فحص SiRNA الإنتاجية العالية لإصابة الخلايا الظهارية الكلوروبيكرين والقرنية المستحثة بفلوريد الهيدروجين

ملخص

فحص الحمض النووي الريبي المثبطة صغيرة إنتاجية عالية هو أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. وهنا، نقدم التنمية والتحقق من التعرض لنماذج وأساليب لفحص إنتاجية عالية من فلوريد الهيدروجين وبكرين-الناجمة عن إصابة القرنية الظهارية.

الملخص

المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. في الجهود الرامية تطوير علاجات والمداواة للعناية بالتعرض، يمكن أن يكون هاما فهم الآليات الجزيئية والخلوية لهذه الإصابات. ونحن نقترح أن استخدام فحص الحمض النووي الريبي (siRNA) المثبطة صغيرة عالية الإنتاجية يمكن أن تكون أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. siRNA هي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي جزيئات النيوكليوتيدات 19-25 طويلة واستخدام الجينات بوستترانسكريبشونال إسكات ممرا للحط من مرناً لها التماثل siRNA. يمكن ثم دراسة تخفيض الناتج من التعبير عن الجينات محددة في الخلايا المعرضة السمية للتأكد من الوظيفة من تلك الجينات في الاستجابة الخلوية لأنها سامة. وترد بالتنمية والتحقق من الصحة في المختبر تعرض نماذج وأساليب إنتاجية عالية فحص (HTS)-فلوريد الهيدروجين (HF) وبكرين-(CP) الناجم عن إصابة العين في هذه المقالة. على الرغم من أن علينا تحديد هذه سميات اثنين، أساليب عملنا وقابلة للتطبيق لدراسة أخرى سميات مع إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول التعرض للسمية. مستضد تي كبيرة SV40 خلد خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 اختيرت للدراسة. اختير بقاء الخلية وإنتاج إيل-8 كنقاط النهاية في البروتوكول الفحص. العديد من التحديات المرتبطة بتطوير للتعرض للسمية وتعرض الخلية الثقافة أساليب مناسبة للدراسات HTS. إنشاء نماذج HTS لهذه سميات يسمح لمزيد من الدراسات فهم أفضل لآلية العلاجات المحتملة لإصابة العين الكيميائية للإصابة وعلى الشاشة.

المقدمة

المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. ولسوء الحظ، علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة فقط مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. استراتيجية العلاج الحالي غير محددة وتشمل أساسا العلاجات العلاجية الموضعية مثل مواد التشحيم، والمضادات الحيوية، وسيكلوبليجيكس تليها مضادات الالتهاب (مثلاً، المنشطات) مرة القرنية قد أعيد متظهرنه^{1 ،2}. أفضل الحالية العلاج العلاجية الخيارات المتاحة، وعلى الرغم من التوقعات الطويلة الأجل ضعيف عموما بسبب يعكر القرنية التدريجي و²

البروتوكول

1-خلية ثقافة الصيانة

1. تنمو الخلية خط هسيك SV40 في 5% CO₂, 37 درجة مئوية والرطوبة 90% في 12 و دميم مع 15% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% ل الجلوتامين، 10 عامل نمو البشرة من ميكروغرام/لتر (مماثلة)، والإنسولين 5 مغ/لتر.
2. مرور خط الخلية كل 3 إلى 4 أيام (اعتماداً على كثافة البذر) التأكد من أن كونفلوينسي لم يتجاوز 80% أثناء صيانة الثقافة.
3. فصل الخلايا من قوارير باستخدام حل مفرزة (14 مل الحل لكل قارورة² 150 سم) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 8 دقيقة.
4. تحييد الحل مفرزة مع زيادة حجم الخلية الثقافة المتوسطة متساوية وبيليه الخلايا في أنابيب مخروطية 50 مل بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 160 x ز.
5. إعادة تعليق....

النتائج

تطوير أسلوب التعرض

المكررة، وتقييم مدى ملاءمة خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 لاستخدامها في الدراسات HTS. تم تخليد استخدام مستضد تي كبيرة SV-40 هسيك SV40 وكانت هدية من دهاناجاي بال²³. لذلك، فقط بعض عينات من النتائج التي توصل إليها ونعتقد قد تكون واجبة التطبيق على نطاق أوسع ترد سميات متعددة إلى، وهناك عدد كبير جداً من المتغيرات استكشافها في التعرض لوضع منهجية لتقديم إيجاز هنا.......

المناقشة

هنا يصف لنا لدينا الأساليب والنتائج في تطوير إنتاجية عالية القرنية الظهارية خلية فحص نموذج لدراسة الإصابات التردد وحزب المحافظين. ونقدم أيضا النتائج من الشاشة siRNA الأولية لإصابة التردد. وهناك العديد من التحديات لتطوير نماذج HTS لدراسة إصابات التشنج. الأساليب التي يمكن أن نجد في الأدبيات ذات الصلة بالدراسة من التردد، أو الصحة، أو حزب المحافظين في نماذج الثقافة الخلية عن القليل من المساعدة. معظم الدراسات في المختبر على أيون الفلوريد تنطوي على خلايا الفم ويستخدم فلوريد الصوديوم وعدم التردد أو الصحة (بالنسبة لبعض .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
منصة تسليم السوائل Bravo	Agilent أو ما يعادلها	G5409A
Bravo	شاكر Agilent أو ما يعادلها	الخيار 159
Bravo 96LT رأس طرف يمكن التخلص منه	Agilent أو ما يعادله	الخيار 178	وحدة رأس ماصة ذات طرف كبير 96 قناة
Bravo 96ST رأس طرف يمكن التخلص	Agilent أو ما يعادله	الخيار 177	ماصة ذات طرف صغير 96 قناة وحدة الرأس
Bravo 384ST رأس طرف يمكن التخلص	منه Agilent أو ما يعادله	الخيار 179	رأس ماصة صغيرة ذات طرف صغير 384
قناة Bravo 96 250 & mu ؛ L نصائح حاجز معقمة	Agilent أو ما يعادلها	19477-022
Bravo 384 30 & mu ؛ L نصائح حاجز معقمة	Agilent أو ما يعادلها	19133-212
Bravo 384 70 & mu ؛ L نصائح حاجز معقمة	Agilent أو ما يعادلها	19133-212
قارئ لوحة EnSpire متعدد الأوضاع	Perkin Elmer أو ما يعادله	2300-0000	كاشف فحص AlphaLISA مع إثارة ليزر عالية الطاقة
IL-8 (بشري) AlphaLISA Detection Kit   ؛	Perkin Elmer أو ما يعادله	AL224F	الفحص القائم على الخرزة بدون غسل
ProxiPlate-384 Plus الأبيض 384 بئر ضحل	Perkin Elmer أو ما يعادله	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen أو ما يعادله	13778500	كاشف Transfection
Opti-MEM 1 مصل مخفض متوسط	Invitrogen أو ما يعادله	31985070
TrypLE Express	Gibco أو ما يعادله	12605010	حل انفصال الخلايا
IncuCyte Zoom	Essen Instruments أو ما يعادله	ESSEN BIOSCI 4473	مجهر آلي موجود في حاضنة
Chloropicrin	Trinity Manufacturing أو ما يعادله	N / A	سمية حادة ومهيجة
DMEM-F12 وسيط زراعة	الخلايا Invitrogen أو ما يعادله	11330-057	يحتوي على HEPES
مصل الأبقار الجنيني	Invitrogen أو ما يعادله	1891471
عامل نمو البشرة البشري (درجة زراعة الخلايا)	Invitrogen أو ما يعادله	E9644-.2MG
الأنسولين البشري المؤتلف (درجة زراعة الخلايا)	Invitrogen أو ما يعادله	12585-014
محلول البنسلين الستربتومايسين (درجة زراعة الخلايا)	Invitrogen أو ما يعادلها	15140122
الهيدروكورتيزون (درجة ثقافة الخلايا)	سيجما أو ما يعادلها	H0888-10G
الجلوكوز  (درجة زراعة الخلية)	Sigma أو ما يعادلها	G7021
PBS & nbsp ؛ (درجة زراعة الخلية)	Sigma أو ما يعادلها	P5493
siRNA	Dharmacon أو ما يعادلها	من العديد من
Thiazolyl الأزرق tetrazolium bromide	Sigma أو ما يعادلها	M5655	MTT فحص الركيزة
siRNA buffer	Thermo أو ما يعادلها	B002000
ثقافة الخلايا T150 قوارير	Corning أو ما يعادلها	CLS430825
مزرعة الخلايا BSL-2	Nuaire أو ما يعادلها	NU-540
300 مل الخزانات الروبوتية	Thermo أو ما يعادلها	12-565-572   ؛
96 خزان أتمتة محير	حراري أو ما يعادله	1064-15-8
500 مل زجاجات تخزين معقمة يمكن التخلص منها Corning	أو ما يعادلها	CLS430282
سدادة حرارية	Microplate Thermo أو ما يعادلها	AB-1443A
رقائق ختم حراري	Microplate Thermo أو ما يعادلها	AB-0475
Cardamonin	Tocris أو ما يعادل	2509	مضاد للالتهابات ، يستخدم كتحكم إيجابي
SKF 86002 & nbsp ؛	Tocris أو ما يعادلها	2008	مضاد للالتهابات ، يستخدم كتحكم إيجابي
DMSO	Sigma أو ما يعادله	D8418
48٪ حمض الهيدروفلوريك	سيجما أو ما يعادله	339261	السمية المسببة للتآكل والحادة
1000 & L ماصات أحادية القناة	Rainin أو ما يعادلها	17014382
200 مو ؛ L ماصات أحادية القناة	Rainin أو ما يعادلها	17014391
20 مو ؛ L ماصات أحادية القناة	Rainin أو ما يعادلها	17014392
1000 مو ؛ ماصات L 12 قناة	Rainin أو ما يعادلها	17014497
200 مو ؛ ماصات L 12 قناة	Rainin أو ما يعادلها	17013810
20 مو ؛ ماصات L ذات 12 قناة	Rainin أو ما يعادلها	17013808
أطراف الماصات 1000 & mu; L	Rainin أو ما يعادلها	17002920
أطراف الماصة 200 مو ؛ L	Rainin أو ما يعادلها	17014294
أطراف الماصة 20 & mu; L	Rainin أو ما يعادله	17002928
غطاء الدخان الكيميائي	Jamestown Metal Products	MHCO_229
ألواح تخزين العينات 384 بئر	الحرارية أو ما يعادلها	262261
كلوريد الصوديوم	Sigma أو ما يعادلها	S6191
50 مل أنابيب مخروطية	حرارية أو ما يعادلها	14-959-49A
ماصات مصلية 50 مل	Corning أو ما يعادلها	07-200-576
الماصات المصلية 25 مل	Corning أو ما يعادلها	07-200-575
الماصات المصلية 10 مل	Corning أو ما يعادلها	07-200-574
الماصات المصلية 5 مل	Corning أو ما يعادلها	07-200-573
SV40-HCEC الخلايا الظهارية للقرنية البشرية الخالدة	N / A	N / A	هذه الخلايا غير متوفرة تجاريا ، ولكن يمكن الحصول عليها من المحققين المذكورين في مقالة
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore أو ما يعادلها	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix أو ما يعادلها	00-0372
Affymetrix 24- و 96-array plates	Affymetrix أو ما يعادلها	901257 ؛ 901434
Draegger أنبوب HF	Draeger أو ما يعادله	8103251
أنبوب Draegger CP	Draeger أو ما يعادله	8103421
مضخة Draegger	Draeger أو ما يعادلها	6400000
أختام لوحة شفافة	منتجات Resesarch Products International أو ما يعادلها	202502
كاشف	كاشف VistaLab Technologies أو ما يعادلها	3054-1000
Xlfit	IDBS أو الوظيفة الإضافية	N / A	Excel المكافئة المستخدمة لتركيب المنحنى الآلي

لوحة منه وحدة لوحات ثقافة الخلايا 96 بئر Corning أو ما يعادلها CLS3595 غطاء