Summary
فحص الحمض النووي الريبي المثبطة صغيرة إنتاجية عالية هو أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. وهنا، نقدم التنمية والتحقق من التعرض لنماذج وأساليب لفحص إنتاجية عالية من فلوريد الهيدروجين وبكرين-الناجمة عن إصابة القرنية الظهارية.
Abstract
المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. في الجهود الرامية تطوير علاجات والمداواة للعناية بالتعرض، يمكن أن يكون هاما فهم الآليات الجزيئية والخلوية لهذه الإصابات. ونحن نقترح أن استخدام فحص الحمض النووي الريبي (siRNA) المثبطة صغيرة عالية الإنتاجية يمكن أن تكون أداة هامة يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية لإصابة الظهارة القرنية الكيميائية أكثر سرعة. siRNA هي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي جزيئات النيوكليوتيدات 19-25 طويلة واستخدام الجينات بوستترانسكريبشونال إسكات ممرا للحط من مرناً لها التماثل siRNA. يمكن ثم دراسة تخفيض الناتج من التعبير عن الجينات محددة في الخلايا المعرضة السمية للتأكد من الوظيفة من تلك الجينات في الاستجابة الخلوية لأنها سامة. وترد بالتنمية والتحقق من الصحة في المختبر تعرض نماذج وأساليب إنتاجية عالية فحص (HTS)-فلوريد الهيدروجين (HF) وبكرين-(CP) الناجم عن إصابة العين في هذه المقالة. على الرغم من أن علينا تحديد هذه سميات اثنين، أساليب عملنا وقابلة للتطبيق لدراسة أخرى سميات مع إجراء تعديلات طفيفة على البروتوكول التعرض للسمية. مستضد تي كبيرة SV40 خلد خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 اختيرت للدراسة. اختير بقاء الخلية وإنتاج إيل-8 كنقاط النهاية في البروتوكول الفحص. العديد من التحديات المرتبطة بتطوير للتعرض للسمية وتعرض الخلية الثقافة أساليب مناسبة للدراسات HTS. إنشاء نماذج HTS لهذه سميات يسمح لمزيد من الدراسات فهم أفضل لآلية العلاجات المحتملة لإصابة العين الكيميائية للإصابة وعلى الشاشة.
Introduction
المستحثة بأنها سامة لإصابة العين حالة طوارئ العين حقيقية لأن المواد الكيميائية لديها القدرة على سرعة إلحاق أضرار كبيرة من الأنسجة. ولسوء الحظ، علاجات لإصابات القرنية المستحثة بأنها سامة فقط مؤيدة بصفة عامة نظراً لعدم وجود لا علاجية محددة لعلاج هذه الإصابات. استراتيجية العلاج الحالي غير محددة وتشمل أساسا العلاجات العلاجية الموضعية مثل مواد التشحيم، والمضادات الحيوية، وسيكلوبليجيكس تليها مضادات الالتهاب (مثلاً، المنشطات) مرة القرنية قد أعيد متظهرنه1 ،2. أفضل الحالية العلاج العلاجية الخيارات المتاحة، وعلى الرغم من التوقعات الطويلة الأجل ضعيف عموما بسبب يعكر القرنية التدريجي و2،نيوفاسكولاريزيشن3.
تقليديا قد استخدمت نماذج حيوانية التحقيق في المواد الكيميائية السمية وفهم آليات الإصابة. بيد أن الدراسات الحيوانية مضيعة للوقت ومكلفة. وهناك أيضا الجهود الرامية إلى الحد من التجارب الحيوانية. على سبيل المثال، قد تصل التشريعات (EC 1907/2006) في الاتحاد الأوروبي أحكاما ترمي إلى الحد من التجارب الحيوانية. وتشمل الأحكام شرط أن الشركات المشاركة في البيانات تجنبا للتجارب الحيوانية والحصول على موافقة من وكالة المواد الكيميائية الأوروبية قبل إجراء الاختبارات المقترحة على الحيوانات. تحت أحكام الوصول، الحيوان اختبار ينبغي أن يكون الملاذ الأخير. وهناك أيضا "اللائحة الأوروبية لمستحضرات التجميل" (EC 1223/2009) أن تدريجيا إلى اختبار مستحضرات التجميل في الحيوانات. عندما يتم إجراء الدراسات الحيوانية، هي تسترشد بمبادئ 3Rs (الصقل والحد، واستبدال)، التي توفر إطارا لإجراء بحوث الحيوانات أكثر إنسانية، وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة، واستخدام البدائل غير الحيوان حيثما كان ذلك ممكناً. لهذه الأسباب، وسعت مجال علم السموم اعتماد فحوصات في المختبر التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية لسمية ويمكن القيام به في أعلى إنتاجية4. هذا نهج علم السموم فنية حيث يتم تعريف سميات وظيفتها وليس حصرا بالكيمياء. اتخذت خطوة أخرى، وظيفية التعرضات تسعى إلى فهم الأدوار التي تلعب جينات محددة في آثار سميات5. مع تطبيق التكنولوجيا siRNA، يمكن القيام به للتحقيق في وظيفة الجينات في الاستجابات الجزيئية والخلوية سميات شاشات في إنتاجية عالية. siRNA هي مزدوجة جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل التي هي 19-25 النيوكليوتيدات طويلة أن الاستفادة من وظيفة الجينات النسخي إسكات المسار الحالي في جميع خلايا الثدييات6. هذه هي صناعيا ومصممة لاستهداف جين محددة. عند إدخال في خلية، يتم معالجة في siRNA وواحدة حبلا، حبلا الدليل، يتم تحميلها في المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC). SiRNA يوجه RISC إلى منطقة متكاملة في جزيء مرناً، ويحط RISC مرناً. ينتج عن هذا الحد التعبير عن الجينات المحددة. يمكن ثم دراسة تخفيض الناتج من التعبير عن الجينات محددة في الخلايا المعرضة السمية للتأكد من الوظيفة من تلك الجينات في الاستجابة الخلوية لأنها سامة. وقد استخدمت هذا نهج زيادة فهم آليات قابلية مادة الريسين والتعريفي المعتمدة على فهرس CYP1A17،8.
وقد مفصلة قائمة تقييم خطر الإرهاب الكيميائي (كترا) وقوائم المواد الكيميائية الصناعية السامة (عرة) تحديد المواد الكيميائية استناداً إلى السمية واحتمال أن يكون أطلقت أثناء الإرهاب أو الحرب، أو حادث صناعي الحدث9. ونحن نطبق إنتاجية عالية siRNA فحص نهج توكسيكوجينوميك (HTS) لدراسة سميات قائمة كترا، التي تم تحديدها للخطر عالية للاستخدام في حادث إرهابي. علم السموم التقليدية يسعى إلى فهم الآثار السلبية للمواد الكيميائية على الكائنات الحية؛ ومع ذلك، يتعين علينا زيادة رغبة في فهم آليات الإصابة غرض إعلام تطوير المداواة والنهج العلاجية، وربما، لاكتشاف الجزيئات التي يمكن أن تكون هدفا للتنمية العلاجية. ويمكن اعتبار هذا الجهد في بعض طرق مماثلة لاستخدام الفحص siRNA عالية الإنتاجية وفحوصات الخلية على أساس في عملية اكتشاف المخدرات10. وستكون فرق كبير أن اكتشاف المخدرات عادة ما يسعى هدفا المفرد لاكتشاف العلاج بينما من غير المحتمل إلى حد ما أن هناك هدفا فريدة ذات قيمة علاجية عالية لعلاج التعرض للسمية في نهجنا. ونحن نتوقع أن أي نموذج العلاج الفعال للتعرض للسمية ستتطلب اتباع نهج متعدد الأوجه لتحقيق القيمة العلاجية العالية، ويجوز إبلاغ البيانات توكسيكوجينوميك حيوية نموذج علاج فعال.
أتمتة Benchtop يجلب منهجية عالية الإنتاجية إلى مختبرات خارج الصناعات الصيدلانية أو التكنولوجيا الحيوية. الدراسات في المختبر في معهد بلدنا تاريخيا فحوصات التقليدية التي هي منخفضة الإنتاجية11،،من1213. في السنوات القليلة الماضية، انتقلت المختبر باستخدام الروبوتات benchtop إجراء فحص siRNA عالية الإنتاجية. هنا، نحن نقدم صقل نماذج خلية العين ووضع في المختبر طرق التعرض لفلوريد الهيدروجين (HF) وبكرين (CP) مناسبة لفحص siRNA عالية الإنتاجية. وهدفنا هو تحديد الجزيئات التي تنظم الضرر الخلوي استجابة لهذه السموم. وتشمل أهداف المكتبة siRNA اخترنا ز إلى جانب البروتين مستقبلات البروتين مؤنزم، البروتياز، phosphatases، قنوات أيون وأهداف أخرى يحتمل أن تكون دروجابل. التردد و CP اختيرت للدراسة بالإسناد الترافقي كترا قائمة وكلاء مع تقارير الحوادث الصناعية توكسنيت للعثور على تلك التي تقدم أعظم خطر الإصابة العينية عبر بخار التعرض9،14. CP (الصيغة الكيميائية Cl3CNO2، رقم 76-06-2) أصلاً كغاز المسيل للدموع في الحرب العالمية الأولى15. حاليا استخدامه تبخير زراعية والوظائف ك الخيطيات، ومبيد للفطريات والمبيدات الحشرية16. فلوريد الهيدروجين (HF) يستخدم في العمليات بما في ذلك الألكلة في مصافي النفط والفلوره الكهروكيميائية للمركبات العضوية17. التردد (الصيغة الكيميائية ذات التردد العالي، CAS رقم 62778-11-4) غاز ولكن في شكله مائي من حمض الهيدروفلوريك (الصحة، CAS رقم 7664-39-3). ولذلك، انتخبنا لاستخدام هيئة في أعمالنا في الخلية نماذج التعرض. مستضد تي كبيرة SV40 خلد خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 اختيرت للدراسة. بقاء الخلية وعلامة التهاب إيل-8 اختيرت كنقاط النهاية نظراً للأهداف التي تشارك في الضرر الخلوي ينبغي أن تنعكس في موت الخلية والاستجابة الالتهابية. على وجه التحديد، إذا كانت هدفا تقوم بدور وقائي في التعرض للسمية، موت الخلية و/أو إنتاج سيتوكين التحريضية ينبغي زيادة عندما يتم تثبيط التعبير الهدف قبل siRNA. على العكس سيكون صحيحاً للأهداف التي تقوم بدور سلبي. التهاب مزمن يظهر أيضا، أن تلعب دوراً في أمراض القرنية بعد التعرض، والتدخل في مسارات موت الخلية قد يحسن النتائج السريرية2،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-خلية ثقافة الصيانة
- تنمو الخلية خط هسيك SV40 في 5% CO2, 37 درجة مئوية والرطوبة 90% في 12 و دميم مع 15% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% ل الجلوتامين، 10 عامل نمو البشرة من ميكروغرام/لتر (مماثلة)، والإنسولين 5 مغ/لتر.
- مرور خط الخلية كل 3 إلى 4 أيام (اعتماداً على كثافة البذر) التأكد من أن كونفلوينسي لم يتجاوز 80% أثناء صيانة الثقافة.
- فصل الخلايا من قوارير باستخدام حل مفرزة (14 مل الحل لكل قارورة2 150 سم) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 8 دقيقة.
- تحييد الحل مفرزة مع زيادة حجم الخلية الثقافة المتوسطة متساوية وبيليه الخلايا في أنابيب مخروطية 50 مل بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 160 x ز.
- إعادة تعليق بيليه خلية في المتوسط (20 مل لكل قارورة2 150 سم).
- عد الخلايا بالعداد الآلي خلية يده والبذور في قوارير جديدة في كثافة التي تسمح لها بأن تنمو لمدة 3 إلى 4 أيام دون تجاوز 80% كونفلوينسي.
2-لوحة خلايا للتجريب
- تحقق من قوارير SV40-هسيكس بالضوء الطوري لضمان أن كونفلوينسي أقل من 80% وتقييم الصحة العامة الخلية.
- فصل وبيليه، ريسوسبيند، وتعول SV40-هسيكس من قوارير كما هو موضح في الخطوات 1، 3 إلى 1، 6 خلية ثقافة الصيانة. استخدام هسيك SV40 المتوسطة التي تحتوي على الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام/ملليلتر (المتوسط هكورت) إلى ريسوسبيند الخلايا.
- في زجاجة متوسطة الحجم المتاح، وإعداد تعليق SV40-هسيكس في خلايا/مل 17,857 في حرارة قبل هكورت المتوسطة.
- إعداد كمية كافية من تعليق خلية لعدد اللوحات يكون المصنف.
- البذور الحد ني لوحات 14 × 96-جيدا مع خلايا لكل لوحة مكتبة siRNA دراستها.
- دوامة الزجاجة تعليق الخلايا بالتساوي وصب كمية كافية من تعليق خلية في خزان في العش شاكر المداري معالج السائل الآلي وتخزين الزجاجة التي تحتوي على تعليق خلية على 37 درجة مئوية الاحترار لوحة أثناء الطلاء الخلية عملية.
- استخدام معالج السائل الآلي لإضافة خلايا إلى لوحات في كثافة الخلايا 1000 في البئر (5000 خلايا/سم2) في 70 ميليلتر من المتوسطة كل من صفيحة 96-جيدا جيدا. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
- تشغيل شاكر المداري 100 لفة في الدقيقة باستمرار أثناء عملية البذر.
- مزيج تعليق خلية ثلاث مرات (140 ميليلتر ميكس وحدة التخزين) باستخدام معالج السائل الآلي.
- نضح ميليلتر 140 تعليق خلية والاستغناء عن 70 ميليلتر في كل بئر من لوحات ثقافة الخلية اثنين.
- كرر الخطوتين 2.5.3 و 2.5.4 إلى كل الألواح قد تم المصنف مع الخلايا.
- إعادة ملء الخزان تعليق خلية حسب الحاجة أثناء عملية البذر.
- بعد قد تم تبذر اللوحات، إزالتها من معالج السائل الآلي واحتضانها لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل نقلهم إلى حاضنة ثقافة خلية.
- تقييم كثافة الخلية لكل بئر لكل لوحة في صباح اليوم التالي باستخدام نظام تصوير الآلي الذي يقع في حاضنة ثقافة خلية واستبعاد أي ألواح من الدراسة التي الآبار الداخلية التي ليست بين 15 في المائة و 22 في المائة روافد.
3-ترانسفيكت الخلايا مع siRNA
- الحصول على لوحات مكتبة siRNA من البائع قبل تهيئتها لتحتوي على 80 أهداف siRNA للوحة الواحدة (انظر الشكل 4)، مع الأعمدة 1 و 12 ترك فارغاً.
- إعادة تشكيل لوحة مكتبة siRNA مع المخزن المؤقت siRNA بتركيز نهائي 2 pmol/ميليلتر لكل بئر siRNA وفقا لإرشادات الشركة المصنعة19.
- ترانسفيكت الخلايا ح 24 بعد البذر مع 4 pmol/بئر siRNA ومن تعداء كاشف 0.3 ميليلتر/جيدا. تنفيذ كافة الخطوات وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة كاشف تعداء (انظر الشكل 4 لتخطيط اللوحة)20.
- أداء جميع ترانسفيكشنز استخدام معالج سائل الآلي، واستخدام 25 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار التي سوف تكون ترانسفيكتيد فقط.
- استخدم الجزء العلوي نصف لوحة المكتبة ترانسفيكت مجموعة من ست لوحات تكرار يشار "أعلى لوحة تعيين" (ستة يتطابق كل siRNA, n = 6).
- استخدم الجزء السفلي من لوحة المكتبة ترانسفيكت لمجموعة مختلفة من ست لوحات تكرار نصف المشار إليها كما "أسفل لوحة تعيين" (ستة يتطابق كل siRNA, n = 6).
- استخدام مصطلح "تعيين لوحة كاملة" لوصف لوحات الخلية 12 أنه قد تم transfected مع siRNA مكتبة.
- ترانسفيكت الآبار B2-B6 من كل الألواح في "تعيين لوحة كاملة" مع siRNA تجمع سلبية بعد جميع مجموعات اللوحة العلوية والسفلية وقد تم transfected مع siRNA مكتبة.
- كما ترانسفيكت الآبار B2-B6 آخر لوحات اثنين، والتي لا تتلقى مكتبة siRNA وستكون بمثابة الضوابط غير مصورة (واحد لمجموعة اللوحة العلوية) وواحدة لمجموعة اللوحة السفلي، مع siRNA تجمع السلبية.
- احتضان كل ألواح الخلية في حاضنة ثقافة خلية لمدة 4 ساعات بعد أن تم إضافة جميع تعداء يمزج ومزيج من لطيف التنصت على كل ساعة.
- استخدام معالج سائل الآلي لغسل جميع الآبار اللوحات مرتين بحرارة قبل هكورت المتوسطة المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
- نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل ذلك إلى مستودع لنفايات.
- إضافة إلى كل جيدا 100 ميليلتر/بئر المعالجون مسبقاً هكورت المتوسطة المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني الذي يرد في خزان مختلفة في حجم كاف من عدد من اللوحات.
- كرر الخطوتين 3.5.1 و 3.5.2 لكل لوحة.
- إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
- إعادة ملء الخزان بالمتوسطة هكورت المخفف 1:5 في برنامج تلفزيوني حسب الحاجة.
- نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل أن خزان النفايات.
- ريفيد الآبار جميع اللوحات مع 100 ميليلتر/جيدا قبل حرارة هكورت المتوسطة، الذي يرد في خزان مختلفة في كمية كافية من المتوسطة لعدد اللوحات.
- إعادة ملء الخزان بالمتوسطة حسب الحاجة.
- استخدام الآبار C2-C6 جميع لوحات كعناصر تحكم غير ترانسفيكتيد.
- الاحتفاظ بابار B7-B11 و C11 C7 جميع لوحات غير ترانسفيكتيد لاستخدامها كعناصر تحكم المخدرات والمركبات للتعرض للسمية.
4-ريفيد الخلايا التالية يوم
- استخدم معالج سائل الآلي ريفيد الآبار جميع اللوحات. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
- نضح 100 ميليلتر من كل بئر وتجاهل ذلك إلى مستودع لنفايات.
- ريفيد كل جيدا مع 100 ميليلتر/جيدا قبل حرارة هكورت المتوسطة التي ترد في خزان مختلفة ولديها كمية كافية من المتوسطة لعدد اللوحات تكون ريفيد.
- كرر الخطوتين 4.1.1 و 4.1.2 حسب الحاجة إلى ريفيد كل خلية الألواح.
- إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
- إعادة ملء الخزان بالمتوسطة حسب الحاجة.
5-إضافة عنصر التحكم إيجابية
- يومين بعد تعداء وساعتين قبل التعرض، وتعد حلاً ميكرومتر 62.5 من كاردامونين التحكم الإيجابي في المتوسط هكورت وتستخدم للتعرض للصحة، وإضافة إلى صف ب خزان صف 8 إضعاف.
- للتعرض لحزب المحافظين، إعداد واستخدام حل SKF 86002 25 ميكرومتر.
- إعداد وحدة تحكم إيجابية كافية لعدد اللوحات لفحصها.
- تعد حلاً 0.625% من [دمس] في هكورت المتوسطة (التحكم بالسيارة) وإضافة إلى صف ج من الخزان نفسه.
- للتعرض لحزب المحافظين، إعداد واستخدام حل 0.5% من [دمس].
- تحضير وحدة التحكم المركبة كافية لعدد اللوحات لفحصها.
- استخدام معالج السائل الآلي إضافة عناصر إيجابية والمركبات إلى الآبار B7-B11 و C11 C7 لكل لوح الخلية واستخدام 50 ميليلتر/s بيبيتينج بسرعة لجميع الخطوات. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار التي ستقوم بتلقي عناصر إيجابية والمركبات فقط.
- إزالة 10 ميليلتر من المتوسطة من الآبار B7-B11 و C11 C7 لكل لوح الخلية وتخلص منه في صفوف زاي وحاء في خزان صف 8 إضعاف.
- نقل 10 ميليلتر من عناصر إيجابية والمركبات إلى تلك الآبار ومزيج 3 مرات.
- إرجاع هذه اللوحات خلية للحاضنة.
- كرر الخطوات 5.3 إلى 5.4 حتى تلقي كل خلية الألواح الإيجابية وعناصر التحكم المركبة.
6-HF التعرض للخلايا المستزرعة
تنبيه: هيئة الأكالة وسمية.
- أداء جميع عمليات التعرض للمواد الكيميائية في غطاء الأبخرة كيميائية ارتداء القفازات النتريل مزدوجة ومعطف مختبر وحماه الكم المتاح من البولي إيثيلين وسلامة النظارات.
- اكتساب الصحة كحل 48%.
- تضعف الصحة إلى 1% مع الماء عالي النقاوة وتخزينها في مختبرين مل 5 في 10 مل جدار سميك البولي إثيلين قنينات لتحسين السلامة.
- إزالة التلوث من نصائح ماصة والخزانات التي قد تتلامس مع الصحة وأي هيئة بقايا السائل مع غلوكونات الكالسيوم 2.5% قبل التخلص منها في تيار النفايات الخطرة.
- لكل لوحة مكتبة siRNA قيد التحقيق، وتعد حلاً متوسطة هيئة 0.0036% بإضافة ميليلتر 288 1% الصحة إلى 80 مل من قبل حرارة متوسطة هكورت في زجاجة 150 مل.
- دوامة الزجاجة واحتضان هيئة مخفف في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 10 دقائق.
- مزيج حل هيئة متوسطة مرة أخرى بدوامات الزجاجة وإضافة حل هيئة متوسطة إلى خزان كاشف على طبق أكثر دفئا.
- أداء التعرض مع فنيين اثنين يعملان بالترادف.
- الفني في ميليلتر aspirate الحق 100 من كل من الآبار الداخلية للوحة الخلية باستخدام بيبيتور قناة 12 وثم تمرير اللوحة للفني على اليسار.
- وقد فني على اليسار إضافة 100 ميليلتر كل جيدا لحل هيئة متوسطة.
- كرر الخطوتين 6.4.1 و 6.4.2 لكل ألواح الخلية التي عرضه لأنها سامة.
- كما كرر الخطوات 6.4.1 و 6.4.2 لوحات التحكم غير مصورة، استخدام الطازجة هكورت المتوسطة بدلاً من حل هيئة متوسطة.
- وضع اللوحات في الحاضنة غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 20 دقيقة وثم إعادتها إلى حاضنة الثقافة الخلية.
- كرر الخطوة إضافة مراقبة إيجابية (خطوات 5.1 إلى 5.5) كما سبق تبين متى تم كشفها كل الألواح وعاد إلى حاضنة الثقافة الخلية.
7-CP التعرض للخلايا المستزرعة
تنبيه: هو CP حادة السمية ومصدر إزعاج.
- أداء جميع عمليات التعرض للمواد الكيميائية في غطاء الأبخرة كيميائية ارتداء القفازات النتريل مزدوجة ومعطف مختبر وحماه الكم المتاح من البولي إيثيلين وسلامة النظارات.
- الحصول على CP.
- تمييع CP إلى 5% في [دمس] وتخزينها في مختبرين 10 مل في 10 مل التﻷلؤ قنينات لتحسين السلامة.
- إزالة التلوث من نصائح ماصة والخزانات التي قد تتلامس مع حزب المحافظين وحزب المحافظين السائلة أي بقايا مع بيكبريتيت الصوديوم 2.5% قبل التخلص منها في تيار النفايات الخطرة.
- إعداد كمية كافية من قبل حرارة متوسطة هكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا وبرنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً لعدد لوحات معرضة.
- لكل مجموعة تعيين لوحة أعلى أو أسفل لوحة، إضافة ميليلتر 8.04% 5 CP في [دمس] قاسمة 50 مل من قبل حرارة متوسطة هكورت ومزيج جيد لتركيز CP نهائي 0.0008%. كاب الأنبوب محكم واحتضان الحل في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية ح 1.
- وقت إضافة حزب المحافظين إلى مختبرين 50 مل من المتوسط حيث أن يتعرض كل "تعيين لوحة أعلى" و "أسفل لوحة مجموعة" يتلقى ح أنها سامة بالضبط 1 بعد CP أضيفت إلى قاسمة 50 مل من المتوسطة.
- إزالة "تعيين أعلى لوحة" ولوحة التحكم غير مصورة 1 من حاضنة الثقافة الخلية ووضعها في غطاء الأبخرة الكيميائية قرب نهاية فترة الحضانة.
- مزيج الحل CP بعكس الأنبوب وصب ثم إلى خزان كاشف في نهاية فترة الحضانة ح 1.
- أداء التعرض مع فنيين اثنين يعملان بالترادف.
- الفني في ميليلتر aspirate الحق 100 من كل من الآبار الداخلية للوحة الخلية باستخدام بيبيتور قناة 12 وثم تمرير اللوحة للفني على اليسار.
- وقد فني على اليسار إضافة 100 ميليلتر كل من الحل المتوسط CP جيدا.
- كرر الخطوتين 7.6.1 و 7.6.2 لكل ألواح الخلية "تعيين لوحة أعلى" للتعرض لأنها سامة.
- كما كرر الخطوات 7.6.1 و 7.6.2 لوحات التحكم غير مصورة، استخدام الطازجة هكورت المتوسطة بدلاً من الحل المتوسط CP.
- وضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية في غطاء الأبخرة الكيميائية لمدة 10 دقائق.
- أضف كمية كافية من المتوسطة برنامج تلفزيوني وهكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا للخزانات كاشف قرب نهاية فترة الحضانة 10 دقيقة.
- إزالة الحل CP من ألواح الخلية باستخدام بيبيتور 12 قناة واستبدله 100 ميليلتر كل من برنامج تلفزيوني جيدا في نهاية فترة الحضانة 10 دقيقة.
- إزالة برنامج تلفزيوني من ألواح الخلية فورا واستبدالها ب 100 ميليلتر كل بئر المتوسطة هكورت الذي يحتوي على 1 × القلم/بكتيريا.
- كما كرر الخطوتين 7.9 و 7.10 لوحات التحكم غير مصورة.
- العودة لوحات الخلية إلى حاضنة ثقافة خلية قياسية.
- كرر الخطوات من 7.3 إلى 7.12 "تعيين لوحة أسفل".
- كرر الخطوة إضافة مراقبة إيجابية (خطوات 5.1 إلى 5.5) كما تم وصفه سابقا عندما تم كشف كل الألواح وعاد إلى حاضنة الثقافة الخلية.
8-عينة من جمع وتحليل جدوى خلية
- أربع وعشرين ساعة بعد التعرض، وتعد حلاً الركازة MTT 0.5 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني يتضمن 10 غرام/لتر جلوكوز والحارة إلى 37 درجة مئوية21. إعداد 10 مل الركيزة لكل لوحة تكون جزيئي.
- لعدد اللوحات تكون جزيئي، إضافة كمية كافية من MTT الركازة الحل إلى خزان في معالج سائل الآلي.
- استخدام معالج السائل الآلي جمع العينات وإضافة الركازة MTT استخدام 50 ميليلتر/s بيبيتينج بسرعة لجميع الخطوات. تكوين مربعات نصيحة لمعالجة فقط تلك الآبار تكون جزيئي.
- أسبيراتي 95 ميليلتر من المتوسطة من الآبار الداخلية 60 لوحة الخلية، وإيداع 42.5 ميليلتر في كل من ألواح التخزين 384-جيدا اثنين.
- فورا إضافة 100 ميليلتر كل من الحل الركيزة MTT جيدا إلى لوحات الخلية، واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة ل 1.5 ح.
- إعادة ملء الخزان بمحلول الركازة MTT حسب الحاجة.
- احتضان لوحات الخلية عند 37 درجة مئوية في خلية ثقافة حاضنة ح 1.
- ختم ألواح التخزين 384-جيدا وتخزينها في-80 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
- كرر الخطوات من 8.3 إلى 8.5 لكافة مجموعات اللوحة العلوية والسفلية والضوابط غير مصورة المرتبطة بها.
- إعادة استخدام تلميحات بين replicates إذا رغبت، ولكن غسلها عند إضافة الحل الركيزة MTT وعند التبديل بين لوحة مجموعات.
- بعد الاحتضان ح 1، إضافة كمية كافية من [دمس] إلى خزان في معالج سائل الآلي.
- استخدام معالج السائل الآلي إضافة [دمس]، واستخدام بيبيتينج ميليلتر/s 50 سرعة لجميع الخطوات.
- نضح 100 ميليلتر من كل من الآبار الداخلية من ألواح الخلية وتجاهل الحل الركيزة MTT في مستودع لنفايات.
- إفراغ خزان النفايات حسب الحاجة.
- تراكب كل بئر مع 100 ميليلتر [دمس].
- إعادة ملء الخزان [دمس] حسب الحاجة.
- نضح 100 ميليلتر من كل من الآبار الداخلية من ألواح الخلية وتجاهل الحل الركيزة MTT في مستودع لنفايات.
- اهتز اللوحات على شاكر طبق لمدة 3 دقائق.
- قياس امتصاص في 570 و 690 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة.
- طرح الخلفية وحساب % بقاء الخلية بقسمة قيم امتصاص تتعرض الضوابط غير مصورة. استخدام عنصر تحكم siRNA متوسط تجمع السلبية لم يتعرضوا لحساب % خلية السلامة لكافة الأهداف.
9-قياس إيل-8 التركيز في Supernatants ثقافة الخلية
- قياس تركيز إيل-8 في supernatants ثقافة الخلية باستخدام لا تغسل مقايسة على أساس حبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة22. إنشاء تخطيط لوحة بمقايسة لاستيعاب العينات والمنحنى المعياري.
- إزالة ألواح التخزين 384-جيدا من الثلاجة-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة، وإيجاز الطرد المركزي لوحات لجمع العينة في الجزء السفلي من الآبار.
- لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها، جعل حجم كاف من يقبلون المضادة-إيل-8 حبات والأجسام المضادة-إيل-8 بيوتينيلاتيد في مقايسة العازلة في الطقم. استخدام نسبة 50 ميليلتر لمكافحة IL8 يقبلون الخرز و 50 ميليلتر من جسم IL8 مكافحة بيوتينيلاتيد لمل 9.9 من المخزن المؤقت للمقايسة.
- استخدام بيبيتور متعددة القنوات، إضافة الخليط حبة/جسم لوح أسود 384-جيدا تخزين.
- إضافة يقبلون حبة/جسم للآبار المخصصة للاستخدام للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
- إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
- استخدام بيبيتور متعددة القنوات، إضافة الخليط حبة/جسم لوح أسود 384-جيدا تخزين.
- إعادة تشكيل إيل-8 المعيار 1000 بيكوغرام/مل تستخدم المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على 354 ميكرومتر كلوريد الصوديوم. جعل حجم كاف لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
- جعل ثمانية تخفيف التسلسلية ذات شقين للمنحنى المعياري.
- إضافة المنحنى المعياري في ثلاث نسخ إلى آبار لوحة سوداء 384-جيدا تخزين وفقا لتخطيط لوحة الفحص المناسبة. إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
- وبالمثل، أضف المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على 354 ميكرومتر كلوريد الصوديوم مع لا إيل-8 لقياس الخلفية.
- استخدام معالج سائل الآلي للقيام التحليل. استخدام مربعات نصيحة قبل تكوين لمعالجة الآبار تسميهم تخطيط لوحة الفحص فقط. استخدام 50 ميليلتر/s سرعة بيبيتينج لجميع الخطوات.
- نقل 8 ميليلتر من خليط جسم حبة يقبلون إلى آبار لوحات الفحص جيدا 384-بئر ضحلة بيضاء.
- إضافة إلى الآبار المعينة للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص فقط.
- نقل 2 ميليلتر من المنحنى المعياري لآبار لوحات الضحلة المقايسة جيدا وفقا لتخطيط لوحة الفحص المناسبة.
- إعداد حل م 3.54 كلوريد الصوديوم وإضافة وحدة تخزين كافية لعدد اللوحات تكون جزيئي لخزان ضحلة في معالج السائل الآلي.
- ضبط تركيز الملح من العينات ليتطابق مع منحنى قياسي بنقل 4.5 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم إلى النماذج في لوحات سوداء 384-جيدا تخزين.
- خلط العينات باستخدام ثلاث مرات حجم خلط 30 ميليلتر، ونقل 2 ميليلتر من العينات إلى الأبيض الضحلة الاعتداء أيضا لوحات وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
- تغيير نصائح ما بين لوحات عينة.
- احتضانها ح 1 في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها، جعل حجم كاف من حبات يقبلون في المخزن المؤقت للمقايسة. استخدام نسبة 200 ميليلتر من حبات يقبلون الثانوية لمل 12.3 من المخزن المؤقت للمقايسة.
- استخدام بيبيتور متعددة القنوات، إضافة الخرز الثانوية إلى لوحة سوداء 384-جيدا تخزين.
- إضافة الخرز الثانوية للآبار المخصصة للاستخدام للعينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط اللوحة المقايسة.
- إضافة وحدة تخزين كافية الواحدة وكذلك لعدد لوحات الفحص ليتم تشغيلها.
- باستخدام معالج السائل الآلي، نقل 10 ميليلتر من الخرز الثانوية لآبار لوحات بيضاء المقايسة جيدا 384-بئر ضحلة.
- إضافة إلى الآبار التي تلقي عينات والمنحنى القياسي وفقا لتخطيط لوحة الفحص فقط وتغسل النصائح بين كل لوحة.
- احتضان لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- نقل 8 ميليلتر من خليط جسم حبة يقبلون إلى آبار لوحات الفحص جيدا 384-بئر ضحلة بيضاء.
- ختم المقايسة لوحات مع مسح لوحة الأختام والمسح الضوئي باستخدام قارئ لوحة متوافقة مع المقايسة. استخدم مسافة 0.2 مم بين لوحة وكاشف ووقت الإثارة 180 مرض التصلب العصبي المتعدد 550 ms قياس الوقت للمسح الضوئي.
- استيراد البيانات الخام من فحوصات إيل-8 في جدول بيانات.
- استخدام منحنى الآلي المناسب للمنحنى المعياري لفحوصات إيل-8، ومن ثم تحويل البيانات الخام إلى بيكوغرام/مل لكل عينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تطوير أسلوب التعرض
المكررة، وتقييم مدى ملاءمة خط الخلايا الظهارية القرنية البشرية هسيك SV40 لاستخدامها في الدراسات HTS. تم تخليد استخدام مستضد تي كبيرة SV-40 هسيك SV40 وكانت هدية من دهاناجاي بال23. لذلك، فقط بعض عينات من النتائج التي توصل إليها ونعتقد قد تكون واجبة التطبيق على نطاق أوسع ترد سميات متعددة إلى، وهناك عدد كبير جداً من المتغيرات استكشافها في التعرض لوضع منهجية لتقديم إيجاز هنا.
التعرض السمية سبايك أو الصرف المتوسطة
في البداية سعينا لكشف الخلايا عن طريق التشويك ميليلتر 5 من تركيز العمل لأنها سامة تضعف في المياه المالحة أو المتوسطة في ميليلتر 95 المتوسطة موجودة بالفعل في كل من الخلايا جيدا في صفيحة 96-جيدا لتحقيق تركيز التعرض النهائي المنشود. SV40-هسيك تعرضوا في استخدام هذه المصطلحات فضح/ريفيد المنهجية إلى 1 X LD50 من الصحة لح 24 (1 دينار X50 = 0.02% الصحة بهذا الأسلوب عندما كان المخفف سبايك الصحة في المتوسط)، وكانت ريفيد الآبار مع جديدة متوسطة 10 دقيقة في وقت لاحق. بعد 24 ساعة، كانوا مضافين الخلايا مع الركازة MTT كما هو موضح أعلاه لفحص صلاحية الخلية. تم القبض على الصور فوتوميكروسكوبي قبل سولوبيليزيشن بلورات formazan مع [دمس]. وأظهر فحص دقيق لآبار أن كان مترجم بدرجة كبيرة من موت الخلايا في بقعة واحدة، وذلك على الرغم من حقيقة أن اهتزت اللوحة لمدة 15 ق فورا بعد الارتفاع تمت إضافته إلى لوحة كاملة (الشكل 1a). لوحظت هذه الظاهرة عندما تمت إضافة المصطلحات الخاصة للأسفل لإضافة جيدا أو عندما في غضروف. صورة تكبير أعلى من هذه المنطقة باستخدام مرحلة التباين يظهر أن الخلايا لا تزال موجودة في منطقة أونستينيد ب MTT (الشكل 1b). اختبرنا أيضا بتبادل متوسطة فضح/ريفيد المنهجية حيث تمت إزالة المتوسطة من الآبار، يستعاض عن المتوسطة ثقافة الخلية التي تحتوي على 1 دينار X50 من هيئة (1 دينار X50 = 0.035% الصحة بهذه الطريقة) وكانت ريفيد الآبار مع جديدة متوسطة 10 دقيقة في وقت لاحق. بعد 24 ساعة، كانوا مضافين الخلايا مع الركازة MTT كما هو موضح أعلاه. يتحقق هذا الأسلوب على ما يبدو أكثر حتى خلية موت استجابة الخلايا داخل كل بئر (الشكل 1 ج و د 1). ضوابط لم يتعرضوا للرجوع إليها وإظهار لا مناطق محددة من موت الخلية (الشكل 1e و 1f). للتعرض لحزب المحافظين، لم يؤد إلى الأسلوب سبايك بدرجة كبيرة من موت الخلايا المترجمة إلى بقعة واحدة داخل كل بئر؛ ومع ذلك، كان رد موت الخلية أكثر اتساقا من تكرار واحد إلى التالي باستخدام الأسلوب التعرض الصرف المتوسطة (البيانات لا تظهر).
الشكل 1 : خلية الموت الناجم عن تصاعد وطرق التعرض الصرف المتوسطة- كانت جميع الصور الملتقطة 1.5 ح بعد إضافة الركازة MTT. الفريق (أ) صورة مشرقة ميدان SV40-هسيك يتعرضون للصحة سبايك فضح/ريفيد المنهجية. لوحة (ب) تكبير أعلى البئر نفسها في الفريق (أ) باستخدام التباين المرحلة. لوحة (ج) صورة مشرقة ميدان SV40-هسيك كشفها بواسطة تبادل المتوسطة فضح/ريفيد المنهجية. لوحة (د) تكبير أعلى البئر نفسها في الفريق (ج) استخدام التباين المرحلة. لوحات (ه) و (و) من الميدان لم يتعرضوا جيدا، ومشرق ومرحلة تباين أعلى التكبير، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الاستقرار السمية في المتوسط
لوحظ أن مجرد مخفف في المتوسط، سيتوتوكسيسيتي الظاهر من التردد و CP التغييرات وثم تستقر. هيئة مخففة في المتوسط % 0.0036 والسماح باحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-60 دقيقة قبل تعريض SV40-هسيكس كما هو موضح أعلاه. للصحة، يزيد سيتوتوكسيسيتي ضمن أول 5 دقائق أن الصحة هي تضعف في المتوسط وهو ثم مستقرة على الأقل ساعة (الشكل 2a). وكانت إحدى الطرق ANOVA تليها دونيت "التجارب المقارنة متعددة" أظهرت أن بقاء الخلية % على جميع النقاط الزمنية تختلف اختلافاً كبيرا من حيث الوقت دقيقة 1. كانت هناك لا اختلافات كبيرة بين 2.5 إلى 60 دقيقة من النقاط الزمنية. CP العضوية وهي تضعف أولاً إلى 5% في [دمس]. ثم تضعف في المتوسط إلى 0.0008% وسمح لاحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-120 دقيقة قبل تعريض SV40-هسيكس كما هو موضح أعلاه. متى تضعف في المتوسط، سيتوتوكسيسيتي من حزب المحافظين يقلل أكثر من 60 دقيقة وثم تستقر على الأقل ح القادم (الشكل 2). وكانت إحدى الطرق ANOVA تليها دونيت "التجارب المقارنة متعددة" أظهرت أن بقاء الخلية % على جميع النقاط الزمنية تختلف اختلافاً كبيرا من حيث الوقت دقيقة 5. كانت هناك لا اختلافات كبيرة بين 60 إلى 120 دقيقة من النقاط الزمنية.
الشكل 2 : فقدان سيتوتوكسيسيتي في تخفيف متوسطة السمية. البيانات يتم التعبير عنها كمتوسط بقاء نسبة ± SD (n = 6). تظهر لوحة (أ) استقرار سيتوتوكسيسيتي الصحة 0.0036% عندما تضعف في المتوسط والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-60 دقيقة قبل تعريض SV40-هسيكس كما هو موضح أعلاه. تظهر لوحة (ب) استقرار سيتوتوكسيسيتي CP 0.0008% عندما تضعف في المتوسط، ويسمح لاحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 5-120 دقيقة قبل تعريض SV40-هسيكس كما هو موضح أعلاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ريفيد/فضح أو كشف فقط
كان هناك عامل آخر في التعرض لمنهجية التحقيق ما إذا كانت: A) إضافة أنها سامة ريفيد، 10 دقيقة، يغسل، إزالة لوحات من هود الأبخرة الكيماوية، واحتضان ح 24 في حاضنة ثقافة خلية قياسية (أسلوب فضح/ريفيد)؛ أو ب) إضافة أنها سامة وترك الأمر على وإزالة اللوحات من هود الأبخرة الكيميائية واحتضان ح 24 في حاضنة ثقافة خلية قياسية (فضح الأسلوب فقط). سلامة عامل هام حيث أنه قد لا يجوز لإزالة ألواح الخلايا التي تحتوي على أنها سامة المخفف من هود الأبخرة الكيميائية نظراً لأنها سامة سوف الغازات المنبعثة ويعرض أفراد. هو النظر في ما يتصل عدد لوحات معرضة في وقت معين منذ لوحات أكثر هناك، ويكون هناك أكبر حجم قبالة-الغاز. في أساليب عملنا HTS، نكشف لوحات 48 × 96-جيدا في يوم دراسي معين. نحن وضع لوحات ثقافة الخلية المكشوفة في حقيبة مختومة وثم استخدام أنابيب الغاز اللونية للكشف عن تقييم CP والتردد قبالة-الغاز من لوحات المكشوفة. ووجدنا أن يعرض لوحات 48 إلى 1 × LD50 من الصحة لم تسفر عن أي يمكن كشفها HF قبالة-الغاز (البيانات لا تظهر). CP التعرض، لوجدنا أن هناك ما يكفي CP قبالة-الغاز من لوحات 48 يتعرض إلى 1 × LD50 أن يقدم على الأقل بعض القلق السلامة (البيانات لا تظهر). ريفيد/كشف وفضح تم تقييم أساليب فقط للتعرض للصحة. الخلايا هسيك SV40 تعرضوا للصحة وتم تقييم صلاحية بفحص MTT ح 24 بعد التعرض. وأجريت الجرعة استجابة التكرار في أيام مختلفة. مقارنة بالأسلوب الذي فضح/ريفيد (الشكل 3 ألف)، وجدنا أن الأسلوب الوحيد فضح نتائج أكثر اتساقا خلية بقاء المقايسة (الشكل 3b). ولذلك، تم اختيار هذا الأسلوب كجزء من منهجية التعرض النهائي. لحزب المحافظين، أي اختلافات في اتساق خلية صلاحية نتائج المقايسة بين المنهجيتين التعرض مختلفة يمكن لا يمكن تقييمها نظراً لمخاوف تتعلق بالسلامة يمنع إزالة لوحات CP مكشوف من هود الأبخرة الكيميائية لحضانة 24 ساعة في خلية قياسية حاضنة الثقافة.
الشكل 3 : الاتساق التعرض بفضح/ريفيد وفضح أساليب فقط. البيانات يتم التعبير عنها كمتوسط بقاء نسبة ± SD (n = 6). (أ) هيئة مخففة في المتوسط، المحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وثم المستخدمة للكشف عن الخلايا بطريقة فضح/ريفيد. (ب) هيئة مخففة في المتوسط، المحتضنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وتستخدم بعد ذلك لفضح هسيك SV40 بفضح الأسلوب الوحيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
صقل نموذج الخلية
مكونات متوسطة
أننا نلتزم بشروط الثقافة يحددها المحققون الأصلي للمرور وصيانة هذه الخطوط الخلية؛ ومع ذلك، قمنا بتعديل لهم للخلايا في التجريب. مستنبت الخلية يحددها المحققون الأصلي للخلايا هسيك SV40 تتضمن الهيدروكورتيزون، ولكن نحن المستخدمة على مستوى منخفض من الهيدروكورتيزون (0.5 ميكروغرام/مل) خلال دراسات التعرض لقمع سبايك عرضية في إنتاج سيتوكين ينظر في السذاجة SV40-هسيك (البيانات لا تظهر) التي تأثيراً سلبيا على تحليل البيانات من تكرار واحد إلى التالي أثناء دراسات الصقل.
الاستقرار المظهرية
خلال دراساتنا صقل نموذج الخلية، وجدنا أن SV40-هسيك البدء قد انخفض إنتاج سيتوكين استجابة للتعرض للسمية ابتداء حول الممر رقم 60 (البيانات لا تظهر). لهذا السبب، نحن الحفاظ على كريوستوكس خلايا المرور منخفضة، وإعدام جميع الدراسات باستخدام الخلايا تحت رقم مرور 60، ورصد إنتاج سيتوكين أثناء عملية الفرز.
تخطيط لوحة
مصدر هام لتقلب التجريبية في دراسات الإنتاجية العالية تأثيرات الحافة من لوحات متعددة جيدا. وجدنا أن الردود سيتوكين الخلايا في الآبار حافة لا تتفق مع، أو تعادل، الآبار الداخلية في كل هيئة وحزب المحافظين الدراسات (البيانات لا تظهر). لم يحسم البولندية الوسيط للبيانات، وعملية إحصائية تستخدم للتقليل من آثار حافة على مجموعة من البيانات، بما فيه الكفاية المسألة (البيانات لا تظهر). ولذلك، استخدمت لا الآبار حافة لوحة الخلية للتجريب أو عناصر التحكم (الشكل 4).
الشكل 4 : مكتبة تخطيطات لوحة الخلية. وتمثل المناطق المظللة الرمادية في "تخطيط لوحة مكتبة" الآبار التي تحتوي على siRNA. آبار بيضاء فارغة. 40 هدفا من الصفوف أ-د من "لوحة مكتبة" تستخدم في "أعلى لوحة تعيين"، وتستخدم 40 هدفا من صفوف ه-H من "لوحة المكتبة" في "أسفل لوحة تعيين". تستخدم آبار B2-B6 تجمع السلبية siRNA عناصر التحكم. الآبار C2-C6 غير ترانسفيكتيد. تستخدم آبار B7-B11 كاردامونين أو SKF 86002 إيجابية مكافحة المخدرات كما هو موضح، والآبار C7 C11 تستخدم لمراقبة المركبات [دمس]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
في التحقق من صحة النموذج المختبر ل HTS
كنا Z ' عامل التحليل لتحديد مدى ملاءمة هسيك SV40 لاستخدامها في الدراسات HTS كما يستخدم هذا الاختبار الإحصائي لتحديد نوعية التحليل ل HTS24. لض التردد ' عامل التحليل، كانت تبذر الخلايا في 1.25 x الخلايا3 10/حسنا، transfected مع siRNA تجمع سلبية (كما هو موضح أعلاه) 24 ساعة بعد البذر، ويتعرض ح 48 بعد تعداء % 0.0036 الصحة (1 × LD50)، n = 3. لض CP ' عامل التحليل، خلايا كانت تبذر وترانسفيكتيد كما هو موضح أعلاه، ويتعرض ح 48 بعد تعداء 0.0008% CP (1 × LD50)، n = 5. ن أكبر استخدمت في دراسات CP نظراً لتباين أكبر في هذا النموذج التعرض. Z ' تم حساب معامل لايل-8 التعبير البيانات من الخلايا غير مصورة مقابل مكشوف وتجمع السلبية siRNA transfected وبالاوفست مقابل كشف خلايا للتعرض CP والصحة. ونحن أيضا تحليل غير transfected الخلايا لتحديد ما إذا كان هناك تأثير على نوعية التحليل بسبب تعداء siRNA. العديد من التكرارات للتحقق من صحة الدراسات التي أجريت أثناء تكرير ظروف التعرض والثقافة في محاولة لتحقيق أقصى قدر من Z ' عامل النتائج. SV40-هسيك تمرير التحقق من الصحة، وكان معظم التكرارات Z ' عامل القيم أكبر من 0.50 للتعرض ذات التردد العالي (الجدول 1) والتعرض CP (الجدول 2). وكان كل تكرار في هذه الجداول من الخلايا مطلي في أيام مختلفة.
| تعرض المجموعات | Z '-عامل التحليل | ||
| النائب #1 | النائب #2 | النائب #3 | |
| يتعرض التردد مراقبة سلبية مقابل السيطرة السلبية لم يتعرضوا | 0.68 | 0.5 | 0.56 |
| يتعرض التردد مقابل ساذجة | 0.4 | 0.68 | 0.56 |
الجدول 1: SV40-هسيك هيئة التعرض Z ' عامل تحليل إيل-8
| تعرض المجموعات | Z '-عامل التحليل | ||
| النائب #1 | النائب #2 | النائب #3 | |
| يتعرض CP المراقبة السلبية مقابل السيطرة السلبية لم يتعرضوا | 0.6 | 0.18 | 0.46 |
| تعرض حزب المحافظين مقابل ساذجة | 0.42 | 0.29 | 0.42 |
الجدول 2: SV40-هسيك CP التعرض Z ' عامل تحليل إيل-8
SiRNA الابتدائية "فرز النتائج من الصحة إصابة الخلايا"
تعداء الأمثل دراسات أجريت قبل الفحص، وتم استخدام siRNA استهداف ب سيكلوفيلين لهذه الدراسات. استخدمت مقايسة كشف في الموقع الحمض النووي الريبي لقياس مستويات مرناً ب سيكلوفيلين، وهو محلل محتوى عالية استخدمت لقياس النتائج. نحن حققت ما يقرب من 90% ضربة قاضية ب سيكلوفيلين وعادة لا يزيد عن 5-10 ٪ فقدان الخلية مع pmol 4 siRNA/حسنا وكاشف تعداء ميليلتر/بئر 0.3 (البيانات لا تظهر). وأسفرت كميات أعلى من siRNA فعلا ضربة قاضية ب سيكلوفيلين فقراً (البيانات لا تظهر). تم تحقيق مستويات مماثلة من ضربة قاضية من siRNA وكاشف تعداء ميليلتر/آبار 0.09 1.2 pmol/جيدا، ولكن أننا انتخبنا لاستخدام بمول 4 لكل بئر بغية التصدي لأية أهداف يمكن أن تتطلب كميات أكبر من siRNA لتحقيق فعالية ضربة قاضية. كما تم تقييم حركية الهدف ضربة قاضية، ولوحظ أن الهدف ضربة قاضية القصوى قبل يومين بعد انتهاء تعداء (البيانات لا تظهر). وكان اتساق الهدف ضربة قاضية عبر اللوحة أيضا المصادق عليه (البيانات لا تظهر). كاردامونين العقاقير المضادة للالتهابات و SKF 86002 وتستخدم كعناصر إيجابية لتثبيط إنتاج سيتوكين للتعرض لهيئة وحزب المحافظين، على التوالي. واختيرت هذه عن طريق اختبار مجموعة متنوعة من المركبات ذات الخصائص المضادة للالتهابات المعروفة في الخلايا المعرضة. الجرعة المستخدمة في فحص دراسات اختير من قبل دراسات الجرعة الرد الأمثل.
SiRNA إنتاجية عالية فحص الاستراتيجية يمكننا الاستفادة من معايير الصناعة وينطوي على ثلاث خطوات رئيسية: فحص 1) الابتدائي، deconvolution 2) مكتبة، والهدف 3) التحقق من صحة. في الفرز الأولية، يتم تقييم النمط الظاهري لكل هدف استخدام خليط تسلسلات siRNA مختلفة ككاشف واحدة لاستهداف كل الجينات. ثم يتم الأهداف المحددة لأسفل إلى مكتبة deconvolution. في هذه الخطوة، كل من تسلسل مختلف siRNA مجمعة لاستهداف كل الجينات في الفرز الأولية يتم اختبارها بشكل منفصل. أهداف يخضع تحديد أسفل آخر في التحقق من صحة الهدف الذي أكد هو النمط الظاهري المستهدفة مع المخدرات واستعادة النمط الظاهري، و/أو siRNA من بائع آخر. على الشاشة الأولى، انتخبنا لأداء شاشة فرعية الجينوم مركزة بدلاً من شاشة عريضة جينوم لأسباب تتعلق بالاقتصاد. البيانات ميكرواري من التردد و CP أصيب القرنيات الماوس وتحليل مسار الإبداع (IPA) واستخدمت للتركيز مكتبتنا المستهدفة للشاشة الرئيسية (المخطوطات في إعداد). بإيجاز، تعرضت لبخار السمية باستخدام بخار كأس مماثلة للأساليب المذكورة سابقا25القرنيات الماوس. كانت تحصد القرنية تعرض الأزرار وعناصر التحكم في وقت مختلف النقاط بعد التعرض. الجيش الملكي النيبالي معزولة، ورصد نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي. أجريت جميع التجارب التي ميكرواري وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة26. تطبيع كثافات إشارة الخام وتحليلها بواسطة تحليل العنصر الرئيسي (PCA) لتحديد مصادر هامة للتغير في البيانات. وكانت الجينات مرتبة وأمرت بدلالة إحصائية. كانت مزروعة بالألغام البيانات ومقارنة بقوائم الجينات من المكتبات التي تم تكوينها مسبقاً siRNA. من هذه القوائم الجينات، اخترنا 3120 أهدافا للفحص. وكان فحص المكتبة siRNA في هسيك SV40 الخلايا (انظر الشكل 5 مخطط تدفق بروتوكول HTS للشاشة الرئيسية). شملت تقييمات نقطة النهاية إيل-8 مستويات في مستنبت الخلية بمقايسة على أساس حبة لا غسل وبقاء الخلية بفحص MTT. تعرض الخلايا ل 0.0036%HFA، كما سبق ذكره، وهو ما يقرب من 1 × LD50. وقيمت بقاء الخلية بفحص MTT ح 24 بعد التعرض. وقد تم تحليل أثر كل تجمع siRNA على بقاء الخلية لدلالة إحصائية مقارنة بالمتوسط يتعرض تجمع السلبية بالنسبة لكل لوح باستخدام دقة موحدة الموزون (صمد)27. مؤامرة مزدوجة-مصباح صلاحية صمد وخلية إضعاف-تغير يظهر في الشكل 6. عتبات التحديد ضرب المختار للأهداف التي أدت إلى تفاقم موت الخلية أو تحسين بقاء الخلية قد صمد ≤-1.28 وصمد ≥ 1.28، على التوالي.
الشكل 5 : الابتدائي الشاشة HTS بروتوكول مخطط التدفق. هذا الرسم البياني يوضح الخطوات الأساسية التي يتم تنفيذها في كل يوم لبروتوكول HTS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : قطعة المصباح المزدوج siRNA تأثير على "خلايا" SV40-هسيك Cell Viability of HFA-Exposed- النتائج تظهر لكل هدف بمتوسط ستة replicates (n = 6). خلية صلاحية البيانات يتم التعبير عنها كحظيرة--تغيير بالنسبة إلى siRNA مراقبة تجمع السلبية المكشوفة، ودلالة إحصائية تم تحليلها بواسطة سمد. واختيرت الأهداف التي كان صمد ≤-1.28 أو ≥ 1.28 كمرات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وقد تم تحليل أثر كل تجمع siRNA على إنتاج إيل-8 المستحثة بالصحة لدلالة إحصائية مقارنة بالمتوسط يتعرض تجمع السلبية بالنسبة لكل لوحة. وكان إيل-8 في خلية ثقافة طافية المقايسة المقدرة 24 ساعة بعد التعرض. مؤامرة مزدوجة-مصباح صمد وايل-8 إضعاف-تغير يظهر في الشكل 7. عتبات الانتقاء ضرب المختار للأهداف التي انخفض إنتاج إيل-8 كانت انخفاض 40% وصمد ≤-1، 0. عتبات الانتقاء ضرب المختار للأهداف أن زيادة إنتاج إيل-8 كانت بزيادة خمسة إضعاف وصمد > 1.28.
الشكل 7 : الأرض المزدوج-مصباح siRNA أثر على "إنتاج" إيل-8 خلايا SV40-هسيك هفايكسبوسيد- أظهرت النتائج بمتوسط ستة replicates (n = 6). يتم التعبير عن البيانات على مستوى التعبير إيل-8 كحظيرة--تغيير بالنسبة إلى siRNA تجمع السلبية المكشوفة، ودلالة إحصائية تم تحليلها بواسطة صمد. عدد الزيارات حددت الأهداف التي كان 40 في المائة انخفاض في مستويات إيل-8 وصمد ≤-1، 0، أو بزيادة خمسة إضعاف في إيل-8 مستويات وصمد > 1.28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يصف لنا لدينا الأساليب والنتائج في تطوير إنتاجية عالية القرنية الظهارية خلية فحص نموذج لدراسة الإصابات التردد وحزب المحافظين. ونقدم أيضا النتائج من الشاشة siRNA الأولية لإصابة التردد. وهناك العديد من التحديات لتطوير نماذج HTS لدراسة إصابات التشنج. الأساليب التي يمكن أن نجد في الأدبيات ذات الصلة بالدراسة من التردد، أو الصحة، أو حزب المحافظين في نماذج الثقافة الخلية عن القليل من المساعدة. معظم الدراسات في المختبر على أيون الفلوريد تنطوي على خلايا الفم ويستخدم فلوريد الصوديوم وعدم التردد أو الصحة (بالنسبة لبعض الأمثلة، انظر،من2829). نشرت بعض منهجية في التعرض في المختبر للخلايا الظهارية الشعب الهوائية لحزب المحافظين بيسونين et al. 30-وفي نهاية المطاف، وجدنا أية أساليب محددة في الأدبيات ذات الصلة بالدراسة HTS التردد، أو الصحة، أو حزب المحافظين، والغالبية العظمى من التحديات والمتغيرات المتصلة بدراسة هذه سميات في التنمية HTS المطلوبة. تم إيلاء اهتمام خاص لتحقيق درجة عالية من الاتساق التعرض عبر الزمن ولوحات الفحص العديدة اللازمة لدراسة HTS ناجحة.
نوع واحد من التحدي الذي واجه تتصل بتطبيق أنها سامة للخلية ثقافة النظم. قد تكون بعض سميات المتفاعلة مع أو غير مستقرة في المحاليل. لا تعتبر سميات اخترنا لدراسة هذه القضايا عدم الاستقرار. دراسة زراعية تحقق فوتوهيدروليسيس من حزب المحافظين أظهر أن حل م 0.001 من حزب المحافظين في الماء نصف عمر ح 31.1 عندما تتعرض إلى مصدر ضوء زينون لوكس 1100 (شدة أشعة الشمس في يوم غائم) لمدة 10 أيام، 12 ح كل يوم31. وكان هناك لا التحلل المائي للقياس خلال نفس الفترة يوم 10 عندما كان الحل المخزنة في الظلام. أيون بروتون والفلوريد للصحة وضوح مستقرة في المياه. ومع ذلك، هناك اعتبارات الاستقرار إضافية فيما يتعلق بتخفيف السمية في مستنبت الخلية. وجدنا أن هناك تغيير أولى من سيتوتوكسيسيتي إلى حد ما عندما كانت مخففة سميات أولاً في مستنبت الخلية التي تستقر ثم بعد فترة قصيرة من الزمن. ونحن نعتقد أن هذا سبب ملزم السمية أو إلى مع المكونات في الأجل المتوسط. المتوسطة خلية تحتوي على الكالسيوم، المغنيسيوم، البروتين، إلخ ، والتي من المعروف أن تتفاعل مع ال32،أيون الفلوريد33. CP من المعروف أن لديها ردود فعل الأكسدة مع ثيولس البيولوجية، ولكن يمكن أيضا ربط الحمض النووي والبروتينات وغيرها34،نوكليوفيليس35. بمجرد الانتهاء من هذه التفاعلات والتفاعلات أو التوصل إلى التوازن، استقرت كمية السمية المتاحة وهكذا تستقر سيتوتوكسيسيتي الظاهر. وبحثنا في البداية استخدام تخفيف المياه المالحة والمياه من سميات للأرصدة العاملة المستخدمة للتعرض لتجنب التفاعلات السمية مع مكونات المتوسطة لتخفيف العمل. استخدام المياه المالحة أيضا يحفظ حمض عنصر الضرر هيئة للتعرض التي يؤديها الصرف المتوسطة. وجدنا أن كانت الردود موت الخلية إلى سميات في المياه وتخفيف المالحة أكثر تقلباً من الأسلوب الذي يستخدم تخفيف مستنبت الخلية مع تبادل المتوسطة (البيانات لا تظهر). فيما يتعلق بأسلوب التعرض سبايك مع الصحة، قد يكون التغير بسبب عدم الاتساق في المصطلحات تفريق في جيدا مما يؤدي إلى الأهداف الخلوية تتنافس مع مكونات متوسطة لايون الفلوريد المتاحة. أسباب التغير في هيئة التعرض بالصرف المتوسطة مع تخفيف المالحة هيئة غير واضحة تماما. على أي حال، التخلي عن طرق التعرض باستخدام تخفيف المالحة للصحة ولم تستكشف لحزب المحافظين. سمية تخفيف الصحة لدينا في المتوسط عن كثب ربما يحاكي دراسات استخدام فلوريد الصوديوم لأن المخازن المتوسطة الخلية بروتون مجاناً في تخفيف الصحة لدينا.
غيرها من التحديات التي واجهناها كانت تتصل بصقل نماذج ثقافة الخلية لاستخدامها في HTS. وجدنا أنه من الضروري تعديل مكونات الخلية الثقافة المتوسطة للخلايا في التجريب، على وجه التحديد الهيدروكورتيزون والمضادات الحيوية. نحن المستخدمة على مستوى منخفض من الهيدروكورتيزون (0.5 ميكروغرام/مل) خلال دراسات التعرض لقمع سبايك عرضية في إنتاج سيتوكين ينظر في السذاجة هسيك SV40. هذا المبلغ منخفض من الهيدروكورتيزون لا يؤثر سلبا على استجابة الخلايا لأنها سامة ودون المستويات التي عادة ما تستخدم لقمع إنتاج سيتوكين من الخلايا المستزرعة في الاستجابة للمنشطات36،37. الأسباب الحقيقية لماذا الخلايا السذاجة هسيك SV40 أحياناً تنتج السيتوكينات الزائدة غير معروفة، ولكن من الممكن أن الخلايا حساسة مغايرة للضغوطات الطفيفة التي تحدث خلال الخلية باساجينج والطلاء. وتشمل العديد من مختبرات بشكل روتيني المضادات الحيوية في خلية ثقافة الصيانة المتوسطة، ولكن بعض المضادات الحيوية، التتراسكلين على وجه الخصوص، قد ثبت أن معرض الآثار المضادة للالتهابات في الخلايا المستزرعة بما في ذلك الخلايا الظهارية القرنية38. وبصفة عامة، مختبرنا يتجنب استخدام المضادات الحيوية كلما كان ذلك ممكناً منذ هذه يمكن أن يحتمل الخلط بين الدراسات. ونحن أيضا التحقيق الانجراف المظهرية عبر ممرات متعددة لخلايانا في الثقافة. فالشائع للخلايا مخلدة الخضوع للانجراف الوراثي و/أو المظهرية عبر ممرات متعددة، أن لم يكن يحتفظ في مرحلة الأسى، إذا سمح للوصول إلى كونفلوينسي، أو إذا تعرض لبعض عوامل الإجهاد البيئي39،40 ،41. ولذلك، من الأهمية بمكان خلال شاشة عالية إنتاجية أن تمسك خطوط الخلايا بشكل صحيح، وأن اكتمال الشاشة باستخدام أرقام مرور الخلية التي تحافظ على الاستجابة المظهرية المعروفة. آثار حافة لوحة متعددة جيدا هو ظاهرة أن الخلايا التي نمت في آبار محيطة الخارجي من لوحات متعددة غالباً ما لا تستجيب بنفس أو باتساق نفسه كخلايا تزرع في المناطق الداخلية الآبار42. وهناك تمارين الإحصائية، مثل متوسط البولندية، التي يمكن استخدامها لتقليل تأثيرات الحافة في مجموعة البيانات43. ومع ذلك، هناك لا ممارسة الإحصائية التي يمكن القضاء على آثار حافة على هدف معين أو عنصر التحكم إذا أنه دائماً يتم اختبارها في بئر حافة، ومتفاوتة بين تخطيط لوحة وإنشاء نسخ متماثلة لنقل الأهداف أو ضوابط الخروج من حافة الآبار ليس لوجستيا عملية أو فعالة من حيث التكلفة. ومن رأينا أنه ينبغي الحذر قرار إدراج استخدام الآبار الحافة في فحوصات HTS يستند إلى الخلية. وجدنا أنه من الضروري للقضاء على استخدام الخلايا التي نمت في الآبار الحافة للضوابط والأهداف.
استخدمت لدينا HTS الخلية النموذجية والتعرض للمنهجية للإصابة في المختبر التردد لإكمال بنجاح الشاشة siRNA الأولية لأهداف 3120. واستخدمت صمد اختيار ضرب لأنه يقترح تحديداً لقياس حجم الفرق بين عنصر تحكم و siRNA27. نتائجنا لبقاء الخلية تظهر أن هناك علاقة خطية في المؤامرة المزدوجة-مضيا بين صمد وتجليد-تغيير تقريبا جميع الأهداف. ولهذا السبب، استخدمنا معيار واحد صمد لاختيار ضرب لنقطة النهاية هذه. واختلفت البيانات إيل-8 في أن بعض الأهداف قد آثار ضعيفة ولكنها متسقة بينما الآخرين قد أظهرت تأثيرات قوية ولكن غير متناسقة. ولذلك، استخدمنا إضعاف-التغيير وصمد لمعايير اختيار ضرب نقطة النهاية هذه. استخدام القيم صمد لاختيار ضرب لكل خلية على الاستمرار وتم اختيار البيانات إيل-8 لأن سقف بين 1 و 1.645 (أو-1 و-1.65) تحقيق اكتشاف كاذبة منخفضة ومعدلات غير اكتشاف44. وهناك بعض الأهداف التي كانت يضرب في بقاء الخلية والبيانات إيل-8. وفي هذه الحالات، تعطي الأفضلية لإدراجها في مكتبة deconvolution لتلك الأهداف التي مارست آثارها في نفس الاتجاه لتحسين الصحة العامة (السلامة المحسنة وانخفاض إيل-8) أو تفاقم الإصابة (زيادة موت الخلايا و زيادة إيل-8). وعموما، نحن نخبة من إجمالي 250 هدفا بين بقاء الخلية وايل-8 نقاط النهاية تشكل مكتبة deconvolution لإصابة التردد. على الشاشة الأولى للإصابة في المختبر CP قيد التقدم.
وباختصار، قمنا بتطوير ظروف التعرض وثقافة مناسبة لدراسة HTS إصابة العين بالتردد وحزب المحافظين. العديد من المتغيرات في ظروف التعرض والثقافة تم صقلها والأمثل، وتم التحقق من صحة النماذج ملائمة للدراسات HTS بزي ' عامل التحليل. كذلك أثبتنا الأداة المساعدة هذه النماذج بملء الشاشة الرئيسية مكتبة siRNA في نموذج التردد. هناك العديد من الإصابات والأمراض التي لا أو الفائدة المحدودة إلى الصيدلية أو صناعة التكنولوجيا الحيوية، والإصابات السمية من حزب المحافظين، وتضمين التردد، وظهور الروبوتات benchtop يسهل دراسة HTS الإصابات والأمراض في أي مختبر . بيانات الجينوم عالية الإنتاجية مجموعات يمكن أن يسهم إسهاما كبيرا في فهم الأدوار التي تؤديها جينات معينة في الإصابة أو المرض التي يمكن أن تساعد على التركيز أكثر كفاءة متابعة الدراسات في المختبر أو في الجسم الحي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
تنويه: الآراء الواردة في هذه المادة هي تلك التي المؤلف ولا تعكس السياسة الرسمية لإدارة الجيش، ووزارة الدفاع، أو حكومة الولايات المتحدة. هذا البحث كان يؤيد باتفاق مشترك بين الوكالات بين المعاهد الوطنية للصحة/نييد وفي أوسامريكد، وجزئياً بتعيين إلى "البرنامج مشاركة أبحاث الدراسات العليا" في الجيش الطبية بحوث المعهد الكيميائية الدفاع الأمريكية تديرها البلوط معهد ريدج للعلم والتعليم من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأمريكية وأوسامرمك.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث بالوطنية معاهد من الصحة التصدي للبرنامج المشترك بين الوكالات الاتفاق # AOD13015-001. نود أن نشكر ستيفاني فروبيرج وبيتر هيرست لجهودهم والخبرة في إنتاج الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
References
- Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
- Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
- North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
- Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
- Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
- Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
- Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
- Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
- Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
- Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
- Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
- Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
- Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
- Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
- Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
- Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
- IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
- Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
- GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
- Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
- He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
- Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
- Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
- Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
- Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
- Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
- Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
- van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
- Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
- Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
- Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
- ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).
