Summary
نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. إلى العزلة، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من هذه الخلايا لتحليل تلك الشخصية التعبير الجيني. يسمح هذا البروتوكول لجمع الحمض النووي الريبي عالية الجودة لإجراء تحليل المتلقين للمعلومات مثل قبكر وترانسكريبتوميكس.
Abstract
للحصول على فهم مفصل لدور خلايا الجهاز العصبي المركزي مختلفة أثناء تطوير أو إنشاء وتطور الأمراض الدماغ، من المهم أن عزل هذه الخلايا دون تغيير صورتهم التعبير الجيني. يوفر النموذج الزرد عدد كبير من خطوط الأسماك المحورة وراثيا التي يتم وصف أنواع الخلايا المحددة؛ فعلى سبيل المثال الخلايا العصبية في خط NBT:DsRed أو الضامة/microglia في خط mpeg1:eGFP. وعلاوة على ذلك، تم تطوير الأجسام المضادة لوصمة عار خلايا معينة، مثل ميكروجليا مع 4 4 الأجسام المضادة.
وهنا يصف لنا عزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات. المركزية لهذا البروتوكول تجنب الهضم الأنزيمي الأنسجة في 37 درجة مئوية، ويمكن تعديل التشكيلات الجانبية للهاتف الخلوي. بدلاً من ذلك يتم استخدام نظام ميكانيكي لتجانس الأنسجة في 4 درجات مئوية. ويستتبع هذا البروتوكول تجانس العقول في تعليق خلية، وبهم المناعية تلطيخ وعزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا بنظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد ذلك استخراج الحمض النووي الريبي من تلك الخلايا وتقييم النوعية/كميتها. تمكنا من الحصول على الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية (عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) > 7) لإجراء قبكر على تحليل الضامة/microglia والخلايا العصبية، وترانسكريبتوميك في ميكروجليا. ويمكن هذا النهج أفضل وصف لهذه الخلايا، فضلا عن فهم أوضح حول دورها في التنمية والأمراض.
Introduction
المعرفة في نمو الدماغ وأمراض المخ تحسنت بشكل ملحوظ في العقد الماضي منذ أول التحديد الكمي للماوس الدماغ ترانسكريبتوميس1. والواقع أن تحليل التعبير الجيني واسعة الجينوم يعطينا الوصول للمعلومات الوراثية المفصلة في أنسجة المخ، والخلايا التي يمكن أن تكمل وتحسن الملاحظات مع تقنيات وأدوات أخرى.
الزرد نموذج بيولوجية قوية، سهلة لتولد وتعديلها وراثيا؛ يسمح شفافيته البصرية في مراحل اليرقات الحية التصوير الملاحظات2. لسوء الحظ، بالمقارنة إلى الإنسان والفأر، عدد الأجسام المضادة المتاحة لأداء المناعية تلطيخ منخفضة نوعا. لتصحيح هذا الوضع، مصنوعة خطوط أسماك الزرد المحورة وراثيا بسهولة عن طريق تعديل وراثيا الأسماك للتعبير عن البروتينات الفلورية تحت نوع الخلية المروجين محددة. خطوط الزرد المعدلة وراثيا قد استخدمت في الماضي لدراسة دور الضامة و microglia أثناء تطوير الجهاز العصبي المركزي (CNS) والمرض3،4،،من56. ومع ذلك، فهم تفصيلي لهذه العمليات نحن بحاجة لفهم التغيرات في التعبير الجيني في أنواع الخلايا الخاصة بكل منها. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير أسلوب تجريبي لعزل الخلايا مثل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من 3 إلى 8 أيام على وجه التحديد العقول الزرد اليرقات بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية). لإنشاء البروتوكول، عملنا مع خطوط الأسماك المحورة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في الضامة/microglia تحت بلعم-أعرب عن الجينات المروج (mpeg1:eGFP) ودسريد في الخلايا العصبية تحت العصبية ß-tubulin المروج (NBT:DsRed)7،،من89. وعلاوة على ذلك، أجرينا المناعية تلطيخ microglia استخدام 4 4، جسم [مونوكلونل] ماوس على وجه التحديد البقع الزرد microglia10،11. وبعد ذلك يتم استخراج الحمض النووي الريبي (الرنا) من هذه الخلايا لزيادة كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) أو التحليلات الترنسكربيتوم. وقد صمم هذا البروتوكول كفاءة تجانسه أنسجة المخ من اليرقات الزرد؛ جمع الخلايا العصبية والضامة/microglia و microglia دون تغيير لسلامتهم غشاء البلازما، وأخيراً استخراج الحمض النووي الريبي من هذه الخلايا في ذات جودة عالية (رين > 7) والكمية إلى القيام بتحليل الجينوم. خلافا للدراسات المنشورة سابقا أن استخدام العلاج التربسين في 37 درجة مئوية لهضم أنسجة الدماغ12،13، يشجع هذا البروتوكول العمل في 4 درجات مئوية حتى الخطوة استخراج الحمض النووي الريبي للحد من إدخال تعديلات على التشكيل الجانبي التعبير الجيني. تعد هذه الخطوة الحاسمة ك microglia والضامة الخلايا البالغة الحساسية التي تستجيب للتغيرات في بهم المكروية فورا بتغيير تلك الجينات التعبير الشخصية والاستقطاب14،15، 16.
البروتوكول، ووصف هنا بالتفصيل، يظهر عزل الخلايا العصبية والضامة و microglia من الزرد اليرقات العقول، ولكن عمليا، فإنه يمكن تكييفها مع أي خلية أخرى حاليا داخل المخ-أما باستخدام خطوط الأسماك المحورة وراثيا أو المسمى مع الأجسام المضادة المحددة. هذا الأسلوب يتيح وصف أفضل لخلايا الجهاز العصبي المركزي من خلال تحليلاتها التعبير الجيني واسعة الجينوم وسوف تساعد على فهم دورهم خلال التنمية، وأمراض المخ.
Protocol
1-عينة وإعداد وسائل الإعلام
- إعداد الجنين المتوسطة (E3) بإذابة 6.4 مم بوكل، 0.22 مم كلوريد الصوديوم، 0.33 مم كاكل2 ح 22س، 0.33 مم مجسو4 7 ح2س ح2o.
- جمع الأجنة الزرد مباشرة بعد التسميد (0 إدارة الشرطة الاتحادية).
- انقسام الأجنة الزرد إلى 50 كل طبق بيتري 90 ملم. رفع الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في 50 مل من الأجنة المتوسطة (E3) تعامل مع 200 ميكرومتر 1-فينيل 2 ال (PTU)، من نهاية اليوم الأول للتنمية (0 إدارة الشرطة الاتحادية) خلال مدة التجربة تمنع التصبغ.
- تغيير E3 + المتوسطة PTU يوميا طوال فترة التجربة.
- Mpeg1:eGFP الشاشة واليرقات NBT:DsRed في إدارة الشرطة الاتحادية 2 استخدام ستيريوميكروسكوبي الفلورسنت للتعبير الإيجابي التحوير والضامة بروتينات فلورية خضراء+ /ميكروجليا دسريد+ الخلايا العصبية.
- إعداد جميع وسائل الإعلام اليوم قبل التجربة تحت غطاء زراعة الأنسجة لتفادي التلوث، ثم تخزينها في 4 درجات مئوية.
- تحضير الوسائط بواسطة تذويب حبيس 15 و 25 ملم د-الجلوكوز في حبس 1 x.
- تعد المتوسطة الكثافة المتدرجة (100%) عن طريق خلط 9 وحدات التخزين المتوسطة الكثافة التدرج في حجم 1 من حبس 10 x.
- إعداد المتوسطة الكثافة المتدرجة (22 في المائة) عن طريق إضعاف مل 22 من الكثافة المتوسطة التدرج (100%) في 88 مل دببس 1 x.
- إعداد دببس 1 x.
- إعداد متوسطة E3 + تريكايني بخلط المتوسطة E3 مع 450 ميكرو تريكايني.
2-تجانس
ملاحظة: جميع الخطوات التي يؤديها 4 درجات مئوية.
- إضافة 1.5 مل تريكيني (15 ملم) إلى 90 ملم بيتري الأطباق التي تحتوي على يرقات 50 في 50 مل من E3 الجنين المتوسطة تعامل مع 200 ميكرومتر PTU الميؤوس من شفائهم تخدير لهم.
- تمتص 10 يرقات تخديره من أطباق بيتري مع 3 مل ماصة باستور السائبة البلاستيك.
- نقل تخديره اليرقات 10 من 10 إلى طبق بتري 55 ملم مليئة المثلج المتوسطة الجنين E3 + تريكيني.
- تحت ستيريوميكروسكوبي، محاذاة اليرقات 10 في وسط طبق بيتري. ثم قطاع اليرقات رؤساء أعلاه الصفار-الكيس استخدام الجراحة الصغرى-مقص (استبعاد السباحة المثانة لتجنب العائمة رؤساء).
- تملق الرؤساء من أطباق بيتري مع 3 مل ماصة باستور السائبة البلاستيك. الانتظار حتى رؤساء جميع جمع داخل الحافة ماصة، وثم تحويلها إلى الخالطون زجاج الذي يحتوي على 1 مل المثلج بوسائل الإعلام (نقل حجم الحد أدنى للحد من وسائل الإعلام إضعاف E3 + تريكيني). تبقى الخالطون الزجاج على الجليد. استخدام الخالطون واحد كل حالة تجريبية.
- استبدال كل طبق بيتري الصغيرة التي تحتوي على الجليد الباردة E3 + تريكيني بواحدة جديدة كل 30 دقيقة لضمان أن ترانسيكشن يتم إجراؤها في E3 الباردة + تريكيني المتوسطة.
- استبدال بوسائل الإعلام المثلج في الخالطون الزجاج عندما يبدأ اللون يتلاشى.
ملاحظة: يمكن أن يغير وسائل الإعلام بإضعاف أنسجة الرأس بسبب التغيرات في درجات الحرارة. - مرة واحدة وقد جمعت جميع الرؤساء (600 رؤساء/شرط)، إزالة وحدة التخزين كحد أقصى لوسائل الإعلام من الخالطون الزجاج واستبدالها ب 1 مل أ وسائط الإعلام المثلج الطازج
- تعطيل أنسجة المخ مع الخالطون زجاج مشددة على الجليد. تنفيذ 40 طلقة من سحق ويتحول لليرقات إدارة الشرطة الاتحادية 3-5 و 50 لليرقات إدارة الشرطة الاتحادية 7 و 8.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام (أ) إلى تعليق خلية (1 مل بوسائل الإعلام/200 رؤساء)، التي سوف تضعف الخلايا وتقليل التكتل مع المايلين تيسيرا لفصلهم أثناء استخدام الطرد المركزي في الكثافة المتوسطة التدرج.
- للقضاء على الخلية التكتل، تشغيل تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 40 ميكرومتر وضعت على رأس أنبوب صقر بارد 50 مل الحفاظ على الجليد. كرر هذه العملية 3 مرات.
- نقل 1 مل تعليق خلية في الأنابيب الباردة 1.5 مل وتدور لهم على 300 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية باستخدام حقنه 10 مل + إبرة 23 × 1 ''.
- تعليق إعادة بيليه الخلية مع 1 مل من المثلج المتوسطة الكثافة 22% الانحدار تراكب بلطف بواسطة 0.5 مل من المثلج دببس 1 × (دو لا ميكس سيتبين لهم، الطور البيني بين كل الحلول).
- تدور أنابيب في ز 950 دون الفرامل والتسارع بطيء لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يفصل هذه الخطوة المايلين من الخلايا الأخرى بعزل فإنه في الطور البيني دببس 1 س و 22% الكثافة المتوسطة الانحدار، بينما سيكون بيليه الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة المايلين أكثر فعالية عندما لا يكون تركيز خلية عالية جداً. - استخدام حقنه 10 مل + إبرة 23 × 1 '' تجاهل الحد الأقصى دببس والمتوسطة الكثافة المتدرجة والمايلين محاصرين في الطور البيني بهم.
- غسل الخلايا مع 0.5 مل من وسائل الإعلام (أ) + 2% من مصل الماعز العادي (خ ع)، ثم تدور أنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تجاهل الحد الأقصى من المادة طافية، ثم تجمع كل خلية الكريات من نفس الحالة التجريبية معا في 1 مل من وسائل الإعلام A + 2% خ ع.
- تدور أنابيب في ز 950 دون الفرامل والتسارع بطيء لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إذا كانت الخلايا التي تهم التعبير عن بروتين فلورسنت مثل الضامة/ميكروجليا من mpeg1:eGFP أو الخلايا العصبية من NBT:DsRed الأسماك المحورة وراثيا (فحص الأسماك المحورة وراثيا انظر 1.1.3)، تشغيل تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 35 ميكرون كاب ونقلها إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية الباردة 5 مل على الجليد، ومحمية من الضوء.
ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء المناعية تلطيخ microglia.
3-Microglia المناعية تلطيخ
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية.
- تعليق إعادة بيليه الخلية مع 0.3 مل من وسائل الإعلام A + 2% خ ع. تقسيمها في أنابيب 3 × 1.5 مل: واحدة للخلايا أونستينيد لقياس السيارات-صف من الخلايا ذات الاهتمام، وثانيا لجسم الثانوي (1/200) لقياس الربط غير محددة من جسم الثانوية microglia وثالث كاختبار (4 4 ماوس [مونوكلونل] جسم (microglia محددة) (1/20) + جسم الثانوي (1/200)).
- إضافة "الذيفان منخفضة"، خالية من أزيد (أوراق) % 1 للخلايا (جميع الأنابيب) لمنع تفاعلات CD16/CD32 مع المجال Fc المناعية. احتضان خلايا لمدة 10 دقيقة مع الانفعالات لطيف كل 5 دقائق.
- إضافة 4 4 جسم (1/20) إلى الخلايا (أنبوب 3) واحتضانها لمدة 30 دقيقة مع الانفعالات لطيف كل 10 دقيقة.
- تدور أنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية.
- أغسل مرة واحدة مع 0.5 مل من وسائل الإعلام (أ) + 2% تدور خ ع، ثم الأنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إعادة تعليق خلية بيليه مع 0.5 مل من وسائل الإعلام A + 2% خ ع واحتضان الخلايا التي تحتوي على أوراق في % 1 لمدة 10 دقيقة مع الانفعالات لطيف كل 5 دقائق.
- إضافة جسم الثانوي (1/200) إلى الخلايا (أنبوب 2 و 3). احتضان خلايا لمدة 30 دقيقة مع الانفعالات لطيف كل 10 دقيقة وحماية الخفيفة.
- تدور أنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية.
- أغسل مرتين مع 0.5 مل من وسائل الإعلام A + 2% خ ع، ثم إعادة تعليق خلية بيليه مع 1 مل من وسائل الإعلام A + 2% خ ع.
- تشغيل تعليق خلية عن طريق غطاء مصفاة خلية ميكرومتر 35 وتحويلها إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية الباردة 5 مل على الجليد، ومحمية من الضوء.
4-الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية.
- فرز الخلايا العصبية والضامة/microglia و microglia استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: عادة ما يتم إجراء هذه الخطوة بأحد موظفين مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية والإعدادات تعتمد على نوع المعدات المستخدمة.- إضافة DAPI بتركيز 1 ميكروغرام/مل في كل أنبوبة نظام مراقبة الأصول الميدانية لتسمية الخلايا الميتة.
- إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية وفرز الخلايا العصبية، والضامة/ميكروجليا أو ميكروجليا من جميع خلايا الدماغ. خلايا منفصلة من الحطام في دالة لحجم ومستوى، ثم بوابة واحدة-الخلايا المبعثرة إلى الأمام والجانب مبعثر. استبعاد الخلايا الميتة عن طريق وضع العلامات DAPI من الخلايا الحية. تحديد الخلايا العصبية، والضامة/microglia أو microglia بها على تلطيخ إيجابية منها.
- جمع الخلايا في أنابيب 1.5 مل يحتوي على 1 مل من المثلج بالوسائط + 2% خ ع على الجليد. استخدام أنابيب مختلفة لكل نوع من الخلايا.
- وتدور أنابيب في 300 غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية ثم تجاهل المادة طافية.
- أغسل مرة واحدة مع 0.5 مل من وسائل الإعلام تجاهل ذلك بأقصى قدر من المادة طافية.
5. استخراج الحمض النووي الريبي
- استخراج الحمض النووي الريبي من أنواع مختلفة من الخلية مفصولة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية. لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام أدوات محددة واتباع إرشادات الشركة المصنعة. ضمان للعمل في بيئة حرة رناسي بتنظيف مساحة العمل والماصات مع منتج إزالة تلوث رناسي واستخدم التلميحات عامل التصفية.
- إعداد طازجة 1 مل من تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول.
ملاحظة: هنا، يتم إضافة β-ميركابتوثانول للحد من تدهور الجيش الملكي النيبالي. - تعد 70 في المائة و 80 في المائة من الإيثانول الحل باستخدام رناسي المياه مجاناً.
- الخلايا مع ميليلتر 75 تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول. ثم استخدم تقطيع لتحسين اضطراب الخلية.
- مواصلة دليل لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقا للشركة المصنعة.
- في نهاية البروتوكول، الوت الجيش الملكي النيبالي مع 14 ميليلتر رناسي المياه مجاناً للحصول على تركيز الحمض النووي الريبي كاف.
- إعداد طازجة 1 مل من تحلل المخزن المؤقت تستكمل مع 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول.
Representative Results
بروتوكول وصف نهج واضحة لعزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول اليرقات الزرد. معزولة من هذه الخلايا، وكميات كبيرة من جودة عالية (رين > 7) تم استخلاص الحمض النووي الريبي. والهدف من هذا البروتوكول عزل أنواع مختلفة من الخلايا من الجهاز العصبي المركزي، مع تعديل الحد الأدنى من التشكيل الجانبي التعبير الجيني لتحليل ووصف خصائص الخلية ووظائفها. ذلك، يتم تنفيذ البروتوكول بأكمله في 4 درجات مئوية مع تجانس أنسجة الدماغ ميكانيكية. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لاثنين من الدراسات التي أجريت في المختبر. في الدراسة الأولى، والخلايا العصبية والضامة/microglia كانت معزولة من اليرقات/NBT:DsRed+ mpeg1:eGFP+إدارة الشرطة الاتحادية 8 (الشكل 1). نظام مراقبة الأصول الميدانية يسمح فصل خلية من الحطام في دالة حجمها (منتدى التعاون الأمني-أ) وتقسيمات (SSC-أ) (الشكل 1أ). ثم تم فصل الخلايا المفردة من دوبليتس أو اجلمرتر الخلية (الشكل 1ب). من السكان خلية مفردة، الانتباه بوابة للقضاء على الخلايا الميتة (DAPI+). وكشف مؤامرة النقطة المقابلة أن هذا البروتوكول التجريبي يحافظ على سلامة غشاء بلازما الخلية، كما هو معدل الخلايا الميتة 26.7 في المائة فقط (الشكل 1ج). وأخيراً، بسهولة فصل الخلايا العصبية (دسريد+) والضامة/microglia (التجارة والنقل+) من أبواب السكان خلية حية. وبدأ السكان العصبية (23.1 في المائة) تكون أكثر بروزا من السكان الضامة/ميكروجليا (1.56%) داخل المخ (الشكل 1د). وقد يسمح هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من تلك الخلايا لإجراء تحليلات qPCR اللاحقة لمقارنة الجينات محددة بين الخلايا العصبية والضامة/microglia. يظهر الشكل 2 الخلايا العصبية والضامة/microglia مستويات التعبير الجيني تكاثر الخلايا النووية مستضد (منها)ضد الجينات حفظ البيت β أكتين كمثال.
الثاني لدراسة هذا الأسلوب يركز على عزل ميكروجليا من العقول اليرقات إدارة الشرطة الاتحادية 3 و 5 و 7. على النقيض من التجربة المذكورة أعلاه، كانت معزولة الخلايا تلطيخ المناعية باستخدام 4 4، جسم فيها على وجه التحديد تسميات microglia (الشكل 3 ألف-دال). كما سبق ذكره، ميكروجليا (4 4+) واختيرت من الخلايا الحية وجمعها (الشكل 3د). أرقام Microglia داخل أدمغة الزرد اليرقات متغير (الجدول 1)، ومنخفضة جداً في 3 إدارة الشرطة الاتحادية (∼ 25 كل الأسماك). تم قياس نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي المستخرج من تلك الخلايا باستخدام نظام التفريد الشعرية الصغرى على أساس. وقدمت النتائج التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي المستخرج من microglia من إدارة الشرطة الاتحادية 5 الزرد اليرقات العقول توضيح مثال لتحليل الحمض النووي الريبي (الجدول 1 (5 إدارة الشرطة الاتحادية؛ والتجربة 4)). ويبين الشكل 4 التفريد التتبع والتمثيل البياني لها الحصول على هذه العينة بوضع تصور واضح للحمض النووي الريبي الريباسي (ث و 18s). هذه البيانات أمر ضروري لحساب عينة رين وتحديد تركيز الجيش الملكي النيبالي. ويلخص الجدول 1 عدد microglia معزولة الواحدة والأسماك وكمية الحمض النووي الريبي للواحد microglia ونقاط رين الحصول عليها لكل تجربة مختلفة في إدارة الشرطة الاتحادية 3 و 5 و 7. الكمية والنوعية من الحمض النووي الريبي المستخرج من microglia المعزولة باستخدام هذا الأسلوب سمح لنا بتضخيم الجيش الملكي النيبالي في كدنا استخدام عدة. اختبارات الجودة والكمية المقدمة من "علم الجينوم أدنبرة" تؤكد أن كدنا تضخيم ذات نوعية كافية لإعداد مكتبة وتسلسل اللاحقة. يبين الشكل 5 توزيع حجم الشظايا التي كدنا وحجمها يقاس باستخدام نظام الغرواني الكهربي. في هذه العينة، قد كدنا متوسط حجم 299bp بتركيز 36100 pmol/l. 2 جدول يوضح على التوالي اختبارات نوعية وكمية على تضخيم كدنا من عينات الحمض النووي الريبي (الجدول 1 (5 إدارة الشرطة الاتحادية؛ والتجربة 4)). وقد استخدمت بنجاح كدنا تضخيم للتسلسل.
وأكدت العديد من الدراسات التي أجريت في المختبرات أنه يمكن استخدام نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا العصبية والضامة و microglia qPCR اللاحقة والجينوم الجينات واسعة تعبير تحاليل. ولذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول التجريبي لعزل موثوق بها أنواع مختلفة من خلايا الجهاز العصبي المركزي دون تغيير على سلامة الغشاء ويحد من تعديل التشكيل الجانبي التعبير الجيني.
الشكل 1 : نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز للخلايا العصبية والضامة/ميكروجليا من/NBT:DsRed mpeg1:GFP++ إدارة الشرطة الاتحادية 8 الزرد اليرقات. (أ-ج) النابضة المتعاقبة يظهر التحديد متسلسلة من خلايا جميع الدماغ (A)، والخلايا المفردة المبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر (ب). تم استبعاد الخلايا (ج) الميت بالوسم DAPI. (د) الخلايا العصبية والضامة/microglia حددت على التوالي تلطيخ إيجابية دسريد والتجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل التعبير الجيني منها و بيتا-أكتين في الخلايا العصبية والضامة/microglia. يمكن نسخها الجيش الملكي النيبالي من الخلايا العصبية معزولة والضامة/microglia إلى كدنا لاستخدامها في التحليل الكمي لبكر. مستويات التعبير مرناً منها ضد β أكتين البيت حفظ الجينات في الخلايا العصبية معزولة والضامة/microglia يحددها qPCR (N = 3). وتم قياس التغيير إضعاف استخدام الأسلوب المقارن (ΔΔCT). خطأ بار تمثل يعني ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز ل microglia من اليرقات الزرد إدارة الشرطة الاتحادية 3- (أ-ج) المتعاقبة النابضة إظهار التحديد متسلسلة من الدماغ جميع الخلايا (A)، والخلايا المفردة المبعثر إلى الأمام والجانب مبعثر (ب). تم استبعاد الخلايا (ج) الميت بالوسم DAPI. (د) Microglia وحددت 4 4 تلطيخ إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : نتائج التفريد الشعرية الصغيرة من الحمض النووي الريبي المستخرج من إدارة الشرطة الاتحادية 5 الزرد microglia. هي قمم طويل القامة اثنين 18S و 28S ريبوسومال الجيش الملكي النيبالي. وحسب عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) تلقائياً بالبرنامج بيواناليزير باستخدام نسبة ولدت في 18S ومفارز ريبوسومال 28S وتحليل التتبع الغرواني الكهربي كامل. الجيش الملكي النيبالي Microglia قد 8.6 رين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : اختبارات النوعية والكمية لتضخيم كدنا من عينات الحمض النووي الريبي من إدارة الشرطة الاتحادية 5 الزرد microglia. الصورة تظهر توزيع كدنا حجم جزء من العينة التي تم تحليلها مع متوسط حجم 299 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الشرط | تجربة | عدد الأسماك | عدد الخلايا | عدد الخلايا في الأسماك | تركيز الحمض النووي الريبي (جزء من الغرام/ul) | مجموع الحمض النووي الريبي (pg) | كمية الحمض النووي الريبي كل خلية (pg) | نقاط رين |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0.13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0.13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0.16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | بوصة 18.54 بوصة | 189 | 2268 | 0.20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0.10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0.07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0.13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0.09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0.07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74.95 | 134 | 1608 | 0.04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0.04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0.04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0.04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0.06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0.07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0.08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0.06 | 7.8 |
الجدول 1: موجز لعزل microglia والجيش الملكي النيبالي استخراج البيانات من اليرقات الزرد إدارة الشرطة الاتحادية 3 و 5 و 7.
| معرف نموذج داخلي | معرف نموذج خارجي | كوبيت (نانوغرام/ul) | Qubit(ng/ul) | متوسط تركيز (نانوغرام/ul) | وحدة التخزين (ul) | ميكروغرام تلقي | درجتي النجاح والرسوب لتركيز الحد الأدنى | درجتي النجاح والرسوب لكمية minimim | درجتي النجاح والرسوب للكمية الموصى بها |
| 10907SD0010 | 5 إدارة الشرطة الاتحادية (التجربة 4) | 58.8 | 58.4 | 58.6 | 30 | 1.76 | تمرير | تمرير | تمرير |
| نموذج متطلبات الإعدادية المكتبة: | |||||||||
| مكتبة الإعدادية | الحد الأدنى للكمية (الحرس الوطني) | الكمية الموصى بها (الحرس الوطني) | أدنى تركيز نانوغرام/uL | ||||||
| نانو تراسك جل bp إدراج مكتبة 350 مجانية من كدنا | 600 | 1100 | 10 | ||||||
الجدول 2: الاختبارات الكمية لتضخيم كدنا من عينات الحمض النووي الريبي من إدارة الشرطة الاتحادية 5 الزرد microglia.
Discussion
ويمثل البروتوكول التجريبي الموصوفة هنا طريقة قوية وفعالة لعزل خلايا الدماغ من اليرقات الزرد من 3 إلى 8 إدارة الشرطة الاتحادية. الأهم من ذلك، هذا هو البروتوكول الأول أن يسمح عزل محددة من microglia من العقول الزرد اليرقات. البروتوكول يهدف إلى الحفاظ على سلامة غشاء الخلية، وللتقليل من التعديلات المحتملة لتعبير الجينات التي تحدث أثناء المعالجة. هذه النقطة الأخيرة حاسمة بالنسبة لأهمية النتائج استناداً إلى تحليل تلك الملامح المجينية الخلوية معزولة. في الواقع، تتأثر بشدة الاستقطاب microglia وبلعم المكروية بهم. عند 37 درجة مئوية، أن هذه الخلايا قد تغيرت صورتهم التعبير الجيني في استجابة للظروف التجريبية (رد الضرر (ترانسيكشن)). ولذلك، من المهم إجراء هذه التجربة في 4 درجات مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي، إلى إبطاء العمليات الخلوية والأنشطة الأيضية. وعلاوة على ذلك، تم اختيار تجانس أنسجة الدماغ الميكانيكية في 4 درجات مئوية بدلاً من الهضم الأنزيمي الأنسجة في 37 درجة مئوية تفادي أي تأثير على التشكيلات الجانبية للتعبير الجيني.
من المهم تسليط الضوء على أن هذا الأسلوب سريع جداً؛ خلال يوم يمكن السكان خلايا الدماغ عدة معزولة من اثنين على الأقل من شروط تجريبية مختلفة وعلى الحمض النووي الريبي المستخرج. الطول الإجمالي للبروتوكول يعتمد على عدد اليرقات تستخدم لكل شرط ترانسيكشن رؤساء اليرقات هو الخطوة تحد (∼ 350 رؤساء/h). وبصفة عامة، للعمل مع ميكروجليا من 3، 5 و 7 إدارة الشرطة الاتحادية يوصي بقطاع ∼ رؤساء 600 كل اختبار للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لاستخراج (الجدول 1). كما ميكروجليا تمثل نوع الخلية مع أدنى العائد (حوالي 112 خلايا الفرد في إدارة الشرطة الاتحادية 7)، يمكن تخفيض عدد رؤساء لأنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الضامة (حوالي 170 خلايا الفرد في إدارة الشرطة الاتحادية 7).
وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أنه متى تم إنشاء الإعدادات على فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن استخدام نفس الإعدادات لتجارب مختلفة. فقد لوحظ أن السكان خلية تناسب تماما من تجربة واحدة إلى أخرى مع بوابات مصممة مسبقاً، تظهر إمكانية تكرار نتائج التجارب باستخدام هذا الأسلوب.
عيوب طفيفة من هذا الأسلوب هو مبلغ منخفض نسبيا من الحمض النووي الريبي التي يتم حصادها. غير هذا القيد أكثر قضية بيولوجية من مسألة تقنية، كما أن عدد microglia منخفض جداً في المراحل المبكرة من نمو الدماغ (الجدول 1). بسبب هذا كمية منخفضة من الحمض النووي الريبي التي تم جمعها، خطوات التضخيم بحاجة إلى النظر إلى القيام بتحليل التعبير الجيني واسعة الجينوم. لحسن الحظ، هذه الخطوات التضخيم إنتاج كميات كافية من كدنا عالية الجودة. وهكذا، يمكن دراسة التغيرات العالمية في ملامح التعبير الجيني الخلايا المعزولة.
وفي الختام، يوفر هذا البروتوكول وسيلة قوية لعزل ودراسة مختلف أنواع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من العقول الزرد اليرقات. يمكن تطبيق هذا على اكتساب فهم أعمق لهذه الخلايا من خلال التنمية، وكذلك فيما يتعلق بدراسة دورها في المرض.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور كلير ديفيز والدكتور فيرونيك ميرون (الملكة معهد الأبحاث الطبية، أدنبرة، المملكة المتحدة) لمساعدة أولية والمناقشات بشأن النهج التجريبي وقمري التدفق الخلوي والخلية الفرز مرفق. وأيد هذا العمل "جائزة إنشاء السرطان بحوث المملكة المتحدة المهنة" للدكتور ديرك الفائزون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
