = 0,035% ЗДВ этим методом) и колодцы были refed с свежие средние 10 мин позже. После 24 часов клетки были обложил с МТТ субстрата, как описано выше. Этот метод добиться видимо больше даже клеток смерть ответ клеток в каждой скважине (рис. 1 c и 1 d). Неэкспонированные элементы управления предоставляются для справки и показать не локализованных областях клеточной смерти (Рисунок 1e и 1f). Для CP облучения метод Спайк не привело к значительной степени клеточной смерти локализовано в одном месте в пределах каждой скважины; Однако, ответ смерти клетки был более последовательным, от одной итерации к следующему с использованием метода воздействия среднего обмена (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1 : Сотовый смерти, вызванных Спайк и методы воздействия среднего обмена. Все изображения были захваченных 1,5 ч после добавления субстрата МТТ. Дискуссионный форум (a) представляет собой яркий поле изображение SV40-НСЕС воздействию ЗДВ Спайк подвергать/refeed методологии. Панель (b) является увеличение же хорошо в дискуссионный форум (a) с использованием фазового контраста. Группа (c)-образ яркой области SV40-НСЕС предоставляемые среднего обмена подвергать/refeed методологии. Группа (d) является увеличение же скважины в панели (c) с использованием фазового контраста. Панели (e) и (f) являются хорошо неэкспонированные, светлые области и увеличение контраста фазы, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Токсиканта стабильность в среде

Было отмечено, что, как только разбавленным в среде, очевидной цитотоксичность ВЧ и CP изменения и затем стабилизируется. HFA разводят в средне-0,0036% и позволило для инкубации при 37 ° C 1-60 мин до подвергая SV40-HCECs, как описано выше. ЗДВ цитотоксичность увеличивается в течение первых 5 минут, что ЗДВ разбавляется в средних и стабильным для по крайней мере один час (Рисунок 2a). Один из способов, следуют Дуннетт множественные сравнения теста ANOVA показал что жизнеспособность клеток % на всех точек времени существенно отличались от точки 1 мин-время. Моменты времени были статистически значимых различий между 2,5-60 мин. CP органических и сначала разбавляют 5% ДМСО. Он был затем разбавляют в средних 0,0008% и позволили для инкубации при 37 ° C за 5-120 мин до подвергая SV40-HCECs, как описано выше. Как только разбавленным в среде, цитотоксичность CP уменьшается более чем 60 мин и затем стабилизируется для по крайней мере следующей h (рис. 2b). Один из способов, следуют Дуннетт множественные сравнения теста ANOVA показал что жизнеспособность клеток % на все моменты времени существенно отличались от точки 5 минут времени. Моменты времени были статистически значимых различий между 60-120 мин.

Figure 2
Рисунок 2 : Токсиканта потеря цитотоксичность в средних разведениях. Данные выражаются как средний процент жизнеспособности ± SD (n = 6). Дискуссионный форум (a) показывает стабильность 0,0036% ЗДВ цитотоксичность когда разводят в средних и инкубировали при комнатной температуре 1-60 мин до подвергая SV40-HCECs, как описано выше. Панель (b) показывает стабильность 0,0008% CP цитотоксичность когда разводят в средних и разрешено для инкубации при 37 ° C за 5-120 мин до подвергая SV40-HCECs, как описано выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Разоблачение/Refeed или подвергать только

Еще одним фактором, расследовались в экспозиции методология была ли: A) добавить токсикант за 10 мин, мыть, refeed, удалить пластины из химического зонта и инкубировать 24 h в инкубатор культуры стандартной ячейки (выставить/refeed метод); или B) добавить токсикант, оставить его на, удалить пластины из химического зонта и инкубировать 24 h в инкубатор культуры стандартной ячейки (выставить только метод). Безопасность является важным фактором, поскольку она не может быть допустимо, чтобы удалить пластины клеток, которые содержат разреженных токсикант от химического Зонта, потому что будет отходящих газов и подвергать кадров. Связанной с соображением является количество пластин подвергаться в данный момент с больше пластин, есть, там будет больше громкости выкл газообразования. В наших методов HTS мы выставляем 48 x 96-луночных пластины в день данного исследования. Мы поместили облученных клеток культуры пластин в запечатанном пакете и затем колориметрические газа Детектор трубы для оценки CP и ВЧ вне газовыделения из выставленных плит. Мы обнаружили, что разоблачение 48 пластины 1 x LD50 ЗДВ не привели к любой обнаружению ВЧ вне газом (данные не показаны). Для CP воздействия мы обнаружили, что там было достаточно CP вне газовыделения из 48 плит, подвергается 1 x LD50 представить по крайней мере некоторые безопасности озабоченность (данные не показаны). Разоблачение/refeed и выставить только методы были оценены для HFA воздействия. SV40-НСЕС клетки подвергались воздействию ЗДВ и жизнеспособности оценивали МТТ пробирного 24 ч после воздействия. Доза ответ итераций были исполнены в разные дни. По сравнению с методом подвергать/refeed (Рисунок 3А), мы обнаружили, что только метод подвергать результаты более последовательной клеток жизнеспособности пробирного (рис. 3b). Таким образом этот метод был выбран в качестве частью методологии окончательный экспозиции. Для CP, любые различия в согласованность результатов анализа жизнеспособности клеток между этими двумя методологиями разных экспозиции не может быть вычислено поскольку проблемы безопасности исключает удаление CP подвергаются плиты из химического зонт для 24 ч инкубации в стандартная ячейка инкубатор культуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Соответствие воздействия подвергать/refeed и выставить только методы. Данные выражаются как средний процент жизнеспособности ± SD (n = 6). () ЗДВ была разводят в средних, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и затем используется для предоставления клетки методом подвергать/refeed. (b) ЗДВ была разводят в средних, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и затем используется для предоставления SV40-НСЕС выставить только методом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Уточнение модели ячейки

Средний составляющих

Мы присоединились к культуре условий, установленных происходящих следователей для прохода и поддержание этих клеточных линий; Однако мы изменили их для ячеек в эксперименте. Клетки питательной среды, предписанные происходящих следователей для SV40-НСЕС клетки не включают гидрокортизон, но мы использовали низкий уровень гидрокортизон (0,5 мкг/мл) в ходе исследования воздействия для подавления случайные Спайк в производство цитокинов видел в наивной SV40-НСЕС (данные не показаны) которых отрицательно сказывается анализа данных из одной итерации к следующему во время доработки исследования.

Фенотипические стабильность

Во время наших исследований уточнение модели клетки, мы обнаружили, что SV40-НСЕС начинают снизились производство цитокинов в ответ токсиканта воздействия, начиная вокруг номер прохода 60 (данные не показаны). По этой причине мы поддерживали cryostocks низкий проход клеток, выполнены все исследования с использованием клеток под номером 60 проход и контролировать производство цитокинов в ходе процесса отбора.

Формат плиты

Важным источником экспериментальной изменчивости высокой пропускной способности исследования является краевых эффектов Мульти хорошо плит. Мы обнаружили, что цитокина реакции клеток в край скважин не согласуются с или эквивалент, интерьер скважин в обоих ЗДВ и CP исследований (данные не показаны). Средний польский данных, статистического упражнения, используемые для сведения к минимуму эффекты краев на набор данных, достаточно не решить эту проблему (данные не показаны). Поэтому не краем ячейки лунках были использованы для экспериментов или элементов управления (рис. 4).

Figure 4
Рисунок 4 : Библиотека и ячейки пластины макеты. Серый Затененные участки в структуре библиотеки плиты представляют скважин, которые содержат siRNA. Белый скважин являются пустыми. 40 цели из строк A-D пластину библиотеки используются в «Top плита набор», и 40 цели из строки E-H пластину библиотеки используются в «Нижняя плита набор». Уэллс B2-B6 используются для элементов управления отрицательных бассейн siRNA. Уэллс С2-С6 не transfected. Уэллс B7-B11 используются для cardamonin или SKF 86002 положительный контроль наркотиков как описано, и скважины C7-C11 используются для управления транспортным средством ДМСО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В Vitro модель проверки для HTS

Мы использовали Z' фактор анализ для определения пригодности SV40-НСЕС для использования в исследованиях HTS, как этот статистический тест используется для определения качества пробирного HTS24. Для ВЧ-Z' фактор анализ, клетки были посеяны на 1,25 x 103 клеток/Ну, transfected с отрицательным бассейн siRNA (как описано выше) 24 ч после посева и подвергаются 48 ч после трансфекции 0,0036% ЗДВ (1 x LD50), n = 3. Для CP Z' фактор анализ, клетки были посеяны transfected, как описано выше и после трансфекции 0,0008% подвергается 48 ч CP (1 x LD50), n = 5. Больше n был использован для исследования CP ввиду большей вариативности в этой модели воздействия. Z' фактор был рассчитан для Ил-8 выражение из неэкспонированные против воздействию клетки и негативные бассейн siRNA transfected фотопленки против подвергаются ячеек данных для CP и ЗДВ воздействия. Мы также проанализировали не transfected клеток, чтобы определить, есть ли эффект на качество анализа из-за малых интерферирующих РНК transfection. Многие итераций исследований проверки были выполнены во время уточнения условий воздействия и культуры в целях максимизации Z' фактор результаты. SV40 НСЕС прошла проверку и большинство итераций был Z' фактор значения больше 0,50 для ВЧ воздействия (Таблица 1) и CP воздействия (Таблица 2). Каждый реплицировать в этих таблицах был из клеток, покрытие на разные дни.

Воздействия группы Z'-фактор анализ
REP. #1 REP. #2 REP. #3
ВЧ облученных отрицательный контроль против неэкспонированные отрицательный контроль 0,68 0.5 0.56
ВЧ облученных против наивно 0.4 0,68 0.56

Таблица 1: SV40-НСЕС ЗДВ воздействия Z' фактор анализ ИЛ-8

Воздействия группы Z'-фактор анализ
REP. #1 REP. #2 REP. #3
CP-облученных отрицательный контроль против неэкспонированные отрицательный контроль 0.6 0,18 0.46
CP-облученных против наивно 0.42 0.29 0.42

Таблица 2: SV40-НСЕС CP воздействия Z' фактор анализ ИЛ-8

SiRNA первичный скрининг результаты ЗДВ ранения ячеек

Трансфекция оптимизации исследования были выполнены до скрининга, и siRNA, ориентация циклофилина b был использован для этих исследований. Обнаружение в situ РНК assay был использован для измерения уровня мРНК циклофилина b, и высокое содержание анализатор используется для количественного определения результатов. Мы достигли около 90% нокдаун б циклофилина и обычно не более чем 5-10% ячейка потерь с 4 пмоль siRNA/Ну и 0,3 мкл/хорошо трансфекции реагента (данные не показаны). Большее количество малых интерферирующих РНК фактически привели к бедным циклофилина b нокдаун (данные не показаны). Сходные уровни нокдаун были достигнуты с 1.2 пмоль/хорошо siRNA и 0,09 мкл/хорошо трансфекции реагент, но мы решили использовать 4 пмоль за хорошо для устранения любых целей, которые могут потребовать большее количество малых интерферирующих РНК для достижения эффективной нокдаун. Были также оценены целевой бросовым кинетика, и было отмечено, что цель нокдаун была максимальной, два дня после трансфекции (данные не показаны). Нокдаун последовательности целевого объекта через пластину был также проверенные (данные не показаны). Противовоспалительные препараты cardamonin и SKF 86002 используются в качестве позитивных элементов управления для ингибирования цитокиновой продукции для воздействия ЗДВ и CP, соответственно. Они были отобраны путем тестирования различных соединений с известными противовоспалительными свойствами в открытых ячейках. Дозы, используемые в скрининг исследований был выбран дозы ответ оптимизации исследований.

Высокая пропускная способность siRNA, скрининг стратегии, мы использовали стандартные и состоит из трех основных этапов: 1) первичный скрининг, деконволюции 2) библиотека и 3) целевой проверки. В первичный скрининг, фенотип каждой цели оценивается, используя смесь различных малых интерферирующих РНК последовательности как единый реагент для каждого гена. Цели являются затем вниз выбранные для библиотеки свёртки. В этот шаг каждый из последовательности различных малых интерферирующих РНК, которые объединяются для каждого гена в первичный скрининг тестируются отдельно. Целей пройти еще один вниз выбор в целевые проверки, в котором целевой фенотип подтверждается с наркотиками, фенотипом восстановления и/или малых интерферирующих РНК от другого поставщика. Для нашего основного экрана мы избрали для выполнения целенаправленных суб геномных экрана, вместо того, чтобы генома широкий экран по соображениям экономии. Microarray данных от ВЧ и CP ранения роговицы мыши и изобретательности пути анализа (IPA), были использованы для сосредоточить нашу целевую библиотеку для начального экрана (рукописи в подготовке). Вкратце роговицу мыши были подвержены токсиканта пара с помощью пара Кубок похож на ранее описанных методов25. Подвергаются роговицы кнопки и элементы управления были собраны в различных время должность точек воздействия. РНК был изолирован, и мониторинг качества и количества РНК. По словам производителя протокол26были эксперименты все microarray. Необработанный сигнал света были нормализованы и анализ, анализ главных компонент (PCA), чтобы определить существенные источники изменчивости в данных. Гены были ранга, приказал статистической значимости. Данные были заминированы и по сравнению с Джин списки предварительно siRNA библиотек. Из этих списков, Джин мы выбрали 3120 цели для скрининга. SiRNA библиотека был показан в клетках SV40 НСЕС (смотрите Рисунок 5 схема HTS протокола для основного экрана). Конечной точки оценки включены уровень ИЛ-8 в ячейку культуры среднего без мыть на основе бисера пробирного и жизнеспособность клеток МТТ пробирного. Клетки были подвержены 0.0036%HFA, как описано ранее, который равен примерно 1 x LD50. Жизнеспособность клеток оценивали МТТ пробирного 24 ч после воздействия. Эффект каждого пула малых интерферирующих РНК на жизнеспособность клеток была проанализирована на статистическую значимость по отношению к воздействию негативных бассейн среднего для каждой пластины, используя строго стандартизированной разницы средних (SSMD)27. Двойной фонарик участок SSMD и клеточной жизнеспособности фолд изменения показано на рисунке 6. Хит выбор порогов, выбранных для целей, которые усугубляют клеточной гибели или улучшить жизнеспособность клеток были SSMD ≤ -1.28 и SSMD ≥ 1,28, соответственно.

Figure 5
Рисунок 5 : Основной экран HTS протокол схема. Эта диаграмма показывает основные шаги, которые выполняются на каждый день для HTS протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Dual-фонарик участок siRNA эффект на клетки SV40 НСЕС Cell Viability of HFA-Exposed. Результаты, показанные для каждой цели являются в среднем шести реплицирует (n = 6). Данные жизнеспособность клеток выражаются как раз изменение по отношению к воздействию негативных бассейн управления siRNA, и SSMD был проанализирован статистической значимости. Цели, которые были SSMD ≤ -1.28 или ≥ 1.28 были выбраны в качестве хитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Эффект каждого пула малых интерферирующих РНК на производство HFA-индуцированной ИЛ-8 был проанализирован на статистическую значимость по отношению к воздействию негативных бассейн среднего для каждой пластины. ИЛ-8 в клеточной культуре супернатанта был начисленных пробирного 24 ч после воздействия. Двойной фонарик участок SSMD и ИЛ-8 раз изменения показано на рисунке 7. Хит выбор порогов, выбранных для целей, которые снизились производство ИЛ-8 были 40% снижение и SSMD ≤ -1,0. Хит выбор порогов, выбранный для целей, которые увеличили производство ИЛ-8 были пятикратное увеличение и SSMD > 1.28.

Figure 7
Рисунок 7 : Dual-фонарик участок siRNA эффекта на продукцию ИЛ-8 SV40 НСЕС клетками HFA-Exposed. Результаты, показанные в среднем шести реплицирует (n = 6). ИЛ-8 выражение уровня данных выражаются как раз изменение по отношению к воздействию негативных бассейн siRNA, и SSMD был проанализирован статистической значимости. Ответы были определены как цели, которые были на 40% снижение в ИЛ-8 уровней и SSMD ≤ -1,0 или пятикратное увеличение в IL-8 уровней и SSMD > 1.28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем наши методы и результаты на развитие высокой пропускной способности роговицы эпителиальных клеток, скрининг модель для изучения ВЧ и CP травм. Мы также представляем результаты от первичного siRNA экрана для ВЧ травмы. Там было много проблем для разработки моделей HTS для изучения TIC травм. Методы, которые мы могли бы найти в литературе, относящиеся к изучению HF, HFA или CP в модели культуры клеток имеют немного помочь. Большинство в vitro исследования на Ион фторида включать устные клеток и использовать фторид натрия и не кв или ЗДВ (для некоторых примеров, см28,29). Некоторые методологии в vitro подверженности бронхиальной эпителиальных клеток CP был опубликован Песонен и др. 30. в конечном итоге, мы нашли без конкретных методов в литературе, относящиеся к HTS изучение HF, HFA или CP и подавляющее большинство проблем и переменные, относящиеся к изучению этих токсикантов в HTS требует развития. Особое внимание было уделено достижению высокой степени воздействия согласованность во времени и многочисленные проверки пластин, необходимых для успешного изучения HTS.

Один тип проблемы с которыми было связано с применение токсикант систем культуры клеток. Некоторые токсикантов реактивной с или нестабильной в водных растворах. Ядовитых веществ, которые мы выбрали для изучения не рассматриваются как имеющие эти проблемы нестабильности. Сельскохозяйственные исследования photohydrolysis CP показали, что период полураспада 31.1 h подвергано действию к 1100 люкс ксенон источника света (Солнечный свет интенсивность пасмурный день) за 10 дней, 12 ч в день310,001 М раствором CP в воде. Существует нет измеримые гидролиза за тот же период 10 день, когда решение было сохранено в темноте. Протон и фторид ион ЗДВ явно стабильны в воде. Есть, однако, дополнительные стабильности соображения относительно токсиканта разведений в среде культуры клеток. Мы обнаружили, что когда впервые токсикантов разводили в среде культуры клеток, которые затем стабилизируется после непродолжительного периода времени было первоначального изменения цитотоксичность в некоторой степени. Мы считаем, что это обусловлено токсиканта привязки или комплексообразования с трехсторонними участниками в среде. Ячейки среднего содержит кальций, магний, белка, и т.д. , которые известны для взаимодействия с32,ионов фтора33. CP, как известно, имеют окислительных реакций с биологическими тиолами, но он также может привязать ДНК, белки и другие нуклеофилами34,35. После того как эти реакции и взаимодействия завершено или достигла равновесия, количество доступных токсикант стабилизирует и таким образом стабилизирует очевидной цитотоксичности. Первоначально, мы исследовали использования физиологического раствора и водных разведениях токсикантов для работы запасов, используется для воздействия, чтобы избежать токсиканта взаимодействия с средних составляющих рабочего разведения. Использование физиологического раствора также сохранит кислоты компонент травмы ЗДВ для воздействия выполняемых среднего обмена. Мы обнаружили, что ответы смерти клеток ядовитых веществ в воде и соли разведений были более разнообразны, чем метод, который используется клетки культуры среднего разведений с средних валют (данные не показаны). Что касается метод воздействия шипованные с ЗДВ изменчивость может быть из-за несоответствия в spike, диспергирования в хорошо ведет к клеточных мишеней, конкурирующих с средних составляющих для доступных фторид-ион. Полностью неясны причины изменчивости показателей ЗДВ воздействия средних обмен с физиологическим разведений ЗДВ. В любом случае экспозиции методы, с помощью физиологическим разведениях для HFA были заброшены и не изучены для CP. Токсичность нашего разведения ЗДВ в среде вероятно тесно имитирует исследования с использованием натрия фторид, потому что ячейки среднего буферов бесплатно протона в нашем ЗДВ разведениях.

Другие проблемы, с которыми мы столкнулись были связаны с уточнение модели культуры клеток для использования в Хайтс Мы сочли необходимым изменить составляющих культуры средних клеток для ячеек в эксперименты, особенно гидрокортизон и антибиотики. Мы использовали низкий уровень гидрокортизон (0,5 мкг/мл) в ходе исследования воздействия для подавления случайные Спайк в производстве цитокина, видели в наивной SV40 НСЕС. Это малое количество гидрокортизон не влияет отрицательно на реакции клеток на токсикант и был ниже уровней, обычно используется для подавления производство цитокинов культивируемых клеток в ответ на36,стимулятор37. Точные причины, почему наивно SV40 НСЕС клетки иногда производят избыточное цитокины не известны, но вполне возможно, что клетки переменно чувствительны к незначительные раздражители, которые происходят во время клетки пассированый и хромирование. Многие лаборатории регулярно включают антибиотики в ячейку культуры обслуживания среднего, но некоторые антибиотики, тетрациклины в частности, было показано, проявляют противовоспалительное воздействие на культивируемых клеток, включая38роговицы эпителиальных клеток. В целом наша лаборатория избегает использования антибиотиков, когда это возможно, поскольку эти потенциально может посрамить исследования. Мы также исследовали фенотипические дрейф за несколько проходов наших клеток в культуре. Она является общей для увековечен клетки пройти генетического и/или фенотипические дрейфа через несколько проходы, если не поддерживается в экспоненциальной фазе, если позволили достичь confluency, или если воздействию определенных экологических стрессоров39,40 ,41. Таким образом важно во время высокой пропускной способности экран, что линии клетки являются надлежащим образом и что экран завершения с помощью проход числа клеток, которые поддерживают известные фенотипические ответ. Несколькими хорошо пластины краевых эффектов явление, что клетки, выращенных в скважинах внешнего периметра нескольких хорошо плит часто же не отвечать или же последовательности, как клетки, выращенных в интерьере скважин42. Есть статистического упражнения, такие как средний польский, которые могут быть использованы для сведения к минимуму эффекты краев на набор данных43. Однако нет никаких статистических упражнение, которое может устранить краевых эффектов на конкретного целевого объекта или элемента управления, если всегда проверяется в край колодца и различной компоновки пластины между реплицирует двигаться целей или управления офф края колодцев не технически практические и экономически эффективным. Это наше мнение, что решение включить использование края скважин в на основе ячеек HTS анализов следует осторожно. Мы сочли необходимым для ликвидации использования клеток, выращиваемых в край скважин для элементов управления и целевых показателей.

Наши HTS ячейки модель и воздействия методологии в vitro ВЧ травмы был использован для успешного завершения основной siRNA экран 3120 целей. SSMD был использован для хит отбора, потому что было предложено специально для измерения величины разницы между элементом управления и siRNA27. Наши результаты на жизнеспособность клеток показывают, что существует линейная зависимость в двойной фонарик участок между SSMD и фолд изменения для практически всех целей. По этой причине мы использовали единый критерий SSMD хит выбора для этой конечной точки. ИЛ-8 данных различаются в том, что некоторые цели были слабыми, но последовательно эффекты в то время как другие показали сильный, но несовместимые эффекты. Таким образом мы использовали как раз изменения, так и SSMD для хит критерии для этой конечной точки. SSMD значения используется для хит отбора для обоих жизнеспособность клеток и ИЛ-8 данные были выбраны потому, что низкие накладные обнаружения и ставки-открытие44достижения предохранители между 1 и 1.645 (или -1 и-1.65). Там были некоторые цели, которые были хитами в жизнеспособность клеток и ИЛ-8 данных. В этих случаях отдается предпочтение для включения в библиотеке деконволюция те цели, которые оказывают их последствий в том же направлении, улучшения общего состояния здоровья (повышение жизнеспособности и снижение ИЛ-8) или усугубляет травмы (возросла клеточной смерти и Увеличение ИЛ-8). В целом мы выбрали в общей сложности 250 целей между жизнеспособность клеток и ИЛ-8 конечные точки, чтобы до деконволюции библиотека для ВЧ травмы. Главный экран для в vitro CP травмы.

Таким образом мы разработали экспозиции и культуры условия, подходящие для изучения HTS глазные травмы, HF и CP. Несколько переменных в условиях воздействия и культуры были уточнены и оптимизированы, и подходит для исследования HTS модели были подтверждены Z' фактор анализ. Далее мы доказали полезность этих моделей, выполнив главный экран библиотеки в модели ВЧ siRNA. Есть много травм и заболеваний, которые представляют без или ограниченный интерес для фармацевтических или биотехнологической промышленности, токсиканта травмы CP и ВЧ включены и появление робототехники benchtop облегчает изучение HTS травм и заболеваний в практически любой лаборатории . Высокая пропускная способность геномных данных наборы могут способствовать пониманию роли, которые конкретные гены играют травмы или болезни, которые могут помочь более эффективно сосредоточиться следовать в vitro или в vivo исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Оговорка: мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не отражают официальную политику Департамента армии, министерства обороны или правительства США. Это исследование было поддержано межведомственного соглашения между NIH/NIAID и USAMRICD и частично путем назначения к программе последипломного исследований участия в армии медицинский исследовательский институт химической обороны США в ведении дуб Хребет институт науки и образования посредством межведомственного соглашения между министерством энергетики США и USAMRMC.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано, национальных институтов из здравоохранения противодействовать программа межведомственного соглашения # AOD13015-001. Мы хотели бы поблагодарить Стефани Froberg и Питер Херст за их усилия и опыт на видео-продукции.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Tags

Биология выпуск 136 хлорпикрина фтористый водород роговицы эпителиальных клеток повреждение роговицы siRNA высокая пропускная способность скрининг
Высокая пропускная способность SiRNA скрининга для хлорпикрина и фтористый водород индуцированной роговицы травм эпителиальных клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehman, J. G., Causey, R. D.,… More

Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter