Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.
Cellulaire microenvironments bestaan uit een aantal signalen, zoals groeifactoren, extracellulaire matrices en intercellulaire interacties. Deze signalen zijn goed georkestreerd en cruciaal bij het reguleren van de functies van de cel in een levend systeem. Hoewel een aantal onderzoekers hebben geprobeerd te onderzoeken van de correlatie tussen milieufactoren en gewenste cellulaire functies, er nog veel onbekend. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van een juiste methodologie te bootsen zo’n milieu signalen in vitro, gelijktijdig testen met verschillende milieu aanwijzingen op cellen. Wij rapporteren hier, een geïntegreerd platform van microfluidic kanalen en een array van de nanofiber, gevolgd door hoge-eencellige inhoudsanalyse, te onderzoeken van de stamcel fenotypen gewijzigd door verschillende omgevingsfactoren. Om aan te tonen van de toepassing van dit platform, deze studie concentreert zich op de fenotypen van zelf vernieuwen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Hier presenteren we de procedures van de voorbereiding voor een matrix van de nanofiber en de microfluidic-structuur in de fabricage van een array Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). Bovendien de algemene stappen voor de eencellige profiling, cel kleuring met meerdere fluorescente markeringen, meerdere fluorescentie imaging en statistische analyses, worden beschreven.
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)1,2 zelf vernieuwen onbeperkt en onderscheid in verschillende geslachten van weefsel, die kunnen een revolutie Geneesmiddelenontwikkeling, cel-gebaseerde therapieën, weefselkweek en regeneratieve geneeskunde 3 , 4 , 5 , 6. algemene cultuur gerechten en microtiterplaat platen, echter zijn niet ontworpen om precieze cel van de fysische en chemische manipulatie op cellulair niveau met het bereik van nano – tot micro-meters, die een kritische factor voor cellulaire expansie is, zelf-vernieuwing en differentiatie. Om aan te pakken dit nadeel, hebben studies onderzocht de rol van cellulaire microenvironments bij het reguleren van de cel-lot besluiten en cel functies4. In de afgelopen jaren zijn een toenemend aantal studies uitgevoerd om te reconstrueren van cellulaire microenvironments in vitro7,8. Nano – en micro-fabricage processen hebben deze microenvironments door de manipulatie van chemische9,10,11,12,13, vastgesteld 14,,15,16,17 en fysieke18,19,20 milieu signalen. Tot nu toe waren er geen meldingen te systematisch onderzoeken van de onderliggende mechanismen van chemische en fysische milieu signalen op cel-lot besluiten en functies binnen een enkel platform.
Hier introduceren we een strategie gebaseerd op eenvoudig ontwerpprincipes om een robuuste screening platform (Figuur 1). Eerst beschrijven we de procedure van de ontwikkeling van een geïntegreerd platform voor het maken van de veelzijdige, kunstmatige cellulaire microenvironments met behulp van een nanofiber array en een microfluidic structuur: de Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME) matrix (Figuur 1A en 2A). De nanofiber array heeft 12 verschillende microenvironments in wisselende combinaties van nanofiber materialen en dichtheden. Electrospinning werd gebruikt om nanofibers te fabriceren. De nanofiber materialen, zoals polystyreen (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22en gelatine (GT)23, werden ontworpen voor het testen van hun chemische eigenschappen, die later nog van invloed kunnen zijn op cel adhesie en het onderhoud van pluripotent ( Figuur 2B). Nanofiber dichtheden waren gevarieerd door het veranderen van electrospinning tijd en de geproduceerde nanofibers werden gedefinieerd volgens hun dichtheid (niet gefinisht, met D = XLow/Low/Mid/High). De microfluidic structuur bestaat uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) 48 celkweek kamers, die kunnen worden geplaatst langs de standaard afmetingen van de 96-Wells-microplate herbergen. PDMS is een biocompatibel en gas-inwisselbaar polymeer gewoonlijk gebruikt voor het fabriceren van microfluidic apparaten24. Elk kanaal van de microfluidic werd ontworpen om 700-µm breed en 8.4-mm lang en had twee inhammen aan de randen (tabel 1). De kamers hadden verschillende hoogtes (250, 500 en 1000 µm) te manipuleren van de eerste cel-zaaien dichtheden (0.3 en 0.6 1,2 × 105 cellen/cm2), die met overleven, proliferatie en differentiatie van hPSCs25 correleren kunnen (Figuur 2C). Het aantal cellen zaadjes in een kamer is evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer, en dus de eerste cel zaaien dichtheid werd gecontroleerd door de invoering van de dezelfde celsuspensie in cultuur kamers met verschillende hoogtes. Alle zenders werden ontworpen om ≥ 250-µm hoge26 om te minimaliseren van de effecten van lage-zuurstof-spanning27 en schuifspanning28 op de cellen. Kanaal hoogten van 250, 500 en 1000 µm hier hierna afgekort als XCD met X = Low, Mid, en hoog, respectievelijk. De omgevingen met verschillende nanofiber dichtheden en eerste cel-zaaien dichtheden waren afgekort als “Material_NF density_Cell dichtheid” (bijvoorbeeld, GT_HighNF_HighCD: een milieu gekenmerkt door high-density GT nanofibers en hoge initiële cel-zaaien dichtheid).
Vervolgens beschrijven we hoe eencellige analyses voor het systematisch onderzoek naar cel gedrag in reactie op milieu-factoren (Figuur 1B) uitvoeren. Als een bewijs-van-concept geïdentificeerd we de optimale cellulaire omgeving voor hPSC zelf-vernieuwing, dat is een belangrijke functie voor hPSC onderhoud (Figuur 1B)29. Beeld-gebaseerde cytometry, gevolgd door statistische analyses, zorgt voor kwantitatieve interpretatie van individuele cellulaire fenotypische reacties op cellulaire omgevingen. Onder een verscheidenheid van cellulaire functies biedt dit Witboek een gedetailleerde procedure ter identificatie van de optimale voorwaarden voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing.
Dit protocol wordt de eerste screeningsmethode om een systeem van de robuuste cultuur voor het onderhoud van gekwalificeerde hPSCs gedemonstreerd. Eerst, beschreven we hoe voor te bereiden op een platform met gevarieerde kunstmatige ECMs en cel dichtheden zaaien met behulp van een microfluidic apparaat geïntegreerd met een nanofiber-serie, de MACME array. Tweede, kwantitatieve beeld-gebaseerde eencellige fenotypering was uitgevoerd50 individuele cellulaire resultaten en gedrag veranderd door vers…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Prof. N. Nakatsuji op iCeMS, de Universiteit van Kyoto, voor het verstrekken van menselijke ES-cellen. Wij danken ook Prof. A. Maruyama aan Tokyo Institute of Technology voor zijn ondersteuning bij het gebruik van de atomaire kracht Microscoop. Financiering was gulle wijze aangeboden door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 en 24656502); financiering werd ook verstrekt door de nieuwe energie en industriële technologie ontwikkeling organisatie (NEDO) en de Terumo Life Science Foundation. De WPI-iCeMS wordt ondersteund door de World Premier International Research Centrum initiatief (WPI), het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan. Een deel van dit werk werd gesteund door de Kyoto Universiteit nanotechnologie Hub en het AIST Nano-Processing Facility in “Nanotechnologie Platform Project” gesponsord door MEXT, Japan.
Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
High-voltage power supply | TechDempaz | ||
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |