Summary
Vi præsenterer en protokol for at isolere neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner fysiologiske og patologiske betingelser. Ved isolation, er RNA udvundet fra disse celler til at analysere deres gen expression profil. Denne protokol giver mulighed for samling af høj kvalitet RNA til at udføre downstream analyse som qPCR og transcriptomics.
Abstract
For at opnå en detaljeret forståelse af rollen, som forskellige CNS celler under udvikling eller etablering og progression af hjernen patologier, er det vigtigt at isolere disse celler uden at ændre deres gen expression profil. Zebrafisk model giver et stort antal af transgene fisk linjer hvor specifikke celletyper er mærket; for eksempel neuroner i den NBT:DsRed linje eller makrofager/mikroglia i mpeg1:eGFP linjen. Derudover antistoffer er blevet udviklet for at plette specifikke celler, såsom mikroglia med 4 c 4 antistof.
Her beskriver vi isolation af neuroner, makrofager og mikroglia fra larve zebrafisk hjerner. Centralt for denne protokol er at undgå en enzymatisk væv fordøjelsen ved 37 ° C, som kunne ændre cellulære profiler. I stedet anvendes et mekanisk system af væv homogenisering ved 4 ° C. Denne protokol indebærer homogenisering af hjerner i cellesuspension, deres immuno-farvning og isolation af neuroner, makrofager og mikroglia af FACS. Bagefter kan vi ekstraheret RNA fra disse celler og evalueret deres kvalitet/antal. Det lykkedes os at få RNA af høj kvalitet (RNA integritet nummer (RIN) > 7) til at udføre qPCR på makrofager/mikroglia og neuroner og transkriptom analyse på mikroglia. Denne fremgangsmåde giver en bedre Karakteristik af disse celler, samt en klarere forståelse af deres rolle i udvikling og patologier.
Introduction
Viden om hjernens udvikling og hjernesygdomme forbedredes betydeligt i det sidste årti siden den første kvantificering af musen hjernen transcriptomes1. Faktisk, bred gen expression genomanalyse giver os adgang til genetiske oplysninger om hjernevæv og celler, der kan supplere og forbedre bemærkninger med andre teknikker og værktøjer.
For zebrafisk er en potent biologiske model, nem at opdrætte og ændre genetisk; dets optiske gennemsigtighed på larve stadier tillader live imaging observationer2. Desværre, i forhold til mennesker og mus, antallet af tilgængelige antistoffer til at udføre immuno-farvning er forholdsvis lav. For at afhjælpe dette, er transgene zebrafisk fisk linjer let lavet af genetisk ændring af fisk til at udtrykke fluorescerende proteiner under celle type specifikke initiativtagere. Transgene zebrafisk linjer har været brugt i fortiden til at studere makrofager og mikroglia rolle i centralnervesystemet (CNS) udvikling og sygdom3,4,5,6. Vi skal imidlertid forstå ændringer i genekspression i de respektive celletyper for at opnå en detaljeret forståelse af disse processer. Til dette formål, vi udviklet en eksperimentel metode til at specifikt isolere celler som neuroner, makrofager og mikroglia fra 3 til 8 dage efter befrugtning (dpf) larve zebrafisk hjerner. For etablering af protokollen arbejdede vi med transgene fisk linjer, der udtrykker grøn fluorescerende proteiner (NGL) i makrofager/mikroglia under makrofag-udtrykte gen promoter (mpeg1:eGFP) og DsRed i neuroner i den neurale β-tubulin Promoter (NBT:DsRed)7,8,9. Derudover udføres vi immuno-farvning af mikroglia bruger 4 c 4, en mus monoklonalt antistof, der specifikt pletter zebrafisk mikroglia10,11. Bagefter, ribonukleinsyre (RNA) er udvundet fra disse celler for yderligere kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) eller transkriptom analyser. Denne protokol er blevet designet til at effektivt homogeniseres hjernevæv fra zebrafisk larver; indsamle neuroner, makrofager/mikroglia og mikroglia uden ændring af deres plasma membran integritet og endelig uddrag RNA fra disse celler i høj kvalitet (RIN > 7) og mængde til at udføre genomisk analyse. I modsætning til tidligere offentliggjorte undersøgelser, der bruger trypsin behandling ved 37 ° C til at fordøje hjernen væv12,13, fremmer denne protokol arbejde ved 4 ° C indtil RNA udvinding skridt til at reducere ændringer af genet udtryk profil. Dette trin er afgørende som mikroglia og makrofager er meget følsomme celler, der reagerer på ændringer i deres mikromiljø straks ved at ændre deres gen expression profil og polarisering14,15, 16.
Protokollen, beskrevet her i detaljer, viser isolation af neuroner, makrofager og mikroglia fra zebrafisk larve hjerner, men næsten, det kan tilpasses til enhver anden celle til stede i hjernen - enten ved hjælp af transgene fisk linjer eller mærket med specifikke antistoffer. Denne metode vil give en bedre Karakteristik af CNS celler gennem deres genom bred gen expression analyser og vil bidrage til at forstå deres rolle under udvikling og hjernesygdomme.
Protocol
1. prøven og medier forberedelse
- Forberede embryo medium (E3) ved at opløse 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O.
- Indsamle zebrafisk embryoner umiddelbart efter befrugtningen (0 dpf).
- Opdele zebrafisk embryoner i 50 / 90 mm petriskål. Hæve embryoner ved 28,5 ° C i 50 mL af embryo medium (E3) behandlet med 200 µM 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU), fra slutningen af den første dag i udvikling (0 dpf) for varigheden af forsøget at hæmme pigmentering.
- Ændres E3 + PTU medium dagligt for varigheden af forsøget.
- Skærmen mpeg1:eGFP og NBT:DsRed larver på 2 dpf ved hjælp af en fluorescerende stereomikroskopet for positive transgen udtryk, normal god landbrugspraksis+ makrofager/mikroglia og DsRed+ neuroner.
- Forberede alle medier dagen før eksperiment under en vævskultur hætte til at undgå forurening, så Opbevar dem ved 4 ° C.
- Forberede medier A ved at opløse 15 mM Hepes og 25 mM D-Glucose i HBSS 1 x.
- Forberede tæthed gradient medium (100%) ved at blande 9 bind af tæthed gradient medium i 1 bind af HBSS 10 x.
- Forberede tæthed gradient medium (22%) ved at fortynde 22 mL af tæthed gradient medium (100%) i 88 mL DPBS 1 x.
- Forberede DPBS 1 x.
- Forberede E3 medium + Tricaine ved at blande E3 medium med 450 μM Tricaine.
2. homogenisering
Bemærk: Alle trin er udført 4 ° C.
- Der tilsættes 1,5 mL Tricaine (15 mM) til 90 mm petriskåle, der indeholder 50 larver i 50 mL af E3 embryo medium behandlet med 200 µM PTU til terminalt bedøver dem.
- Suge op 10 bedøvede larver fra petriskåle med 3 mL Pasteur plast bulk pipette.
- Overførsel bedøvede larver 10 af 10 i en 55 mm petriskål fyldt med iskolde E3 embryo medium + Tricaine.
- Under et stereomikroskop, justere 10 larverne midt i petriskålen. Derefter Transekttællinger larve hoveder ovenfor blommesækken ved hjælp af kirurgiske mikro-saks (udelukke svømme blæren for at undgå flydende hoveder).
- Suge op hoveder fra petriskåle med 3 mL Pasteur plast bulk pipette. Vent, indtil alle hoveder samles inden for pipette spids og derefter overføre dem til et glas homogeniseringsapparat indeholdende 1 mL iskold Media A (overførsel i en minimal mængde at reducere medier en fortynding af E3 + Tricaine). Holde glas homogeniseringsapparat på is. Bruge én homogeniseringsapparat pr. eksperimentelle tilstand.
- Erstatte hver lille petriskål indeholdende is kold E3 + Tricaine med en ny hvert 30 min til at forsikre om, at transection udføres i kolde E3 + Tricaine medium.
- Erstatte den iskolde Media A i glas homogeniseringsapparat, når farven begynder at falme.
Bemærk: Media A fortynding kan ændre den hoved væv på grund af temperaturændringer. - Når alle hoveder har været indsamlet (600 hoveder/betingelse), fjerne den maksimale lydstyrke Media a fra glas homogeniseringsapparat og erstatte det med 1 mL frisk iskold Media A.
- Forstyrre hjernevæv med en stram glas homogeniseringsapparat på is. Udføre 40 runder af knusning og sving for 3-5 dpf larver og 50 for 7 og 8 dpf larver.
- Der tilsættes 2 mL af medier A til cellesuspension (1 mL Media A / 200 hoveder), som vil udvande celler og reducere deres bymæssige bebyggelser med myelin at lette deres adskillelse under centrifugering i tæthed gradient medium.
- For at eliminere celle bymæssigt område, skal du køre cellesuspension gennem en 40 µm celle si placeres oven på en kold 50 mL falcon tube vedligeholdes på is. Denne operation gentages 3 gange.
- Overføres 1 mL cellesuspension til koldt 1.5 mL rør og spin dem på 300 g i 10 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten ved hjælp af en 10-mL sprøjte + nål 23G x 1''.
- Genopslæmmes celle toerstoffet med 1 mL iskold 22% tæthed gradient medium forsigtigt overlejret af 0,5 mL iskold DPBS 1 x (ikke mix dem, en interfasen mellem begge løsninger vil ses).
- Spin rør på 950 g uden bremse og langsom acceleration i 30 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Dette trin adskiller myelin fra andre celler af binding det på interfasen af DPBS 1 x og 22% tæthed gradient medium, der henviser til, at celler vil pellet i bunden af røret. Myelin fjernelse er mere effektiv, når celle koncentration ikke er for høj. - Ved hjælp af en 10-mL sprøjte + kanyle 23G x 1'' kassere maksimalt antal DPBS, density gradient medium og myelin fanget på deres interfasen.
- Vaske cellerne med 0,5 mL af medier A + 2% af normal ged serum (NGS), så spin rør på 300 g i 10 min. ved 4 ° C.
- Kassér maksimalt af supernatanten og derefter samle alle celle pellets fra den samme eksperimentelle tilstand sammen i 1 mL af medier A + 2% NGS.
- Spin rør på 950 g uden bremse og langsom acceleration i 30 min. ved 4 ° C.
- Hvis celler af interesse udtryk for en fluorescerende proteiner som makrofager/mikroglia fra mpeg1:eGFP eller neuroner fra NBT:DsRed transgene fisk (screening af transgene fisk Se 1.1.3), køres cellesuspension gennem en 35 µm celle si cap og overføre dem til en kolde 5 mL FACS rør på is, beskyttet mod lys.
Bemærk: Alternativt kan immuno-farvning af mikroglia udføres.
3. mikroglia Immuno-farvning
Bemærk: Alle trin er udført ved 4 ° C.
- Genopslæmmes celle pellet med 0,3 mL af medier A + 2% NGS. Opdele dem i 3 x 1,5 mL rør: en for unstained celler til at måle auto-fluorescens fra celler af interesse, for det andet for sekundær antistof (1/200) til at måle ikke-specifik binding af den sekundær antistof til mikroglia og tredje som en test (4 c 4 mus monoklonale antistof (mikroglia specifikke) (1/20) + sekundær antistof (1/200)).
- Tilføje lav Endotoxin, indeholder-fri (blad) på 1% til celler (alle rør) at blokere CD16/CD32 interaktioner med domænet Fc af immunoglobuliner. Inkuber celler i 10 min med blid agitation hvert 5 min.
- Tilføj 4 c 4 antistof (1/20) til celler (rør 3) og Inkuber i 30 min med blid agitation hver 10 min.
- Spin rør på 300 g i 10 min. ved 4 ° C, og supernatanten.
- Vaske når med 0,5 mL af medier A + 2% NGS, derefter spin rør på 300 g i 10 min. ved 4 ° C.
- Genopslæmmes celle pellet med 0,5 ml af medier A + 2% NGS og inkuberes celler med blad på 1% for 10 min med blid agitation hvert 5 min.
- Tilføje sekundær antistof (1/200) til celler (rør 2 og 3). Inkuber celler i 30 min med blid agitation, hver 10 min og light beskyttelse.
- Spin rør på 300 g i 10 min. ved 4 ° C, så kassér supernatanten.
- Vaskes to gange med 0,5 mL af medier A + og 2% NGS derefter genopslæmmes celle pellet med 1 mL af medier A + 2% NGS.
- Køre cellesuspension gennem en 35 µm celle si cap og overføre dem til kolde 5 mL FACS rør på is, beskyttet mod lys.
4. celle sortering (FACS)
Bemærk: Udfør alle trin ved 4 ° C.
- Sortere neuroner, makrofager/mikroglia og mikroglia ved hjælp af en FACS.
Bemærk: Dette trin udføres normalt af en ansat i FACS facilitet og indstillinger afhænger af typen udstyr, der anvendes.- Tilføje DAPI ved en koncentration på 1 µg/mL i hver FACS tube at mærke døde celler.
- Oprette FACS og sortere neuroner, makrofager/mikroglia eller mikroglia fra alle hjerneceller. Separate celler fra vragrester i funktion af deres størrelse og detaljeringsgrad, så porten single-celler af forward scatter og side scatter. Udelukke døde celler af DAPI mærkning fra levende celler. Identificere neuroner, makrofager/mikroglia eller mikroglia ved deres respektive positive farvning.
- Indsamle celler i 1,5 mL rør indeholdende 1 mL iskold Media A + 2% NGS på is. Bruge forskellige rør for hver celle.
- Spin rør på 300 g i 10 min. ved 4 ° C og derefter supernatanten.
- Vask når med 0,5 mL af medier A så kassér maksimalt af supernatanten.
5. RNA udvinding
- Uddrag RNA fra de forskellige celletyper adskilt af FACS. For RNA udvinding bruge en specifik kit og følg producentens retningslinjer. Sikre, at du arbejder i et RNase gratis miljø af rengøring arbejdsområde og pipetter med et RNase dekontaminering produkt og bruge filter tips.
- Frisk forberede 1 mL af lysisbuffer suppleret med 50 µM β-mercaptoethanol.
Bemærk: Β-mercaptoethanol tilføjes her, reducere RNA nedbrydning. - Forberede 70% og 80% ethanol løsning ved hjælp af RNase gratis vand.
- Lyse celler med 75 µL af lysisbuffer suppleret med 50 µM β-mercaptoethanol. Brug derefter en shredder for at forbedre celle forstyrrelser.
- Fortsætte RNA udvinding ifølge fabrikanten er manuel.
- For enden af protokollen elueres RNA med 14 µL af RNase gratis vand for at opnå en tilstrækkelig RNA-koncentration.
- Frisk forberede 1 mL af lysisbuffer suppleret med 50 µM β-mercaptoethanol.
Representative Results
Den beskrevne protokol er en ligetil tilgang til at isolere neuroner, makrofager og mikroglia fra zebrafisk larve hjerner. Fra disse isolerede celler, betydelige mængder af høj kvalitet (RIN > 7) RNA blev udvundet. Formålet med denne protokol er at isolere forskellige typer af celler fra CNS, med minimal ændring af deres gen expression profil til at analysere og karakterisere celleegenskaber og funktioner. Derfor, den hele protokol udføres ved 4 ° C med en mekanisk hjerne væv homogenisering. Denne metode har held været anvendt til to undersøgelser udført i laboratoriet. I den første undersøgelse blev neuroner og makrofager/mikroglia isoleret fra 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larver (figur 1). FACS tilladt celleseparering fra vragrester i funktion af deres størrelse (FSC-A) og nøjagtighed (SSC-A) (fig. 1A). Enkelt celler blev derefter adskilt fra dubletter eller celle vandbad (figur 1B). Fra enkelt celle population, var en gate trukket for at fjerne døde celler (DAPI+). Den tilsvarende dot plot afslørede, at denne forsøgsplan bevarer celle plasma membran integritet, som de døde celler er kun 26,7% (figur 1C). Endelig blev neuroner (DsRed+) og makrofager/mikroglia (normal god landbrugspraksis+) let adskilt fra de levende celle befolkning gates. Neuron befolkning (23,1%) syntes at være mere fremtrædende end makrofager/mikroglia befolkning (1,56%) i hjernen (fig. 1D). Denne protokol har lov til at isolere RNA fra disse celler til at gennemføre efterfølgende qPCR analyser for at sammenligne udtryk for specifikke gener mellem neuroner og makrofager/mikroglia. Figur 2 viser neuronal og makrofager/mikroglia gen expression niveauer af prolifererende celle nukleare antigen (pcna)mod β-actin hus-holder genet som et eksempel.
For den anden undersøgelse fokuserede denne metode på mikroglia isolation fra 3, 5 og 7 dpf larve hjerner. I modsætning til eksperimentet beskrevet ovenfor, celler blev isoleret af immuno-farvning bruger 4 c 4, et antistof, der specifikt etiketter mikroglia (fig. 3 A-D). Som tidligere beskrevet, mikroglia (4 c 4+) blev valgt fra levende celler og indsamlet (figur 3D). Mikroglia numre inden for zebrafisk larve hjerner er variable (tabel 1), og meget lav på 3 dpf (∼ 25 pr. fisk). Kvaliteten og kvantiteten af ekstraheret RNA fra disse celler blev målt ved hjælp af en mikro-kapillær elektroforese baseret system. Resultaterne af ekstraheret RNA fra mikroglia af 5 dpf larve zebrafisk hjerner har fået til at illustrere et eksempel med RNA analyse (tabel 1 (5 dpf; eksperiment 4)). Figur 4 viser elektroforese spor og dens grafiske repræsentation fremstillet for denne prøve med klare visuelle effekter af ribosomale RNA (28s og 18s). Disse data er nødvendige for at beregne prøve RIN og til bestemmelse af RNA koncentration. Tabel 1 opsummerer antallet af isolerede mikroglia pr. fisk, RNA beløb pr. mikroglia og RIN score opnået for hver forskellige eksperiment på 3, 5 og 7 dpf. Mængden og kvaliteten af ekstraheret RNA fra isolerede mikroglia ved hjælp af denne metode tillod os at forstærke RNA til cDNA ved hjælp af et kit. Kvalitet og kvantitet tests leveret af Edinburgh genomforskning bekræfte, at den forstærkede cDNA er af tilstrækkelig kvalitet for biblioteket forberedelse og efterfølgende sekventering. Figur 5 viser størrelse fordelingen af cDNA fragmenter og deres beløb målt ved hjælp af en elektroforese system. I dette eksempel, cDNA havde en gennemsnitlig størrelse på 299bp i en koncentration på 36100 pmol/l. tabel 2 illustrerer henholdsvis kvalitet og kvantitet tests foretaget på forstærkede cDNA fra RNA prøver (tabel 1 (5 dpf; eksperiment 4)). Den forstærkede cDNA har været anvendt med succes til sekvensering.
Flere undersøgelser udført i laboratoriet bekræftet, at kvaliteten og kvantiteten af ekstraheret RNA fra neuroner, makrofager og mikroglia kan bruges til efterfølgende qPCR og genom bred gen expression analyser. Derfor, denne forsøgsplan kan bruges til at pålideligt isolere forskellige typer af CNS celler uden at ændre deres membran integritet og begrænse ændring af deres gen expression profil.
Figur 1 : FACS sortering for neuroner og makrofager/mikroglia fra mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf zebrafisk larver. (A-C) Successive gating viser sekventielle udvalg af alle hjernens celler (A), enkelt celler af forward scatter og side scatter (B). C døde celler blev udelukket af DAPI mærkning. (D) neuroner og makrofager/mikroglia blev identificeret henholdsvis af DsRed og normal god landbrugspraksis positive farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Gen expression analyse for pcna og β-actin i neuroner og makrofager/mikroglia. RNA fra isolerede neuroner og makrofager/mikroglia kan blive transskriberet i cDNA til brug i kvantitativ PCR analyser. mRNA udtryk niveauer af pcna mod β-actin hus-holder gen i isolerede neuroner og makrofager/mikroglia bestemmes af qPCR (N = 3). Fold ændring blev målt ved hjælp af metoden sammenlignende (ΔΔCT). Fejl bar repræsenterer gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : FACS sortering for mikroglia fra 3 dpf zebrafisk larver. (A-C) Successive gating Vis sekventielle udvalg af alle hjernens celler (A), enkelt celler af forward scatter og side scatter (B). C døde celler blev udelukket af DAPI mærkning. (D) mikroglia blev identificeret ved 4 c 4 positive farvning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Micro-kapillær elektroforese resultaterne af ekstraheret RNA fra 5 dpf zebrafisk mikroglia. De to høje toppe er 18S og 28S ribosomale RNA. RNA integritet nummer (RIN) blev automatisk beregnet af bioanalyzer softwaren ved hjælp af genererede forholdet mellem 18S og 28S ribosomale underenheder og analyse af hele elektroforese sporingen. Mikroglia RNA har en RIN 8,6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kvalitet og mængde test af forstærkede cDNA fra RNA stikprøve af 5 dpf zebrafisk mikroglia. Billedet viser cDNA fragment størrelse fordeling af den analyserede prøve med en gennemsnitlig størrelse på 299 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Betingelse | Eksperiment | Fisk antallet | Cell antal | Celle nummer pr. fisk | RNA koncentration (pg/ul) | Total RNA (pg) | RNA beløb pr. celle (pg) | RIN score |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0,13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0,13 | 7,9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0,16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0,20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0,10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0,26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0,13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0,09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74,95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7,9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7.8 |
Tabel 1: Oversigt over mikroglia isolation og RNA udtræk data fra 3, 5 og 7 dpf zebrafisk larver.
| Intern prøve ID | Ekstern prøve ID | Qubit (ng/ul) | Qubit(ng/UL) | Gennemsnitlige koncentration (ng/ul) | Volumen (ul) | ug modtaget | Bestået/ikke bestået for minimum koncentration | Bestået/ikke bestået for minimim antal | Bestået/ikke bestået for anbefalede mængde |
| 10907SD0010 | 5 dpf (eksperiment 4) | 58,8 | 58,4 | 58,6 | 30 | 1,76 | Pass | Pass | Pass |
| Prøven krav til biblioteket Prep: | |||||||||
| Biblioteket Prep | Minimum mængde (ng) | Anbefalede mængde (ng) | Minimum koncentration ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano gel gratis 350 bp Indsæt bibliotek fra cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tabel 2: Antal prøver af forstærkede cDNA fra RNA stikprøve af 5 dpf zebrafisk mikroglia.
Discussion
Forsøgsplan beskrevet her repræsenterer en robust og effektiv metode til at isolere hjerneceller fra zebrafisk larver fra 3 til 8 dpf. Vigtigere, er dette den første protokol, der giver mulighed for specifikke isolering af mikroglia fra larve zebrafisk hjerner. Protokollen er designet til at opretholde celle membran integritet og for at minimere mulige ændringer af genekspression opstår under behandlingen. Dette sidste punkt er afgørende for relevansen af resultater baseret på en analyse af disse isolerede cellulære genomiske profiler. Faktisk mikroglia og makrofag polarisering er stærkt påvirket af deres mikromiljø. Ved 37 ° C, vil disse celler har ændret deres gen expression profil som svar på forsøgsbetingelser (skade (transection) svar). Det var derfor afgørende for at udføre dette eksperiment ved 4 ° C forud for RNA udvinding, at bremse cellulære processer og metaboliske aktiviteter. Desuden blev mekanisk hjernen væv homogenisering ved 4 ° C valgt i stedet for enzymatisk væv fordøjelsen ved 37 ° C til at undgå eventuelle indvirkning på gen expression profiler.
Det er vigtigt at understrege, at denne metode er meget hurtigt; inden for en dag kan flere hjerne cellepopulationer isoleres fra mindst to forskellige eksperimentelle betingelser og deres RNA ekstraheret. Den samlede længde af protokollen afhænger af antallet af larver anvendes for hver betingelse, som transection af larve hoveder er den begrænsende trin (∼ 350 hoveder/h). I almindelighed, for at arbejde med mikroglia fra 3, 5 og 7 dpf anbefales det at Transekttællinger ∼ 600 hoveder pr. test for at få nok RNA til ekstrakt (tabel 1). Som mikroglia repræsenterer celletype med den lavest udbytte (ca. 112 celler pr. indbygger på 7 dpf), antallet af hoveder kan blive reduceret til andre celletyper, herunder makrofager (ca. 170 celler pr. indbygger på 7 dpf).
En anden fordel ved denne protokol er at når indstillinger på FACS Sorteremaskine er fastlagt, de samme indstillinger kan bruges til forskellige eksperimenter. Det er blevet bemærket, at cellepopulationer passer perfekt fra et eksperiment til en anden med gates tidligere designet, viser reproducerbarhed af eksperimenter ved hjælp af denne metode.
En lille ulempe ved denne metode er den forholdsvis lavt antal RNA, der er høstet. Denne begrænsning er imidlertid mere en biologisk problem end et teknisk problem, da antallet af mikroglia er meget lav i tidlige faser af hjernens udvikling (tabel 1). På grund af denne lavt antal RNA indsamlet, forstærkning skridt der skal anses for at udføre analyse af genom bred gen expression. Heldigvis, disse forstærkning trin producere tilstrækkelige mængder af høj kvalitet cDNA. Således, globale ændringer i genet udtrykket profiler af isolerede celler kan studeres.
Til sidst, giver denne protokol en robust metode til at isolere og studere forskellige CNS celletyper fra larve zebrafisk hjerner. Dette kan anvendes for at opnå en dybere forståelse af disse celler under udvikling samt at undersøge deres rolle i sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Claire Davis og Dr. Veronique Miron (The Queen's Medical Research Institute, Edinburgh, United Kingdome) for indledende hjælp og diskussioner på den eksperimentelle tilgang og QMRI Flow flowcytometri og celle sortering facilitet. Dette arbejde blev støttet af en Cancer Research UK karriere etablering Award til Dr. Dirk Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
