Summary
Vi presenterer en protokoll for å isolere nerveceller, makrofager og microglia fra larver sebrafisk hjerner under fysiologiske og patologiske forhold. På isolasjon, er RNA Hentet fra disse cellene til å analysere gene expression profilen. Denne protokollen gir for innsamling av høy kvalitet RNA nedstrøms analyse som qPCR og transcriptomics.
Abstract
For å få en detaljert forståelse av rollen annerledes CNS celler under utvikling eller etablering og progresjon av hjernen patologi, er det viktig å isolere disse cellene uten å endre deres gene expression profil. Sebrafisk-modellen gir et stort antall transgene fisk linjer som merkes spesifikke celletyper; for eksempel nerveceller i NBT:DsRed linjen eller makrofager/microglia i mpeg1:eGFP-linjen. Videre antistoffer er utviklet til stain bestemte celler, for eksempel microglia med 4C 4 antistoff.
Her beskriver vi isolering av neurons, makrofager og microglia fra larver sebrafisk hjerner. Sentralt i denne protokollen er unngå en enzymatisk vev fordøyelsen ved 37 ° C, som kunne endre mobilnettet profiler. I stedet brukes et mekanisk system av vev homogenisering på 4 ° C. Denne protokollen innebærer homogenisering av hjernen i cellen suspensjon, deres immun flekker og isolasjon av neurons, makrofager og microglia av FACS. Etterpå vi RNA utvunnet av disse cellene og evalueres kvalitet/kvantitet. Vi klarte å få RNA av høy kvalitet (RNA integritet nummer (RIN) > 7) til å utføre qPCR på makrofager/microglia og neurons, og transcriptomic analyse av microglia. Dette gir bedre karakteristikk av disse cellene, i tillegg til en klarere forståelse om deres rolle i utvikling og patologi.
Introduction
Kunnskap om hjernens utvikling og brain sykdommer har forbedret det siste tiåret siden den første kvantifiseringen av musen hjernen transcriptomes1. Faktisk gir genomet bredt gene expression analyse oss tilgang til genetisk informasjon om hjernevev og celler som kan utfylle og forbedre observasjoner gjort med andre teknikker og verktøy.
Sebrafisk er en potent biologiske modell, lett å avle og endre genetisk; dens optisk gjennomsiktighet på larver stadier kan live bildebehandling observasjoner2. Dessverre, i forhold til menneskelig og musen, antall tilgjengelige antistoffer utføre immuno-flekk er ganske lav. For å bøte på dette er transgene sebrafisk fisk linjer lett laget av genetisk modifisere fisk å uttrykke fluorescerende proteiner under celle type bestemt arrangører. Transgene sebrafisk linjer har blitt brukt i siste for å studere rollen til makrofager og microglia under sentralnervesystemet (CNS) utvikling og sykdom3,4,5,6. Vi må imidlertid forstå endringer i byggkorn under de respektive celletyper for å få en detaljert forståelse av disse prosessene. Til dette målet, vi utviklet en eksperimentell metode for å isolere spesielt celler som nerveceller, makrofager og microglia fra 3 til 8 dager etter befruktning (dpf) larver sebrafisk hjerner. For etableringen av protokollen jobbet vi med transgene fisk linjer som uttrykker grønne fluorescerende protein (GFP) i makrofager/microglia under macrophage-uttrykt genet promoter (mpeg1:eGFP) og DsRed i neurons under den nevrale ß-tubulin selskapet (NBT:DsRed)7,8,9. Videre utført vi immuno-farging av microglia med 4C 4, en mus monoklonalt antistoff som spesifikt flekker sebrafisk microglia10,11. Etterpå, ribonukleinsyre (RNA) er Hentet fra disse cellene for videre kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller transcriptome analyser. Denne protokollen er designet for å effektivt homogenize hjernevevet fra sebrafisk Larvene; samle nerveceller, makrofager/microglia og microglia uten endring av deres plasma membranen integritet og endelig ekstra RNA fra disse cellene i høy kvalitet (RIN > 7) og utføre genomisk analyse. I motsetning til tidligere publiserte undersøkelser som bruker trypsin behandling på 37 ° C for å fordøye hjernen vev12,13, fremmer denne protokollen arbeid på 4 ° C til RNA utvinning skritt for å redusere modifikasjoner av gene expression profilen. Dette trinnet er avgjørende som microglia og makrofager er svært følsom celler som reagere på endringer i deres microenvironment umiddelbart ved å endre deres gene expression profil og polarisering14,15, 16.
Protokollen, beskrevet her i detalj, viser isolering av neurons, makrofager og microglia fra sebrafisk larver hjernen, men nesten, det kan tilpasses til en annen celle stede i hjernen - enten ved hjelp av transgene fisk linjer eller merket med spesifikke antistoffer. Denne metoden vil tillate bedre karakteristikk av CNS cellene til sine genom bredt gene expression analyser og vil bidra til å forstå deres rolle under utvikling og brain sykdommer.
Protocol
1. sample og Media
- Klargjør embryoet medium (E3) ved oppløsning 6,4 mM KCl 0.22 mM NaCl 0,33 mM CaCl2 2t2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O i H2O.
- Samle sebrafisk embryo umiddelbart etter befruktning (0 dpf).
- Delt sebrafisk embryo i 50 per 90 mm Petriskål. Øke embryoer på 28,5 ° C i 50 mL av embryoet medium (E3) behandlet med 200 µM 1-fenyl 2-thiourea (PTU), fra slutten av den første dagen i utvikling (0 dpf) for varigheten av forsøket å hemme pigmentering.
- Endre E3 + PTU medium daglig for varigheten av eksperimentet.
- Skjermen mpeg1:eGFP og NBT:DsRed larver på 2 dpf med et fluorescerende stereomicroscope for positiv transgene uttrykk, GFP+ makrofager/microglia og DsRed+ Neurons.
- Forberede alle media dagen før eksperimentet under vev kultur hette å unngå forurensning, og deretter lagre dem på 4 ° C.
- Forberede medier A ved å løse opp 15 mM Hepes og 25 mM D-glukose i HBSS 1 x.
- Forberede tetthet gradert medium (100%) ved å blande 9 volumer av tetthet gradert medium i 1 volum av HBSS 10 x.
- Klargjør tetthet gradert mediet (22%) ved å fortynne 22 mL av tetthet gradert medium (100%) i 88 mL DPBS 1 x.
- Forberede DPBS 1 x.
- Forberede E3 medium + Tricaine ved å blande E3 medium med 450 μM Tricaine.
2. homogenisering
Merk: Alle trinnene er utført 4 ° C.
- Legge til 1,5 mL Tricaine (15 mM) til 90 mm Petri retter som inneholder 50 larver i 50 mL av E3 embryoet medium behandlet med 200 µM PTU til terminalt bedøve dem.
- Suge opp 10 bedøvet larver fra petri retter med en 3 mL Pasteur plast bulk pipette.
- Overføre anesthetized Larvene 10 av 10 i en 55 mm Petriskål fylt med iskald E3 embryoet medium + Tricaine.
- Under en stereomicroscope, kan du justere 10 Larvene midt i Petriskål. Deretter mudderbunn larver hodet over plommesekken med kirurgisk mikro-saks (unnta svømmeblæren for å unngå flytende hoder).
- Suge opp hoder petri retter med en 3 mL Pasteur plast bulk pipette. Vent til alle hoder samle innen pipette spissen og deretter overføre dem i et glass homogenizer som inneholder 1 mL iskald Media A (transfer i en minimal volum å redusere Media en fortynning av E3 + Tricaine). Holde glass homogenizer på is. Bruke en homogenizer per eksperimentelle betingelse.
- Erstatte hver liten Petriskål inneholder isen kalde E3 + Tricaine med en ny enhver 30 min å sikre at transection er utført i kalde E3 + Tricaine medium.
- Erstatte iskald Media A i glass homogenizer når fargen starter falming.
Merk: Media A fortynning kan endre hodet vev på grunn av temperaturendringer. - Når alle hoder er samlet (600 hoder/tilstand), fjerne det maksimale volumet av Media fra glass homogenizer og erstatte den med 1 mL av fersk iskald Media A.
- Forstyrre hjernevev med en tett glass homogenizer på is. Utføre 40 runder med knusing og svinger for 3-5 dpf larver og 50 for 7 og 8 dpf larver.
- Legge til 2 mL av Media til celle suspensjon (1 mL Media A / 200 hoder), som vil utvanne celler og redusere deres agglomeration med myelin å lette deres atskillelse under sentrifugering tetthet gradert medium.
- For å eliminere celle agglomeration, kjøre celle suspensjon gjennom en 40 µm celle sil plasseres over en kald 50 mL falcon rør på isen. Gjenta denne operasjonen 3 ganger.
- Overføre 1 mL av cellen suspensjon i kalde 1,5 mL rør og spinne dem 300 g i 10 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting bruker en 10-mL sprøyte + p 23G x 1''.
- Nytt suspendere celle pellets med 1 mL av iskalde 22% tetthet gradert medium forsiktig kledde av 0,5 mL av iskalde DPBS 1 x (gjør ikke blande dem, en interphase mellom begge løsninger vil bli sett).
- Spin rør på 950 g uten brems og langsom akselerasjon for 30 min på 4 ° C.
Merk: Dette trinnet skiller myelin fra andre celler ved fått det på interphase av DPBS 1 x og 22% tetthet gradert medium, mens celler vil pellets nederst på røret. Myelin fjerning er mer effektive når cellen konsentrasjon ikke er for høyt. - Bruker en 10 mL sprøyte + p 23G x 1'' Forkast maksimal DPBS, tetthet gradert medium og myelin fanget på deres interphase.
- Vask celler med 0,5 mL av Media + 2% av normal geit serum (NGS), deretter spinne rør på 300 g i 10 min på 4 ° C.
- Forkaste maksimalt antall nedbryting, så samle alle cellen pellets fra den samme eksperimentelle forhold sammen i 1 mL av Media A + 2% NGS.
- Spin rør på 950 g uten brems og langsom akselerasjon for 30 min på 4 ° C.
- Hvis cellene rundt uttrykke et fluorescerende protein som makrofager/microglia fra mpeg1:eGFP eller neurons fra NBT:DsRed transgene fisk (screening av transgene fisk se 1.1.3), kjøre celle suspensjon gjennom en 35 µm celle sil cap og overføre dem til en kalde 5 mL FACS rør på is, beskyttet mot lyset.
Merk: Alternativt kan immuno-farging av microglia utføres.
3. Microglia Immuno-flekk
Merk: Alle trinnene utføres på 4 ° C.
- Nytt suspendere celle pellets med 0,3 mL Media A + 2% NGS. Dele dem i 3 x 1,5 mL rør: en for unstained kvinne celler å måle auto-fluorescens fra celler av interesse, andre sekundære antistoffer (1/200) å måle uspesifisert binding av sekundær antistoffer til microglia og tredje som en test (4C 4 mus monoklonalt antistoff (microglia bestemt) (1/20) + sekundær antistoff (1/200)).
- Legge til lav Endotoxin, Azide-fri (blad) på 1% til celler (alle rør) til å blokkere CD16/CD32 vekselsvirkningene med Fc domenet av immunglobuliner. Inkuber celler for 10 min med mild agitasjon hver 5 min.
- Legge til 4C 4 antistoff (1/20) celler (rør 3) og Inkuber i 30 min med mild agitasjon hvert 10 min.
- Spin rør på 300 g i 10 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
- Vask når med 0,5 mL av Media + 2% NGS, store rør på 300 g i 10 min på 4 ° C.
- Nytt suspendere celle pellets med 0,5 ml Media A + 2% NGS og Inkuber celler med blad på 1% for 10 min med mild agitasjon hver 5 min.
- Legge til sekundære antistoff (1/200) celler (rør 2 og 3). Inkuber celler for 30 min med mild agitasjon hver 10 min og lett beskyttelse.
- Spin rør på 300 g i 10 min på 4 ° C, og forkaste nedbryting.
- Vask to ganger med 0,5 mL Media A + 2% NGS, så å suspendere celle pellets med 1 mL av Media A + 2% NGS.
- Kjøre celle suspensjon gjennom en 35 µm celle sil cap og overføre dem i kaldt 5 mL FACS rør på is, beskyttet mot lyset.
4. celle sortering (FACS)
Merk: Alle trinnene på 4 ° C.
- Sortere neurons, makrofager/microglia og microglia bruker en FACS.
Merk: Dette trinnet utføres vanligvis av en medarbeider av FACS og innstillinger avhenger av utstyret som brukes.- Legge til DAPI i en konsentrasjon av 1 µg/mL i hver FACS tube å merke døde celler.
- Definer FACS og sortere nerveceller, makrofager/microglia eller microglia fra alle hjerneceller. Skille celler fra rusk i funksjonen for deres størrelse og detaljnivå, så gate single-celler av fremover scatter og siden scatter. Utelate døde celler ved DAPI merking fra levende celler. Identifisere nerveceller, makrofager/microglia eller microglia ved deres respektive positiv flekker.
- Samle celler i 1,5 mL rør som inneholder 1 mL av iskalde Media A + 2% NGS på is. Bruk forskjellige rør for hver celle.
- Spinn rør på 300 g i 10 min på 4 ° C, og deretter kaste nedbryting.
- Vask når med 0,5 mL Media A da forkaste maksimalt antall nedbryting.
5. RNA utvinning
- Pakk ut RNA fra de forskjellige celletyper atskilt med FACS. For RNA utvinning bruker en bestemt kit og følger produsentens retningslinjene. Sørg for å arbeide i et RNase miljø ved rengjøring arbeidsområde og Pipetter med et RNase dekontaminering produkt og bruke filter tips.
- Fersk forberede 1 mL av lyseringsbuffer supplert med 50 µM β-mercaptoethanol.
Merk: Her legges β-mercaptoethanol for å redusere RNA degradering. - Forberede 70% og 80% etanol løsning ved hjelp av RNase gratis.
- Lyse celler med 75 µL av lyseringsbuffer supplert med 50 µM β-mercaptoethanol. Bruk en makuleringsmaskin for å forbedre celle avbrudd.
- Fortsette RNA utvinning ifølge produsenten brukerhåndboken.
- På slutten av protokollen, elute RNA med 14 µL RNase gratis vann for å få en tilstrekkelig RNA konsentrasjon.
- Fersk forberede 1 mL av lyseringsbuffer supplert med 50 µM β-mercaptoethanol.
Representative Results
Beskrevet protokollen er en enkel tilnærming til isolere nerveceller, makrofager og microglia fra sebrafisk larver hjerner. Fra disse isolerte celler, betydelige mengder av høy kvalitet (RIN > 7) RNA ble pakket ut. Målet med denne protokollen er å isolere forskjellige typer celler fra CNS med minimal modifisering av gene expression profilen å analysere og karakterisere egenskaper og funksjoner. Derfor utføres hele protokollen på 4 ° C med en mekanisk hjernen vev homogenisering. Denne metoden har blitt brukt for to studier utført i laboratoriet. I den første studien ble nerveceller og makrofager/microglia isolert fra 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larver (figur 1). FACS tillatt celle separasjon fra rusk i funksjon av sin størrelse (FSC-A) og tetthet (SSC-A) (figur 1A). Enkeltceller ble deretter skilt fra doublets eller celle agglomerates (figur 1B). Fra enkelt celle befolkningen, ble en gate trukket for å fjerne døde celler (DAPI+). Tilsvarende dot tomten avdekket at denne eksperimentelle protokollen beholder celle plasma membranen integritet, som døde celler er bare 26,7% (figur 1C). Endelig var neurons (DsRed+) og makrofager/microglia (GFP+) lett segregert fra levende celle befolkningen portene. Nevron befolkningen (23,1%) syntes å være mer fremtredende enn makrofager/microglia befolkningen (1.56%) i hjernen (figur 1D). Denne protokollen har lov til å isolere RNA fra disse cellene for å utføre påfølgende qPCR analyser for å sammenligne uttrykk for bestemte gener mellom nerveceller og makrofager/microglia. Figur 2 viser neuronal og makrofager/microglia gene expression nivåer av voksende celle kjernefysiske antigen (pcna)mot β-utgangen rengjøring genet som et eksempel.
For andre studier denne metoden fokusert på microglia isolasjon fra 3, 5 og 7 dpf larver hjerner. I motsetning til eksperimentet beskrevet ovenfor celler ble isolert av immuno flekker bruker 4C 4, et antistoff som spesifikt etiketter microglia (Figur 3 A-D). Som tidligere beskrevet, microglia (4C 4+) ble valgt fra levende celler og samlet (Figur 3D). Microglia tall innenfor sebrafisk larver hjerner er variable (tabell 1), og svært lav på 3 dpf (∼ 25 per fisk). Kvalitet og kvantitet av utdraget fra cellene ble målt med en mikro-kapillære geleelektroforese basert system. Resultatene av utdraget fra microglia 5 dpf larver sebrafisk hjerner har blitt gitt til illustrerer et eksempel RNA analyse (tabell 1 (5 dpf; eksperiment 4)). Figur 4 viser geleelektroforese spor og dens grafisk fremstilling innhentet for dette eksemplet med en tydelig visualisering av ribosomal RNA (28s og 18s). Disse dataene er nødvendig til å beregne utvalg RIN og bestemme RNA konsentrasjon. Tabell 1 summerer antall isolerte microglia per fisk, mengden RNA per microglia og RIN poengsummen oppnådd for hvert annet eksperiment på 3, 5 og 7 dpf. Mengden og kvaliteten på utdraget RNA fra isolert microglia benytter denne metoden tillot oss å forsterke RNA i cDNA bruker en kit. Kvalitet og kvantitet tester av Edinburgh Genomics bekrefte at den forsterkede cDNA er av tilstrekkelig kvalitet for biblioteket forberedelse og påfølgende sekvensering. Figur 5 viser størrelsesDistribusjon av cDNA fragmenter og deres mengde målt ved hjelp av en electrophoretic system. I dette eksemplet, cDNA hadde en gjennomsnittlig størrelse på 299bp i en konsentrasjon av 36100 pmol/l. tabell 2 viser henholdsvis kvalitet og kvantitet tester gjort på forsterket cDNA fra RNA prøver (tabell 1 (5 dpf; eksperiment 4)). Den forsterkede cDNA har vært brukt med hell i sekvensering.
Flere studier utført i laboratoriet bekreftet at kvaliteten og kvantiteten av utdraget fra nerveceller, makrofager og microglia kan brukes for etterfølgende qPCR og genom bredt gene expression analyser. Derfor kan denne eksperimentelle protokollen brukes trygt isolere typer CNS celler uten å endre deres membran integritet og begrense endringen av gene expression profilen.
Figur 1 : FACS sortering for neurons og makrofager/microglia fra mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf sebrafisk larver. (A-C) Påfølgende gating viser sekvensiell utvalg av alle hjernen cellene (A), enkeltceller frem scatter og siden punktdiagram (B). (C) døde celler ble utelukket av DAPI merking. (D) neurons og makrofager/microglia ble identifisert henholdsvis av DsRed og GFP positive flekker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Gene expression analyse for pcna og β-utgangen nevroner og makrofager/microglia. RNA fra isolert neurons og makrofager/microglia kan bli transkribert i cDNA for bruk i kvantitative PCR analyse. mRNA uttrykk nivåer av pcna mot β-utgangen rengjøring genet i isolerte neurons og makrofager/microglia bestemmes av qPCR (N = 3). Fold endring ble målt med metoden komparative (ΔΔCT). Feil bar representerer gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : FACS sortering for microglia fra 3 dpf sebrafisk larver. (A-C) Påfølgende gating Vis sekvensiell utvalg av alle hjernen cellene (A), enkeltceller frem scatter og siden punktdiagram (B). (C) døde celler ble utelukket av DAPI merking. (D) Microglia ble identifisert ved 4C 4 positiv flekker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Micro-kapillære geleelektroforese resultatene av utdraget fra 5 dpf sebrafisk microglia. De to høye toppene er den 18S og 28S ribosomal RNA. RNA integritet nummer (RIN) beregnet automatisk av bioanalyzer bruker generert forholdet på 18S og 28S ribosomal underenheter og analyse av hele electrophoretic sporingen. Microglia RNA har en RIN 8.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Antallet og tester av forsterket cDNA fra RNA utvalg av 5 dpf sebrafisk microglia. Bildet viser cDNA fragment størrelsesDistribusjon av analysert prøven med en gjennomsnittlig størrelse på 299 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tilstand | Eksperimentet | Fisk nummer | Celle nummer | Celle nummer per fisk | RNA konsentrasjon (pg/ul) | Totalt RNA (pg) | RNA beløp per celle (pg) | RIN score |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0,13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0,13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0,16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0.20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0,10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0.07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0,13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0.09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0.07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74.95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0.07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7.8 |
Tabell 1: Sammendrag av microglia isolasjon og RNA utvinning data fra 3, 5 og 7 dpf sebrafisk larver.
| Intern prøve-ID | Eksterne prøve-ID | FROLINA (ng/ul) | Qubit(ng/UL) | Gjennomsnittlig konsentrasjonen (ng/ul) | Volum (ul) | UG mottatt | Bestått/ikke bestått for minimum konsentrasjon | Bestått/ikke bestått av minimere antall | Bestått/ikke bestått av anbefalt antall |
| 10907SD0010 | 5 dpf (eksperiment 4) | 58.8 | 58,4 | 58,6 | 30 | 1.76 | Pass | Pass | Pass |
| Eksempel krav til biblioteket Prep: | |||||||||
| Biblioteket Prep | Minimumsantall (ng) | Anbefalt antall (ng) | Minimum konsentrasjon ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano gel gratis 350 bp sett inn biblioteket fra cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tabell 2: Antall tester av forsterket cDNA fra RNA utvalg av 5 dpf sebrafisk microglia.
Discussion
Eksperimentell protokollen beskrevet her representerer en robust og effektiv metode for å isolere hjerneceller fra sebrafisk larver fra 3 til 8 dpf. Viktigere, er dette den første protokollen som tillater at bestemte isolering av microglia fra larver sebrafisk hjerner. Protokollen er utformet for å bevare cellemembranen integritet og for å redusere potensielle endringer av genuttrykk forekommer under behandling. Dette siste punktet er avgjørende for relevansen av resultatene basert på analyse av de isolerte mobilnettet genomisk profilene. Faktisk microglia og macrophage polarisering er sterkt påvirket av deres microenvironment. Ved 37 ° C, ville disse cellene ha endret gene expression profilen svar på eksperimentelle forhold (skade (transection) respons). Derfor var det avgjørende å utføre dette eksperimentet på 4 ° C før RNA ekstraksjon, tregere cellulære prosesser og metabolic aktivitetene. Videre ble mekanisk hjernen vev homogenisering på 4 ° C valgt i stedet for enzymatisk vev fordøyelsen ved 37 ° C å unngå av genet uttrykket profiler.
Det er viktig å understreke at denne metoden er veldig rask; innen en dag kan flere hjernen celle populasjoner isoleres fra minst to forskjellige eksperimentelle forhold og deres RNA utdraget. Den totale lengden på protokollen avhenger av antall Larvene brukt til hver betingelse som transection larver hoder er begrensende skritt (∼ 350 hoder/h). Generelt, for å arbeide med microglia 3, 5 og 7 dpf anbefales mudderbunn ∼ 600 hoder per test for å få nok RNA trekke ut (tabell 1). Microglia representerer den cellen med lavest gir (ca 112 celler per hode på 7 dpf), antall hoder kan reduseres for andre celletyper inkludert makrofager (ca. 170 celler per hode på 7 dpf).
En annen fordel med denne protokollen er at når innstillingene på FACS sorter er etablert, kan de samme innstillingene brukes for forskjellige eksperimenter. Det har blitt observert at celle populasjoner passer perfekt fra et eksperiment til en annen med gates tidligere designet, viser reproduserbarhet eksperimenter ved hjelp av denne metoden.
En liten ulempe med denne metoden er relativt lave mengden RNA som er høstet. Denne begrensningen er imidlertid mer en biologisk problemet enn et teknisk problem, som antall microglia er svært lav i tidlige stadier av hjernens utvikling (tabell 1). På grunn av dette lave antallet av samlet, må forsterkning skritt vurderes å utføre genomet bredt gene expression analyse. Heldigvis produserer fremgangsmåten forsterkning tilstrekkelig mengder høykvalitets cDNA. Dermed kan globale endringer i genet uttrykket profiler av isolerte celler studeres.
Avslutningsvis gir denne protokollen en robust metode for å isolere og studere ulike CNS celletyper fra larver sebrafisk hjerner. Dette kan brukes for å få en dypere forståelse av disse cellene under utvikling så vel som å studere deres rolle i sykdom.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Claire Davis og Dr. Veronique Miron (dronningens Medical Research Institute, Edinburgh, United Kingdome) for første hjelp og diskusjoner om eksperimentell tilnærming og QMRI Flow cytometri og celle sortering anlegget. Dette arbeidet ble støttet av en kreft forskning UK karriere etablering prisen til Dr. Dirk Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
