高通量小干扰RNA筛选是一种重要工具，有助于更快速地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。本文介绍了用于氢氟酸和氯化苦诱导角膜上皮损伤的高通量筛选暴露模型与方法的建立及验证。
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摘要
摘要
毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质有可能迅速造成严重的组织损伤。目前对毒物引起的角膜损伤的治疗通常为支持性治疗，尚无针对此类损伤的特异性治疗药物。为了开发有效的治疗方法和治疗手段，了解这些损伤的分子和细胞机制至关重要。我们提出，利用高通量小干扰RNA（siRNA）筛选可能是一种重要工具，有助于更快地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。siRNA是长度为19-25个核苷酸的双链RNA分子，通过转录后基因沉默途径降解与siRNA具有同源性的mRNA。随后可在暴露于毒物的细胞中研究特定基因表达降低的影响，以确定该基因在细胞对毒物反应中的功能。本文介绍了用于氢氟酸（HF）和氯化苦（CP）引起ocular损伤的体外（in vitro）暴露模型及高通量筛选（HTS）方法的建立与验证。尽管我们选择了这两种毒物作为研究对象，但经过对毒物暴露方案进行少量修改后，我们的方法同样适用于其他毒物的研究。本研究选用SV40大T抗原永生化的人角膜上皮细胞系SV40-HCEC。细胞活力和IL-8的产生被选为筛选方案的终点指标。本文还阐述了在建立适用于HTS研究的毒物暴露和细胞培养方法过程中所面临的若干挑战。建立这些毒物的高通量筛选模型，有助于进一步深入理解损伤机制，并可用于筛选潜在的化学性ocular损伤治疗药物。
引言
毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质可能迅速造成严重的组织损伤。遗憾的是，目前对毒物所致角膜损伤的治疗仅限于一般性支持措施，尚无针对此类损伤的特异性治疗方法。当前的治疗策略缺乏特异性，主要采用局部治疗，如使用润滑剂、抗生素和睫状肌麻痹剂，待角膜重新上皮化后，再使用抗炎药物（例如，类固醇）1,2。尽管现有的治疗手段已是最优选择，但由于角膜进行性混浊和新生血管形成，患者的长期预后通常较差2,3。
动物模型传统上被用于研究化学物质的毒性并阐明损伤机制。然而，动物实验耗时且成本高昂，同时目前也存在减少动物实验的努力。例如，欧盟的REACH法规（EC 1907/2006）包含旨在减少动物实验的条款，这些条款要求企业共享已有数据，以避免重复开展动物实验，并在实施拟议的动物实验前须获得欧洲化学品管理局的批准。根据REACH法规的规定，动物实验应作为最后手段。此外，欧盟《化妆品法规》（EC 1223/2009）已逐步禁止在动物身上进行化妆品测试。当必须开展动物实验时，应遵循“3R原则”（优化、减少和替代），该原则为实施更人道的动物研究、减少使用动物数量以及在可能的情况下采用非动物替代方法提供了框架。基于上述原因，毒理学....
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方案
1. 细胞培养的维持
- 在 DMEM F-12 培养基中培养 SV40-HCEC 细胞系，培养条件为 37 °C、5% CO2 和 90% 湿度，培养基中添加 15% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、10 µg/L 表皮生长因子（EGF）和 5 mg/L 胰岛素。
- 每 3 至 4 天传代一次细胞系（根据接种密度而定），以确保在培养过程中细胞融合度从不超过 80%。
- 使用消化液（每 150 cm2 培养瓶使用 14 mL 消化液）在 37 °C 下孵育不超过 8 分钟，使细胞从培养瓶壁脱离。
- 用等体积的细胞培养基中和消化液，并将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中，在 160 × g 条件下离心 7 分钟以收集细胞沉淀。
- 用培养基重悬细胞沉淀（每 150 cm2 培养瓶使用 20 mL 培养基）。
- 使用自动手持式细胞计数仪计数细胞，并以适当的密度接种至新培养瓶中，确保细胞可在 3 至 4 天内生长而不超过 80% 融合度。
2. 为实验接种细胞
- 使用相差显微镜检查SV40-HCEC培养瓶，确保细胞融合度低于80%，并评估细胞整体健康状况。
- 按照细胞培养维护步骤1.3至1.6所述方法，消化、离心、重悬并计数来自培养瓶的S....
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结果
暴露方法的开发
我们优化并评估了人角膜上皮细胞系 SV40-HCEC 在高通量筛选（HTS）研究中的适用性。SV40-HCEC 细胞通过 SV-40 大 T 抗原永生化获得，由 Dhanajay Pal23 惠赠。在暴露方法学开发过程中探索的变量过多，无法在此简洁呈现，因此仅展示部分我们认为可能对多种毒性物质具有更广泛适用性的研究结果。
通过加样或培养基更换进行毒物暴露
我们最初尝试通过将5 µL用蒸馏水、生理盐水或培养基稀释的毒物工作液加入到96孔板每个孔中已有的95 µL培养基中，使细胞暴露于目标终浓度。SV4.......
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讨论
本文介绍了我们为研究氢氟酸（HF）和氯化磷（CP）损伤而建立的高通量角膜上皮细胞筛选模型的方法与结果。同时，我们还展示了针对HF损伤的初次siRNA筛选结果。在建立用于研究化学性眼损伤（TIC）的高通量筛选（HTS）模型过程中，存在诸多挑战。文献中可查到的关于在细胞培养模型中研究HF、氢氟酸（HFA）或CP的方法，对我们的帮助十分有限。大多数 体外 关于氟离子的研究涉及口腔细胞，并使用氟化钠而非HF或HFA（部分示例如下所示，参见28,29）。一些关于该 体外 佩索尼已发表关于支气管上皮细胞暴露于CP的研究 等30最终，我们发现文献中尚无与HF、HFA或CP的高通量筛选（HTS）研究相关的特定方法，与这些有毒物质在HTS中研究相关的绝大多数挑战和变量均需自行开发解决。为确保HTS研究的成功，特别关注实现在时间和大量筛选板之间高度一致的暴露条件。
在细胞培养系统中毒性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
免责声明：本文所表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国陆军部、美国国防部或美国政府的官方立场。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）与美国陆军化学防御医学研究所（USAMRICD）之间机构间协议的支持，部分研究还得到了美国能源部与美国陆军医学研究与物资司令部（USAMRMC）之间机构间协议通过橡树岭科学与教育研究所管理的美国陆军化学防御医学研究所博士后研究参与计划的资助。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院CounterACT项目机构间协议（编号：AOD13015-001）的支持。我们感谢Stephanie Froberg和Peter Hurst在视频制作方面的努力与专业支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bravo液体处理平台 | Agilent或同等产品 | G5409A | |
| Bravo平板振荡器 | Agilent或同等产品 | Option 159 | |
| Bravo 96LT一次性吸头头 | Agilent或同等产品 | Option 178 | 96通道大吸头移液头单元 |
| Bravo 96ST一次性吸头头 | Agilent或同等产品 | Option 177 | 96通道小吸头移液头单元 |
| Bravo 384ST一次性吸头头 | Agilent或同等产品 | Option 179 | 384通道小吸头移液头单元 |
| Bravo 96 250 μL无菌屏障吸头 | Agilent或同等产品 | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL无菌屏障吸头 | Agilent或同等产品 | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL无菌屏障吸头 | Agilent或同等产品 | 19133-212 | |
| EnSpire多功能酶标仪 | Perkin Elmer或同等产品 | 2300-0000 | 配备高功率激光激发的AlphaLISA检测仪 |
| IL-8（人）AlphaLISA检测试剂盒 | Perkin Elmer或同等产品 | AL224F | 免洗涤珠基检测法 |
| ProxiPlate-384 Plus白色384浅孔微孔板 | Perkin Elmer或同等产品 | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen或同等产品 | 13778500 | 转染试剂 |
| Opti-MEM 1减血清培养基 | Invitrogen或同等产品 | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco或同等产品 | 12605010 | 细胞解离溶液 |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments或同等产品 | ESSEN BIOSCI 4473 | 置于培养箱内的全自动显微镜 |
| 氯化苦 | Trinity Manufacturing或同等产品 | N/A | 具有急性毒性和刺激性 |
| DMEM-F12细胞培养基 | Invitrogen或同等产品 | 11330-057 | 含HEPES |
| 胎牛血清 | Invitrogen或同等产品 | 1891471 | |
| 人表皮生长因子（细胞培养级） | Invitrogen或同等产品 | E9644-.2MG | |
| 重组人胰岛素（细胞培养级） | Invitrogen或同等产品 | 12585-014 | |
| 青霉素-链霉素溶液（细胞培养级） | Invitrogen或同等产品 | 15140122 | |
| 氢化可的松（细胞培养级） | Sigma或同等产品 | H0888-10G | |
| 葡萄糖 （细胞培养级） | Sigma或同等产品 | G7021 | |
| PBS （细胞培养级） | Sigma或同等产品 | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon或同等产品 | 各种 | |
| 噻唑蓝四氮唑溴盐 | Sigma或同等产品 | M5655 | MTT检测底物 |
| siRNA缓冲液 | Thermo或同等产品 | B002000 | |
| 96孔细胞培养板 | Corning或同等产品 | CLS3595 | |
| T150细胞培养瓶 | Corning或同等产品 | CLS430825 | |
| BSL-2级细胞培养生物安全柜 | Nuaire或同等产品 | NU-540 | |
| 300 mL机器人用储液槽 | Thermo或同等产品 | 12-565-572 | |
| 96孔带挡板自动化储液槽 | Thermo或同等产品 | 1064-15-8 | |
| 500 mL无菌一次性储存瓶 | Corning或同等产品 | CLS430282 | |
| 微孔板热封仪 | Thermo或同等产品 | AB-1443A | |
| 微孔板热封膜 | Thermo或同等产品 | AB-0475 | |
| 豆蔻素 | Tocris或同等产品 | 2509 | 抗炎剂，用作阳性对照 |
| SKF 86002 | Tocris或同等产品 | 2008 | 抗炎剂，用作阳性对照 |
| DMSO | Sigma或同等产品 | D8418 | |
| 48%氢氟酸 | Sigma或同等产品 | 339261 | 具有腐蚀性和急性毒性 |
| 1000 μL单通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17014382 | |
| 200 μL单通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17014391 | |
| 20 μL单通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17014392 | |
| 1000 μL 12通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17014497 | |
| 200 μL 12通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17013810 | |
| 20 μL 12通道移液器 | Rainin或同等产品 | 17013808 | |
| 移液器吸头 1000 μL | Rainin或同等产品 | 17002920 | |
| 移液器吸头 200 μL | Rainin或同等产品 | 17014294 | |
| 移液器吸头 20 μL | Rainin或同等产品 | 17002928 | |
| 化学通风橱 | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384孔样品储存板 | Thermo或同等产品 | 262261 | |
| 氯化钠 | Sigma或同等产品 | S6191 | |
| 50 mL锥形管 | Thermo或同等产品 | 14-959-49A | |
| 50 mL血清移液管 | Corning或同等产品 | 07-200-576 | |
| 25 mL血清移液管 | Corning或同等产品 | 07-200-575 | |
| 10 mL血清移液管 | Corning或同等产品 | 07-200-574 | |
| 5 mL血清移液管 | Corning或同等产品 | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC永生化人角膜上皮细胞 | N/A | N/A | 这些细胞不对外销售，但可从本文引用的研究人员处获得 |
| Sceptor手持式自动细胞计数仪 | Millipore或同等产品 | PHCC20060 | |
| GeneTitan多通道（MC）仪器 | Affymetrix或同等产品 | 00-0372 | |
| Affymetrix 24孔和96孔阵列板 | Affymetrix或同等产品 | 901257; 901434 | |
| Draegger HF管 | Draeger或同等产品 | 8103251 | |
| Draegger CP管 | Draeger或同等产品 | 8103421 | |
| Draegger泵 | Draeger或同等产品 | 6400000 | |
| 透明板密封膜 | Resesarch Products International或同等产品 | 202502 | |
| 试剂储液槽 | VistaLab Technologies或同等产品 | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS或同等产品 | N/A | 用于自动曲线拟合的Excel插件 |
参考文献
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X.
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