Summary
हम शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत लार्वा zebrafish दिमाग से ंयूरॉंस, मैक्रोफेज और microglia को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । अलगाव पर, आरएनए इन कोशिकाओं से निकाला जाता है उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल qPCR और transcriptomics की तरह बहाव विश्लेषण प्रदर्शन के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए के संग्रह के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
विकास या स्थापना और मस्तिष्क विकृतियों की प्रगति के दौरान अलग सीएनएस कोशिकाओं की भूमिका की एक विस्तृत समझ हासिल करने के लिए, यह उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल को बदलने के बिना इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है । zebrafish मॉडल ट्रांसजेनिक मछली लाइनों की एक बड़ी संख्या में विशिष्ट कोशिका प्रकार है लेबल प्रदान करता है; उदाहरण के लिए में न्यूरॉन्स एनबीटी: DsRed लाइन या मैक्रोफेज में microglia/mpeg1: eGFP लाइन । इसके अलावा, एंटीबॉडी ऐसे 4C4 एंटीबॉडी के साथ microglia के रूप में विशिष्ट कोशिकाओं, दाग विकसित किया गया है ।
यहाँ, हम लार्वा zebrafish दिमाग से न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और microglia के अलगाव का वर्णन. इस प्रोटोकॉल के लिए केंद्रीय ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक एंजाइमी ऊतक पाचन के परिहार है, जो सेलुलर प्रोफाइल को संशोधित कर सकता है । इसके बजाय 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक homogenization के एक यांत्रिक प्रणाली का प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल सेल निलंबन में दिमाग के homogenization पर जोर देता है, उनके इंयूनो-धुंधला और FACS द्वारा ंयूरॉंस, मैक्रोफेज और microglia के अलगाव । बाद में, हम उन कोशिकाओं से आरएनए निकाली और उनकी गुणवत्ता का मूल्यांकन/ हम उच्च गुणवत्ता की आरएनए प्राप्त करने में कामयाब (आरएनए अखंडता संख्या (रिण) > 7) मैक्रोफेज पर qPCR प्रदर्शन करने के लिए/microglia और न्यूरॉन्स, और microglia पर transcriptomic विश्लेषण. इस दृष्टिकोण इन कोशिकाओं के एक बेहतर लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है, साथ ही विकास और विकृतियों में उनकी भूमिका के बारे में एक स्पष्ट समझ ।
Introduction
मस्तिष्क के विकास और मस्तिष्क के रोगों पर ज्ञान काफी पिछले दशक में सुधार हुआ है माउस मस्तिष्क transcriptomes के पहले ठहराव के बाद से1। दरअसल, जीनोम व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण हमें मस्तिष्क ऊतक और कोशिकाओं है कि पूरक और अंय तकनीकों और उपकरणों के साथ किया टिप्पणियों में सुधार कर सकते है पर विस्तृत आनुवंशिक जानकारी के लिए पहुंच देता है ।
zebrafish एक शक्तिशाली जैविक मॉडल, नस्ल के लिए आसान है और आनुवंशिक रूप से संशोधित करने के लिए है; लार्वा चरणों में इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता लाइव इमेजिंग प्रेक्षणों2की अनुमति देता है । दुर्भाग्य से, मानव और माउस की तुलना में, उपलब्ध एंटीबॉडी की संख्या इंयूनो प्रदर्शन करने के लिए नहीं बल्कि कम है । यह उपाय करने के लिए, ट्रांसजेनिक zebrafish मछली लाइनों को आसानी से कर रहे है आनुवंशिक रूप से संशोधित मछली कोशिका प्रकार विशिष्ट प्रवर्तकों के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) विकास और रोग3,4,5,6के दौरान मैक्रोफेज और microglia की भूमिका का अध्ययन करने के लिए अतीत में ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं हम संबंधित कोशिका प्रकार में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन को समझने की जरूरत है की एक विस्तृत समझ हासिल करने के लिए । इस उद्देश्य के लिए, हम विशेष रूप से न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और microglia की तरह कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि विकसित करने के लिए 3 से 8 दिनों के बाद निषेचन (dpf) लार्वा zebrafish दिमाग. प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए, हम ट्रांसजेनिक मछली लाइनों के साथ काम किया है कि एक्सप्रेस ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) में मैक्रोफेज/microglia के तहत मैक्रोफेज-व्यक्त जीन प्रवर्तक (mpeg1: eGFP) और DsRed के तहत न्यूरॉन्स में तंत्रिका ß-tubulin प्रवर्तक (एनबीटी: DsRed)7,8,9. इसके अलावा, हम इंयूनो प्रदर्शन microglia के दाग 4C4, एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि विशेष रूप से दाग zebrafish microglia10,11का उपयोग कर । बाद में, ribonucleic एसिड (आरएनए) आगे मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) या transcriptome विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं से निकाला जाता है. इस प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा से कुशलतापूर्वक homogenize मस्तिष्क ऊतक के लिए डिजाइन किया गया है; अपने प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के परिवर्तन के बिना न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज/microglia और microglia लीजिए और अंत में उच्च गुणवत्ता में इन कोशिकाओं से आरएनए निकालने (रिण > 7) और जीनोमिक विश्लेषण करने के लिए मात्रा. के विपरीत पहले प्रकाशित अध्ययनों कि ३७ ° c पर trypsin उपचार का उपयोग मस्तिष्क ऊतक पचाने के लिए12,13, इस प्रोटोकॉल को बढ़ावा देता है 4 ° c पर काम करने के लिए आरएनए निष्कर्षण कदम जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के संशोधनों को कम करने के लिए. इस कदम के रूप में महत्वपूर्ण है microglia और मैक्रोफेज अति संवेदनशील कोशिकाओं जो उनके microenvironment में परिवर्तन का जवाब तुरंत उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और ध्रुवीकरण14,15से बदल कर रहे हैं, 16.
प्रोटोकॉल, विस्तार से यहां वर्णित है, zebrafish लार्वा दिमाग से न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और microglia के अलगाव से पता चलता है, लेकिन वस्तुतः, यह मस्तिष्क के भीतर किसी भी अन्य सेल मौजूद करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता-या तो ट्रांसजेनिक मछली लाइनों का उपयोग करके या के साथ बला विशिष्ट एंटीबॉडी । यह विधि उनके जीनोम वाइड जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के माध्यम से सीएनएस कोशिकाओं के बेहतर लक्षण वर्णन की अनुमति देगा और विकास और मस्तिष्क रोगों के दौरान उनकी भूमिका को समझने में मदद मिलेगी ।
Protocol
1. नमूना और मीडिया की तैयारी
- तैयार भ्रूण माध्यम (E3) को भंग करके ६.४ mm KCl, ०.२२ mm NaCl, ०.३३ mm CaCl2 2H2o, ०.३३ mm MgSO4 7H2हे in H2o.
- निषेचन के तुरंत बाद zebrafish भ्रूण ले लीजिए (0 dpf) ।
- ९० mm पेट्री डिश प्रति ५० में भाजित zebrafish भ्रूण । २८.५ डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण बढ़ा भ्रूण माध्यम के ५० मिलीलीटर (E3) २०० µ एम 1-फिनाइल 2-thiourea (PTU) के साथ इलाज, विकास के पहले दिन के अंत से (0 dpf) प्रयोग की अवधि के लिए रंजकता को बाधित ।
- प्रयोग की अवधि के लिए E3 + PTU मीडियम को रोजाना बदलें ।
- स्क्रीन mpeg1: eGFP और एनबीटी: DsRed लार्वा ऑन 2 dpf पॉजिटिव फ्लोरोसेंट एक्सप्रेशन के लिए एक stereomicroscope transgene का इस्तेमाल करते हुए GFP+ मैक्रोफेज microglia और DsRed+ न्यूरॉन्स ।
- एक टिशू कल्चर हुड के तहत प्रयोग करने से पहले सभी मीडिया दिन तैयार करने के लिए संदूषण से बचने के लिए, तो उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
- HBSS 1x में 15 mm Hepes और 25 mm D-ग्लूकोज को भंग करके मीडिया A तैयार करें ।
- HBSS 10x के 1 मात्रा में घनत्व ढाल माध्यम के 9 संस्करणों को मिलाकर घनत्व ढाल मध्यम (१००%)
- घनत्व ढाल मध्यम (22%) कमजोर द्वारा घनत्व ढाल मध्यम (DPBS 1x के ८८ मिलीलीटर में १००%)
- DPBS 1x तैयार करें ।
- ४५० माइक्रोन Tricaine के साथ e3 मध्यम मिश्रण से e3 मध्यम + Tricaine तैयार करें.
2. Homogenization
नोट: सभी कदम 4 ° c प्रदर्शन कर रहे हैं ।
- १.५ मिलीलीटर Tricaine (15 मिमी) जोड़ने के लिए ९० मिमी पेट्री व्यंजन जिसमें ५० लार्वा से ५० मिलीलीटर के E3 भ्रूण मध्यम इलाज के लिए २०० µ m PTU के साथ टर्मिनली उन्हें anesthetize.
- 3 मिलीलीटर पाश्चर प्लास्टिक बल्क पिपेट के साथ पेट्री डिश से 10 anesthetized लार्वा को चूसो ।
- स्थानांतरण anesthetized लार्वा 10 से 10 में ५५ मिमी पेट्री डिश बर्फ ठंडा E3 भ्रूण मध्यम + Tricaine से भरा ।
- एक stereomicroscope के तहत, पेट्री डिश के केंद्र में 10 लार्वा संरेखित करें । फिर transect लार्वा सिर की जर्दी-थैली सर्जिकल माइक्रो-कैंची का उपयोग कर के ऊपर (तैरना छोड़ने के सिर से बचने के लिए मूत्राशय) ।
- एक 3 मिलीलीटर पाश्चर प्लास्टिक थोक पिपेट के साथ पेट्री व्यंजन से सिर चूसना । रुको जब तक सभी सिर पिपेट टिप के भीतर इकट्ठा और फिर उंहें एक गिलास 1 मिलीलीटर बर्फ युक्त homogenizer में स्थानांतरण-शीत मीडिया एक (एक ंयूनतम मात्रा में स्थानांतरण के लिए E3 + Tricaine द्वारा एक कमजोर पड़ने मीडिया को कम) । गिलास को बर्फ पर homogenizer रखें । प्रायोगिक शर्त के अनुसार एक homogenizer का प्रयोग करें ।
- प्रत्येक छोटे पेट्री बर्फ ठंड e3 युक्त पकवान + Tricaine एक नया एक हर 30 मिनट के साथ विश्वास दिलाता हूं कि transection ठंड E3 + Tricaine माध्यम में किया जाता है ।
- बर्फ की जगह-ठंड मीडिया एक गिलास homogenizer में जब रंग लुप्त होती शुरू होता है ।
नोट: मीडिया एक कमजोर पड़ने के तापमान में परिवर्तन के कारण सिर ऊतक बदल सकते हैं । - एक बार सभी सिर एकत्र किया गया है (६०० सिर/हालत), कांच homogenizer से एक मीडिया की अधिकतम मात्रा को हटाने और यह ताजा बर्फ के 1 मिलीलीटर ठंड मीडिया ए के साथ बदलें ।
- बर्फ पर एक तंग गिलास homogenizer के साथ मस्तिष्क के ऊतकों को बाधित. ४० राउंड का प्रदर्शन करें और 3-5 dpf लार्वा और ५० के लिए 7 और 8 dpf लार्वा के लिए मुड़ें ।
- सेल निलंबन के लिए एक मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें (1 मिलीलीटर मीडिया एक/२०० प्रमुखों), कि कोशिकाओं को पतला और myelin के साथ उनके ढेर कम करने के लिए घनत्व ढाल मध्यम में केंद्रापसारक के दौरान उनकी जुदाई की सुविधा होगी ।
- सेल ढेर को समाप्त करने के लिए, एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन चलाने के लिए एक ठंडा ५० मिलीलीटर बाज़ ट्यूब बर्फ पर बनाए रखा । यह कार्रवाई 3 बार दोहराएं ।
- ठंड १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० जी पर उन्हें स्पिन ।
- एक 10 मिलीलीटर सिरिंज + सुई 23G एक्स 1 ' ' का उपयोग कर supernatant निकालें.
- पुनः निलंबित बर्फ के 1 मिलीलीटर के साथ सेल गोली-ठंड 22% घनत्व ढाल माध्यम धीरे से ०.५ मिलीलीटर बर्फ ठंडा DPBS 1x द्वारा मढ़ा (उंहें मिश्रण नहीं है, दोनों के समाधान के बीच एक दौर देखा जाएगा) ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ब्रेक और धीमी गति के बिना ९५० जी पर स्पिन ट्यूबों ।
नोट: यह कदम अंय कोशिकाओं से myelin अलग DPBS 1x और 22% घनत्व ढाल माध्यम के दौर में sequestering द्वारा, जबकि कोशिकाओं ट्यूब के तल पर गोली होगा । Myelin हटाने अधिक कुशल है जब कोशिका एकाग्रता बहुत अधिक नहीं है । - एक 10 मिलीलीटर सिरिंज + सुई 23G एक्स 1 का उपयोग करना, उनके चरण में फंसे DPBS, घनत्व ढाल मध्यम और myelin की अधिकतम त्यागें ।
- मीडिया के ०.५ मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं सामांय बकरी सीरम (NGS) का एक + 2% है, तो ३०० जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों स्पिन ।
- supernatant की अधिकतम त्यागें, तो एक ही प्रयोगात्मक हालत से सभी सेल छर्रों एक साथ मीडिया के 1 मिलीलीटर में एक + 2% NGS पूल ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ब्रेक और धीमी गति के बिना ९५० जी पर स्पिन ट्यूबों ।
- यदि ब्याज की कोशिकाओं mpeg1 से मैक्रोफेज/microglia की तरह एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस: eGFP या न्यूरॉन्स से एनबीटी: DsRed ट्रांसजेनिक मछली (ट्रांसजेनिक मछली की स्क्रीनिंग 1.1.3 देखें), एक ३५ µm सेल छलनी टोपी के माध्यम से सेल निलंबन चलाने के लिए और उंहें एक में स्थानांतरण ठंड 5 मिलीलीटर बर्फ पर FACS ट्यूबों, प्रकाश से संरक्षित ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, इंयूनो-microglia के दाग प्रदर्शन किया जा सकता है ।
3. Microglia इंयूनो-धुंधलाना
नोट: सभी कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
- पुन: निलंबित मीडिया के ०.३ मिलीलीटर के साथ सेल गोली A + 2% NGS । उन्हें 3 x १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में विभाजित: एक unसना हुआ कोशिकाओं के लिए ब्याज की कोशिकाओं से ऑटो-प्रतिदीप्ति को मापने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए दूसरा (1/200) माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को मापने के लिए microglia और तीसरे के रूप में एक परीक्षण (4C4 माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (microglia विशिष्ट) (1/20) + माध्यमिक एंटीबॉडी (1/200)).
- कम Endotoxin जोड़ें, Azide-मुक्त (पत्ती) पर 1% करने के लिए कोशिकाओं (सभी ट्यूबों) CD16 ब्लॉक करने के लिए/CD32 इम्युनोग्लोबुलिन के एफसी डोमेन के साथ बातचीत । कोमल आंदोलन हर 5 मिनट के साथ 10 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं ।
- कोशिकाओं (ट्यूब 3) के लिए 4C4 एंटीबॉडी (1/20) जोड़ें और कोमल आंदोलन हर 10 मिनट के साथ 30 मिनट के लिए गर्मी ।
- स्पिन ट्यूबों पर ३०० g के लिए 10 मिनट में 4 ° c, फिर supernatant त्यागें ।
- एक बार मीडिया के ०.५ मिलीलीटर एक + 2% NGS के साथ धो, तो ३०० जी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों स्पिन ।
- पुनः निलंबित मीडिया के ०.५ मिलीलीटर के साथ सेल गोली एक + 2% NGS और कोमल आंदोलन हर 5 मिनट के साथ 10 मिनट के लिए 1% से कम पत्ती के साथ कोशिकाओं गर्मी ।
- कक्षों (ट्यूब 2 और 3) के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी (1/200) जोड़ें । कोमल आंदोलन हर 10 मिनट और प्रकाश संरक्षण के साथ 30 मिनट के लिए गर्मी कोशिकाओं ।
- स्पिन ट्यूबों ३०० g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, तो supernatant त्यागें ।
- मीडिया के ०.५ मिलीलीटर एक + 2% NGS के साथ दो बार धो, तो फिर से मीडिया के 1 मिलीलीटर एक + 2% NGS के साथ सेल गोली सस्पेंड ।
- एक ३५ µm सेल छलनी टोपी के माध्यम से सेल निलंबन चलाने के लिए और उंहें ठंड 5 मिलीलीटर FACS ट्यूबों में बर्फ पर स्थानांतरण, प्रकाश से सुरक्षित ।
4. कक्ष छँटाई (FACS)
नोट: 4 ° c पर सभी चरणों का पालन करें ।
- क्रमबद्ध करें न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज/microglia और microglia एक FACS का उपयोग.
नोट: यह चरण आमतौर पर FACS सुविधा और सेटिंग्स के एक स्टाफ सदस्य द्वारा किया जाता है उपकरणों के प्रकार पर निर्भर करते थे ।- मृत कोशिकाओं को लेबल करने के लिए प्रत्येक FACS ट्यूब में 1 µ g/mL की एकाग्रता पर DAPI जोड़ें ।
- सभी मस्तिष्क कोशिकाओं से FACS और क्रमबद्ध न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज/microglia या microglia सेट अप करें. अपने आकार और दानेदार के समारोह में मलबे से अलग कोशिकाओं, तो गेट एकल कोशिकाओं को आगे तितर बितर और साइड स्कैटर द्वारा । जीवित कोशिकाओं से DAPI लेबलिंग द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें । न्यूरॉन्स की पहचान, मैक्रोफेज/microglia या microglia उनके संबंधित सकारात्मक दाग से ।
- १.५ मिलीलीटर ट्यूब बर्फ ठंडा मीडिया के 1 मिलीलीटर युक्त में कोशिकाओं को इकट्ठा एक + 2% बर्फ पर NGS । प्रत्येक कक्ष प्रकार के लिए विभिंन ट्यूबों का उपयोग करें ।
- स्पिन ट्यूबों पर ३०० g के लिए 10 मिनट में 4 ° c और फिर supernatant को त्यागें ।
- एक बार मीडिया के ०.५ मिलीलीटर के साथ धो एक तो supernatant की अधिकतम त्यागें ।
5. आरएनए निष्कर्षण
- FACS द्वारा अलग अलग सेल प्रकार से आरएनए निकालें. आरएनए निष्कर्षण के लिए एक विशिष्ट किट का उपयोग करें और निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करें । एक RNase दूषण उत्पाद और उपयोग फिल्टर सुझावों के साथ कार्यक्षेत्र और पिपेट सफाई से एक RNase मुक्त वातावरण में काम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- हौसले से तैयार lysis बफर के 1 मिलीलीटर ५० µ m β-mercaptoethanol के साथ पूरक ।
नोट: यहां, β-mercaptoethanol आरएनए क्षरण को कम करने के लिए जोड़ा गया है । - RNase मुक्त पानी का उपयोग ७०% और ८०% इथेनॉल समाधान तैयार करें ।
- लाइसे कोशिकाओं के साथ ७५ µ एल के lysis बफर के साथ पूरक ५० µ m β-mercaptoethanol. फिर एक बहुत तकलीफ का उपयोग करने के लिए सेल व्यवधान में सुधार ।
- निर्माता के मैनुअल के अनुसार आरएनए निष्कर्षण जारी रखें ।
- प्रोटोकॉल के अंत में, elute आरएनए को पर्याप्त आरएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए RNase मुक्त जल के 14 µ l के साथ ।
- हौसले से तैयार lysis बफर के 1 मिलीलीटर ५० µ m β-mercaptoethanol के साथ पूरक ।
Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा दिमाग से न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और microglia को अलग करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण है. इन अलग कोशिकाओं से, उच्च गुणवत्ता की महत्वपूर्ण मात्रा (रिण > 7) आरएनए निकाला गया । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सीएनएस से विभिंन प्रकार की कोशिकाओं को अलग करना है, उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के ंयूनतम संशोधन के साथ विश्लेषण और सेल गुण और कार्यों की विशेषताएं । इसलिए, पूरे प्रोटोकॉल एक यांत्रिक मस्तिष्क ऊतक homogenization के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है । यह पद्धति सफलतापूर्वक प्रयोगशाला में किए गए दो अध्ययनों के लिए उपयोग की गई है । पहले अध्ययन में न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज/microglia से अलग किए गए 8 dpf mpeg1: eGFP+/NBT: DsRed+ लार्वा (figure 1). FACS उनके आकार के समारोह में मलबे से सेल जुदाई की अनुमति दी (FSC-a) और दानेदार (एसएससी-ए) (चित्रा 1ए) । एकल कक्ष तब दोहरी या कक्ष agglomerates (आरेख 1B) से पृथक किए गए थे । एकल कोशिका जनसंख्या से, एक गेट मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए तैयार किया गया था (DAPI+). इसी डॉट साजिश से पता चला है कि इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल सेल प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को बरकरार रखता है, मृत कोशिकाओं की दर के रूप में केवल २६.७% (चित्रा 1सी) है । अंत में, ंयूरॉंस (DsRed+) और मैक्रोफेज/microglia (GFP+) आसानी से रहते सेल जनसंख्या गेट्स से अलग थे । ंयूरॉन जनसंख्या (२३.१%) मैक्रोफेज/microglia जनसंख्या (मस्तिष्क के भीतर १.५६%) (चित्रा 1डी) से अधिक प्रमुख होना दिखाई दिया । इस प्रोटोकॉल के बाद qPCR विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए उन कोशिकाओं से आरएनए अलग करने की अनुमति दी है न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज के बीच विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए/microglia. चित्रा 2 एक उदाहरण के रूप में β-actin घर रखने जीन के खिलाफ proliferating सेल परमाणु प्रतिजन (pcna)के न्यूरॉन और मैक्रोफेज/microglia जीन अभिव्यक्ति स्तर से पता चलता है.
दूसरे अध्ययन के लिए इस विधि 3, 5 और 7 dpf लार्वा दिमाग से microglia अलगाव पर ध्यान केंद्रित किया । ऊपर वर्णित प्रयोग के विपरीत, कोशिकाओं इंयूनो-धुंधला 4C4, एक एंटीबॉडी जो विशेष रूप से लेबल microglia (चित्रा 3 ए-डी) का उपयोग करके अलग थे । जैसा कि पहले बताया गया है, microglia (4C4+) लाइव कोशिकाओं और एकत्र (चित्रा 3डी) से चुना गया था । zebrafish लार्वा दिमाग के भीतर Microglia संख्या चर रहे है (तालिका 1), और बहुत कम 3 dpf में (∼ 25 प्रति मछली) । गुणवत्ता और उन कोशिकाओं से निकाली आरएनए की मात्रा एक माइक्रो केशिका ट्रो आधारित प्रणाली का उपयोग कर मापा गया । 5 dpf लार्वा zebrafish दिमाग के microglia से निकाली आरएनए के परिणाम प्राप्त आरएनए विश्लेषण (तालिका 1 (5 dpf; प्रयोग 4)) का एक उदाहरण वर्णन करने के लिए प्रदान किया गया है. चित्रा 4 राइबोसोमल आरएनए (28s और 18s) के एक स्पष्ट दृश्य के साथ इस नमूने के लिए प्राप्त ट्रो ट्रेस और इसके ग्राफिक प्रतिनिधित्व से पता चलता है. इस डेटा नमूना रिण की गणना करने के लिए और आरएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. तालिका 1 प्रति मछली पृथक microglia की संख्या, microglia प्रति आरएनए की मात्रा और 3, 5 और 7 dpf पर प्रत्येक अलग प्रयोग के लिए प्राप्त रिण स्कोर को संक्षेप में प्रस्तुत करता है । इस विधि का उपयोग कर पृथक microglia से निकाली आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता हमें एक किट का उपयोग कर सीडीएनए में आरएनए बढ़ाना करने की अनुमति दी । गुणवत्ता और मात्रा परीक्षण एडिनबर्ग जीनोमिक्स द्वारा प्रदान की पुष्टि करें कि प्रवर्धित सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी और अनुवर्ती अनुक्रमण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की है । चित्रा 5 सीडीएनए टुकड़े और उनकी राशि का आकार वितरण से पता चलता है एक electrophoretic प्रणाली का उपयोग कर मापा । इस नमूने में, सीडीएनए ३६१०० pmol/l की एकाग्रता पर 299bp का एक मतलब आकार था तालिका 2 क्रमशः आरएनए नमूनों (तालिका 1 (5 dpf; प्रयोग 4)) से प्रवर्धित सीडीएनए पर किए गए गुणवत्ता और मात्रा परीक्षणों को दर्शाता है. परिवर्धित सीडीएनए सफलतापूर्वक sequencing के लिए उपयोग किया गया है ।
कई प्रयोगशाला में प्रदर्शन अध्ययनों की पुष्टि की है कि गुणवत्ता और न्यूरॉन्स, मैक्रोफेज और microglia से निकाली आरएनए की मात्रा बाद में qPCR और जीनोम व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल मज़बूती से उनकी झिल्ली अखंडता फेरबदल और उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के संशोधन सीमित बिना सीएनएस कोशिकाओं के विभिंन प्रकारों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र 1 : FACS ंयूरॉंस के लिए छंटाई और मैक्रोफेज/microglia से mpeg1: GFP+/NBT: DsRed+ 8 dpf zebrafish लार्वा । (A-C) क्रमिक गेटिंग सभी मस्तिष्क कोशिकाओं (ए), आगे तितर बितर और साइड स्कैटर द्वारा एकल कोशिकाओं के अनुक्रमिक चयन दिखाता है (ख) । (ग) मृत कोशिकाओं को DAPI ्र से बाहर रखा गया । (घ) न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज/microglia क्रमशः DsRed और GFP सकारात्मक दाग की पहचान की गई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए pcna और β-actin में न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज/microglia. पृथक न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज/microglia से आरएनए मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण में उपयोग के लिए सीडीएनए में लिखित किया जा सकता है । mRNA अभिव्यक्ति स्तर के विरुद्ध pcna β-actin हाउस-रखने जीन अलग न्यूरॉन्स और मैक्रोफेज/microglia द्वारा निर्धारित qPCR (N = 3). गुना परिवर्तन तुलनात्मक (ΔΔCT) विधि का उपयोग कर मापा गया था । त्रुटि पट्टी का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 3 : 3 dpf zebrafish लार्वा से microglia के लिए छंटाई FACS । (A-C) क्रमिक गेटिंग सभी मस्तिष्क कोशिकाओं (ए), आगे तितर बितर और साइड स्कैटर द्वारा एकल कोशिकाओं (बी) के अनुक्रमिक चयन दिखा । (ग) मृत कोशिकाओं को DAPI ्र से बाहर रखा गया । (घ) Microglia 4C4 सकारात्मक दाग की पहचान की गई. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : सूक्ष्म केशिका ट्रो से निकाली आरएनए के परिणाम 5 dpf zebrafish microglia. दो लंबी चोटियों 18S और 28S राइबोसोमल आरएनए हैं । आरएनए अखंडता संख्या (रिण) स्वचालित रूप से 18S और 28S राइबोसोमल उपइकाईयों और पूरे electrophoretic ट्रेस के विश्लेषण के उत्पन्न अनुपात का उपयोग कर के द्वारा गणना की गई थी । Microglia आरएनए एक रिण ८.६ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 5 : 5 dpf zebrafish microglia के आरएनए नमूना से प्रवर्धित सीडीएनए की गुणवत्ता और मात्रा परीक्षण. छवि २९९ bp का एक मतलब आकार के साथ विश्लेषण नमूना के सीडीएनए टुकड़ा आकार वितरण से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| हालत | प्रयोग | मछली संख्या | कक्ष संख्या | मछली प्रति सेल संख्या | आरएनए एकाग्रता (पीजी उल/ | कुल आरएनए (स्नातकोत्तर) | आरएनए राशि प्रति सेल (pg) | रिण स्कोर |
| 3dpf | 1 | ७०० | ११९२२ | १७.०३ | १२६ | १५१२ | ०.१३ | 8 |
| 3dpf | 2 | ६०० | २२५२७ | ३७.५५ | २५३ | ३०३६ | ०.१३ | ७.९ |
| 3dpf | 3 | ६०० | १८६८८ | ३१.१५ | २५५ | ३०६० | ०.१६ | ७.७ |
| 3dpf | 4 | ६०० | १११२१ | १८.५४ | १८९ | २२६८ | ०.२० | ७.८ |
| 3dpf | 5 | ६०० | १५५८१ | २५.९७ | १३१ | १५७२ | ०.१० | ८.४ |
| 3dpf | 6 | ६०० | ११९६५ | १९.९४ | २५६ | ३०७२ | ०.२६ | ८.२ |
| 5dpf | 1 | ६०० | ५८६२९ | ९७.७२ | ३६२ | ४३४४ | ०.०७ | ७.४ |
| 5dpf | 2 | ६०० | ३२५१० | ५४.१८ | ३४८ | ४१७६ | ०.१३ | ८.१ |
| 5dpf | 3 | ६०० | ७७८८४ | १२९.८१ | ५९४ | ७१२८ | ०.०९ | ८.३ |
| 5dpf | 4 | ६०० | ५०७५५ | ८४.५९ | ३०५ | ३६६० | ०.०७ | ८.६ |
| 5dpf | 5 | ६०० | ४४९६७ | ७४.९५ | १३४ | १६०८ | ०.०४ | ७.६ |
| 5dpf | 6 | ६०० | ५१०३१ | ८५.०५ | १६३ | १९५६ | ०.०४ | ७.९ |
| 7dpf | 1 | ६०० | ६०४९६ | १००.८३ | १८३ | २१९६ | ०.०४ | ७.६ |
| 7dpf | 2 | ४५० | ५५५१७ | १२३.३७ | १८३ | २१९६ | ०.०४ | ७.८ |
| 7dpf | 3 | ६०० | ८८८९७ | १४८.१६ | ४६५ | ५५८० | ०.०६ | ८.१ |
| 7dpf | 4 | ६०० | ६३००८ | १०५.०१ | ३५६ | ४२७२ | ०.०७ | ८.४ |
| 7dpf | 5 | ३५० | ३४९५६ | ९९.८७ | २४५ | २९४० | ०.०८ | ८.१ |
| 7dpf | 6 | ६०० | ६३८८७ | १०६.४८ | ३४१ | ४०९२ | ०.०६ | ७.८ |
तालिका 1:3, 5 और 7 dpf zebrafish लार्वा से microglia अलगाव और आरएनए निष्कर्षण डेटा का सारांश ।
| आंतरिक नमूना ID | बाहरी नमूना ID | Qubit (एनजी उल/ | Qubit (एनजी उल/ | औसत एकाग्रता (एनजी उल/ | खंड (ul) | यूजी की मिली | न्यूनतम एकाग्रता के लिए पास/ | minimim मात्रा के लिए पास/ | अनुशंसित मात्रा के लिए पास/विफल |
| 10907SD0010 | ५ dpf (प्रयोग ४) | ५८.८ | ५८.४ | ५८.६ | 30 | १.७६ | पास | पास | पास |
| पुस्तकालय तैयारी के लिए नमूना आवश्यकताओं: | |||||||||
| पुस्तकालय तैयारी | न्यूनतम मात्रा (एनजी) | अनुशंसित मात्रा (एनजी) | न्यूनतम एकाग्रता एनजी/ | ||||||
| TruSeq नैनो जेल नि: शुल्क ३५० सीडीएनए से बीपी डालने लाइब्रेरी | ६०० | ११०० | 10 | ||||||
तालिका 2:5 dpf zebrafish microglia की आरएनए नमूना से प्रवर्धित सीडीएनए की मात्रा परीक्षण.
Discussion
यहां वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल zebrafish लार्वा से मस्तिष्क की कोशिकाओं को 3 से 8 dpf को अलग करने के लिए एक मजबूत और कुशल पद्धति का प्रतिनिधित्व करता है । महत्वपूर्ण बात, यह पहला प्रोटोकॉल है कि लार्वा zebrafish दिमाग से microglia के विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है । प्रोटोकॉल कोशिका झिल्ली अखंडता को बनाए रखने के लिए और प्रसंस्करण के दौरान होने वाली जीन अभिव्यक्ति के संभावित संशोधनों को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । यह अंतिम बात उन अलग सेलुलर जीनोमिक प्रोफाइल के विश्लेषण के आधार पर परिणामों की प्रासंगिकता के लिए महत्वपूर्ण है । दरअसल, microglia और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण दृढ़ता से उनके microenvironment से प्रभावित हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर, इन कोशिकाओं प्रयोगात्मक शर्तों (चोट (transection) प्रतिक्रिया) के जवाब में अपने जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल बदल गया होता । इसलिए, यह प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण था 4 ° c आरएनए निष्कर्षण करने से पहले, सेलुलर प्रक्रियाओं और चयापचय गतिविधियों को धीमा करने के लिए. इसके अलावा, 4 डिग्री सेल्सियस पर यांत्रिक मस्तिष्क ऊतक homogenization ३७ डिग्री सेल्सियस पर एंजाइमी ऊतक पाचन के बजाय चुना गया था जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल पर कोई प्रभाव से बचने के लिए ।
यह उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस विधि बहुत जल्दी है; एक दिन के भीतर कई मस्तिष्क कोशिका आबादी से पृथक किया जा सकता है कम से कम दो अलग प्रयोगात्मक स्थितियों और उनकी आरएनए निकाला । प्रोटोकॉल की कुल लंबाई हर हालत के लिए इस्तेमाल किया लार्वा की संख्या पर निर्भर करता है के रूप में लार्वा प्रमुखों के transection सीमित कदम है (∼ ३५० प्रमुखों/एच) । सामांय में, 3, 5 और 7 dpf से microglia के साथ काम करने के लिए यह परीक्षण के लिए transect ∼ ६०० सिर करने के लिए पर्याप्त आरएनए निकालने (तालिका 1) प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है. के रूप में microglia कम उपज (7 dpf पर प्रति सिर लगभग ११२ कोशिकाओं) के साथ सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रमुखों की संख्या मैक्रोफेज सहित अंय प्रकार के सेल के लिए कम किया जा सकता है (लगभग १७० प्रति सिर कोशिकाओं पर 7 dpf) ।
इस प्रोटोकॉल का एक अंय लाभ यह है कि एक बार FACS सॉर्टर पर सेटिंग्स स्थापित किया गया है, एक ही सेटिंग्स विभिंन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह देखा गया है कि कोशिका आबादी पूरी तरह से एक प्रयोग से दूसरे में फिट फाटकों के साथ पहले से डिजाइन, इस विधि का उपयोग कर प्रयोगों के reproducibility दिखा ।
इस विधि का एक मामूली नुकसान आरएनए कि काटा जाता है की अपेक्षाकृत कम राशि है । हालांकि, इस सीमा और अधिक एक तकनीकी मुद्दे से एक जैविक मुद्दा है, के रूप में microglia की संख्या मस्तिष्क विकास (1 तालिका) के प्रारंभिक दौर में बहुत कम है । क्योंकि आरएनए के इस कम मात्रा एकत्र की, प्रवर्धन कदम जीनोम व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । सौभाग्य से, इन प्रवर्धन कदम उच्च गुणवत्ता सीडीएनए की पर्याप्त मात्रा में उत्पादन । इस प्रकार पृथक कोशिकाओं के जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल में वैश्विक बदलावों का अध्ययन किया जा सकता है.
अंत में, इस प्रोटोकॉल लार्वा zebrafish दिमाग से विभिन्न सीएनएस सेल प्रकार को अलग करने और अध्ययन करने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है । यह विकास के दौरान इन कोशिकाओं की गहरी समझ हासिल करने के साथ ही रोग में अपनी भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
प्रयोगात्मक दृष्टिकोण और QMRI प्रवाह Cytometry और सेल छँटाई सुविधा पर प्रारंभिक मदद और विचार विमर्श के लिए हम डॉ क्लेयर डेविस और dr. Veronique माइरोन (महारानी के चिकित्सा अनुसंधान संस्थान, एडिनबर्ग, यूनाइटेड किंगडम) का शुक्र है । यह काम डॉ. कटारा Sieger को कैंसर रिसर्च यूके करियर स्थापना पुरस्कार से समर्थन मिला ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
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