Summary
随着与人类疾病相关的遗传变异开始显露出来, 开发系统以迅速评估那些被确定的变种的生物学意义变得越来越重要。本协议描述了在女性减数分裂过程中使用小鼠卵母细胞评估人类基因功能的方法。
Abstract
胚胎体检是人类不孕症的主要遗传原因。这些事件大多来源于女性减数分裂, 尽管与孕产妇年龄呈正相关, 但年龄并不总是预示着产生异倍体胚胎的风险。因此, 基因变体可能会解释在卵子发生过程期间染色体分离的错误。鉴于对人类卵母细胞的访问有限的研究目的, 通过一系列的分析, 以研究人类基因功能在减数分裂 I 使用小鼠卵母细胞。首先, 基因的信使 RNA (mRNA) 和感兴趣的基因变异被杏仁入前期 I 被拘捕的老鼠卵母细胞。在允许表达时间后, 卵母细胞被同步释放到减数分裂成熟完成减数分裂 i。通过用荧光记者的序列标记 mRNA, 如绿色荧光蛋白 (Gfp), 除了表型改变外, 还可以评估人体蛋白的定位。例如, 可以通过建立挑战基因产物来修复减数分裂错误的实验条件来调查功能的增益或丧失。虽然这一系统有利于在卵子发生过程期间对人体蛋白质功能进行调查, 但由于蛋白质表达不在内源性水平, 而且除非受控(即敲), 小鼠同系物也存在于系统中。
Introduction
不孕是影响10-15% 人口的生育年龄1的一个条件, 近半数的人寻求医疗治疗2。虽然不孕的病因是多种多样的, 在许多情况下多因素, 最常见的遗传异常的人是胚胎体检3。体检被定义为细胞中正确数目的染色体的偏差 (增益或损耗)。体检在人类胚胎中的现象是常见的, 并随着高级孕产妇年龄的增长而增加4,5。四项随机对照试验突出了仅选择染色体正常 (euploid) 胚胎进行子宫移植的好处, 因为这一策略导致植入率增加, 流产率降低, 并且缩短了实现怀孕6,7,8,9。因此, 了解人类体检的病因学对辅助生殖有重要意义。
虽然植入前的 aneuploidies 基因检测对不孕症治疗是有益的, 但对 aneuploidies 起源的深入了解仍然缺乏。人们普遍认为, 减数分裂 aneuploidies (起源于配子生产期间) 与孕产妇年龄呈正相关, 然而, 有些妇女呈现出与其特定年龄的平均率相差4的胚胎体检率。这些病例表明, 单独年龄并不总是预示着产生异倍体胚胎的风险。其他因素可能会在增加胚胎体检的风险方面发挥作用, 如基因变异。
在卵母细胞减数分裂过程中, 研究基因变异对体检的潜在贡献的一个关键方面是设计一个快速评价减数分裂基因功能的系统。由于道德约束和有限的访问, 使用人类卵子进行这些实验是不切实际的。这些问题可以通过使用小鼠卵母细胞来规避, 这里描述了在减数分裂过程中评估人类基因功能的一系列检测方法。通过 microinjecting 的信使 RNA (mRNA) 编码的基因变异, 在小鼠卵中的人蛋白的定位可以可视化, 并用于确定野生型和变异人蛋白的异位表达是否导致任何可能导致体检的表型改变。这些表型包括增加微管, 附加到不适当的修女动粒和无法支持染色体排列在中期的减数分裂 i. 重要的是, 这个协议可以用来调查的增益和损失的功能遗传变异通过建立特定的实验条件来挑战卵母细胞减数分裂的关键事件, 如纺锤体构建和染色体对齐10。
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Protocol
1. 分子克隆
- 获得感兴趣基因的全长编码序列和质粒体外转录 (pIVT) 向量11。
注: 全长 cDNA 克隆可从各种供应商处获得, 也可通过反向转录聚合酶链反应 (RT PCR) 产生。国家生物技术信息中心 (NCBI) 在线资源提供核苷酸和表达序列标记 (EST) 数据库的基因转录序列。为了便于蛋白质可视化和表达水平分析, 克隆策略中可能需要融合到绿色荧光蛋白 (Gfp) 或其他合适的荧光标记。 - 使用验证的克隆策略, 将感兴趣基因的编码序列插入 pIVT 的多个克隆区域。对分子克隆和所需步骤的详细描述以前已被描述为12。
注: 如果要生成基因融合产品, 请确保克隆在正确的阅读框架中。 - 使用球蛋白引物对构造进行序列, 以确保正确的基因插入, 适当的帧内融合, 并没有产生聚合酶诱发的点突变。
注: 如果不提供桑格 dna 测序设备, 许多公司提供低成本的 dna 测序选项。 - Mutagenize DNA, 如果生成单核苷酸多态性 (SNPs) 或插入/删除 (INDELS)。DNA 突变在下面的步骤 1.5-1.7 中描述。对于野类型构造, 请继续线性化步骤1.7。
- 设计诱变引物, 完成诱变 PCR 反应, 生成每个制造商协议的突变构造。PCR 介导的站点定向诱变以前曾被描述为13。此外, 许多公司提供网站定向的诱变套件, 其中包括协议。
- 将 mutagenized DNA 转化为细菌宿主。分离纯化质粒。
注: 许多公司制作的套件, 可以用来方便地分离和纯化质粒 DNA。相应地遵循制造商协议。如果使用革兰阴性细菌菌株, 如大肠杆菌, 建议使用去除内毒素的试剂盒。 - 使用标准的转化 dna 序列来确定分离的 dna 来自细菌的基因组, 以确认所需的 SNP 或 INDEL 的引入。
- 进行线性化最终产品采用单限制酶消化纯化的 DNA。
注: pIVT 向量包含多个单酶切割点, 在 Addgene 14的质粒图中列出。 - 确保产品通过琼脂糖凝胶电泳进行线性化。琼脂糖凝胶电泳方法以前已被定义为14。
注: 对于所有剩余的步骤, 使用屏障 (过滤器) 吸管提示和无 RNase 材料, 以确保生产稳定, 高质量的 RNA。 - 使用经过验证的 DNA 清除协议或试剂盒纯化所消化的产品, 并在30µL RNase/DNase 水中洗脱。
注: 推荐采用硅基自旋柱基套件, 用于高质量、纯化的 DNA。相应地遵循制造商协议。 - 体外根据制造商的协议, 使用 T7 聚合酶转录 DNA。
- 用硅基自旋柱基核酸纯化试剂盒在制造商的协议之后, 纯化和洗脱 RNA 在30µL 的 RNase/DNase 游离水中。
- 用甲醛进行变性琼脂糖凝胶电泳, 确定最终的 RNA 产品尺寸。请参见14下的步骤 1.13-1. 22。(图 1)。
- 在72毫升水中加热1克琼脂糖, 直到溶解, 然后冷却到60摄氏度。
- 通过添加0.4 米拖把 (pH 7.0), 0.1 米醋酸钠和0.01 米 EDTA, 准备10X 拖把运行缓冲器。
- 加入10毫升的10X 拖把运行缓冲器, 18 毫升37% 甲醛 (12.3 米) 的冷却琼脂糖溶液。
- 将琼脂糖溶液倒入凝胶容器中, 使凝胶形成种姓。用梳子大到足以容纳10µL。凝胶设置后, 手感牢固, 轻轻取下梳子。
- 将凝胶在电泳槽中组装, 加入足够的1X 拖把运行缓冲器, 确保凝胶完全覆盖。
- 将1µg rna 添加到0.5X 容量的含甲醛负载染料中, 制备 rna 样品。
- 在10µg/毫升浓度的 RNA 溶液中加入溴溴。
- 变性 RNA 样品溶液在70°c 5 分钟。
- 使用无菌, 10 µL 过滤器小贴士, 5 µL 分子量标记和5µL 的 RNA 样品 (s) 成单独的水井的凝胶和 electrophorese 在 5 V/厘米, 直到染料迁移至少2/3 的凝胶长度。
- 在 UV 反式照明灯上可视化凝胶中的 RNA。通过比较分子量标记, 确保 RNA 的大小是正确的。
- 为了测量 RNA 的浓度和纯度, 在紫外分光光度计上使用无菌10µL 过滤器将1.2 µL 纯化 rna 转移。
请注意, 高质量的 RNA 应该分别有 A260/280 (1.8-2.2) 和 260/230 (> 1.7) 的吸光度率。 - 使用10µL 过滤器提示, 整除剩余的纯化 RNA 成无菌0.5 µL 离心管 (3-5 µL/管)。贮存管在-80 摄氏度, 直到准备注射。
注: 最终注射浓度为500µL 是最佳的起始点。建议在显微注射前稀释 1:2 RNase 游离 H20 中的 rna, 以减少微量注射吸管中 rna 的粘性。
2. 动粒微管附着物测定
- 将卵母细胞分成相等的组进行显微注射。
注: 卵母细胞的收集、转移、显微注射和减数分裂成熟已在朱庇特以前的15中详细描述。 - Microinject 一组与实验性 mRNA 和其他组 (s) 与重量控制和 PBS 或Gfp mRNA。
注: 500 ng/µL 是建议的注射浓度从10开始。picoinjector 可用于控制注入量。建议使用 5-10 pL 的注入量15。 - 使用手或嘴操作的吹打器具, 玻璃吸管的开口稍大于卵母细胞 (100-150 µm) 的直径, 将卵母细胞转移到胚胎质量矿物油覆盖的培养皿中的米力农培养基中的100µL 下降在 5% C02中孵化7小时37摄氏度的卵母细胞, 以使减数分裂的中期有足够的成熟 i (见 i) 15。
- 孵化后, 使用与上述相同的吸管装置, 将卵母细胞转移到中心井器官培养皿中, 在中心井和500µL H20 在µL 中含有700的预冷最低基本介质 (内存) 收集介质, 并把盘子放在冰上7分钟。
注: 建议在治疗卵母细胞之前, 先将记忆介质和中心好的器官培养皿放在-20 摄氏度, 至少20分钟。 - 用吸管装置将卵母细胞转移到400µL 2% 多聚甲醛的透明玻璃斑块的井中, 室温下进行20分钟固定。
- 使用相同的吸管装置, 将卵母细胞转移到另一井中, 在含有400µL 阻塞溶液 (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% 南3) 的现货板上, 并存储在4°c, 直到准备好处理染色。
注: 用于将卵母细胞贮存在4摄氏度, 用 parafilm 盖上玻璃斑片以防止蒸发。 - 使用相同的吸管装置, 在含有400µL 通透溶液 (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% 南3) 的现货板上将卵母细胞转移到新井中, 并在室温下孵化20分钟. 迅速通过三转移卵母细胞滴400µL 堵塞溶液去除任何残留洗涤剂。
注: 一个9清楚的玻璃斑板工作良好的移动组通过多种处理, 在一个单一的菜 (步骤 2.4-2.5)。 - 在湿室中执行剩余的免疫细胞化学程序, 在室温保护下不受光照。使用一个中型塑料容器衬里与潮湿的纸巾和覆盖铝箔。
- 使用吸管装置, 将卵母细胞转移到96井板盖上的30µL 堵塞液, 在加湿室内放置10分钟。
注: 水滴放在盘子上的圆形磨损中。 - 使用吸管装置, 将卵母细胞转移到含有抗 centromeric 抗原 (ACA、波峰) (一点半) 和抗乙酰蛋白 (1:1000) 的30µL 阻塞溶液中, 并至少1小时进行孵化, 以标记着丝粒和主轴。
- 将卵母细胞通过三30µL 滴溶液转移至10分钟, 以冲洗卵子。
- 使用吸管装置, 将卵母细胞转移到30µL 的阻断溶液中, 其中含有继以上抗体 (抗人 igg 1:200、抗鼠 igg 1:200) 和孵育1小时的免疫球蛋白。
- 按照步骤2.11 中的说明, 重复30µL 阻塞解决方案中的3、10分钟漂洗步骤。
- 使用吸管装置将卵母细胞转移到3-5 µL 安装介质中, 其中含有 DAPI (5.9 µg/µL) 在玻璃显微镜上滑动。
- 放置4小滴 (针头大小) 的石油果冻在角落的盖子滑动, 以防止粉碎的卵母细胞。
- 轻轻地把盖子滑到油果冻边放到滑梯上。
- 用透明指甲油密封盖玻片边缘, 并允许干燥5分钟。
- 存储幻灯片在4°c, 保护不受光, 直到处理通过共焦显微镜。
注: 确保安装介质的折射率和盖玻片, 符合所使用的显微镜目标。推荐的安装材料以前已被描述为15。 - 图像卵母细胞在共焦显微镜上使用40-63x 目标, 在 z 平面捕获小步骤 (≤1µm), 为工作目标进行优化, 并对中期主轴的整个区域进行图像处理。
注: 确保根据步骤2.11 中使用的特定辅助抗体对所有3通道进行图像处理。图像平均≥4和变焦3是理想的足够的分辨率。1µm 步长提供了小鼠卵母细胞微管和动粒的清晰可视化。图像捕获的过程从显微镜到显微镜都不同。有关如何配置显微镜设置的具体步骤, 请参阅制造商共聚焦用户指南。 - 在下面的步骤 2.21-2. 23 中, 使用成像软件识别动粒微管附件状态。
注: 以下步骤使用图像 J (NIH) 免费下载软件描述此过程, 但是可以使用备用成像软件。附件状态类型以前已定义为16 。 - 通过将文件拖到图像 J 工具栏中打开图像。
- 在打开的 z 系列中, 通过单击 "颜色" 子选项卡下的 "图像" 下拉菜单中的 "合并通道", 使所有通道可见 (DNA、动粒和主轴)。
- 使用图像底部的切换, 移动每个 z 切片并确定动粒微管附件。详细的附件说明以前已被描述为16
3. 染色体对准挑战测定
- 根据步骤2.3 中所述的吸管装置, 将卵母细胞转移到100µL 的米力农培养基中, 并孵化卵母细胞7小时, 以使减数分裂的中期得以充分成熟 (见 i), 如上文步骤 2.3 17 中所述.
注: 卵母细胞的收集、显微注射和成熟过程概述了以前的15。有关控制和 RNA 显微注射浓度的步骤 2.1-2.2, 请参阅附件检测协议。 - 使用相同的吸管装置, 将卵母细胞转移到一个中心井器官培养皿中, 其中含有700µL 培养基, 含有 monastrol [100 µM] 在中心井和400µL H20 在周围环和孵化在37°c 为 2 H。
- 通过转移卵母细胞, 用上述的吸管装置冲洗出 monastrol, 通过三滴100µL CZB 培养基, 然后将卵母细胞转移到含有700µL 培养基 + MG132 [5 µM] 的中心-井器官培养皿中, 3 h。环。将400µL H20 添加到外圈。
- 用吸管装置将卵母细胞转移到400µL 2% 多聚甲醛的透明玻璃斑块中, 室温下进行20分钟修复。
- 固定后, 使用吸管装置将卵母细胞转移到一个含有400µL 阻塞溶液的透明玻璃斑块的新井中, 贮存在4摄氏度, 直到染色处理。
注: 用于将卵母细胞贮存在4摄氏度, 用 parafilm 盖上玻璃斑片以防止蒸发。 - Permeabilize 和标签卵母细胞通过免疫化学, 如步骤 2.6-2.16 所述。
- 图像卵母细胞在共焦显微镜上使用40-63x 目标, 捕捉 < 1 µm 步骤在 z 平面, 确保图像的整个区域的中期主轴。
- 用成像软件识别染色体对准状态打开图像文件。
注: 以下步骤使用图像 J (NIH) 免费下载软件描述此过程, 但是可以使用备用成像软件。 - 将图像拖动到图像 J 控制面板中。
- 在打开的 z 系列中, 使用 "点" 工具 (可通过单击图像 J 控制栏上的点工具图标), 通过将工具放置在图像中的主轴杆上并单击图像, 在各自的 z 切片上标记每个主轴柱尾的点。通过按键盘上的命令 + t 将这些点添加到 "感兴趣区域" (ROI) 管理器中。
- 通过突出显示 ROI 管理器中的特定点并单击 "度量值" 按钮, 确定步骤3.10 中设置的每个位置的特定坐标。这将为每个点提供一个包含 x 和 y 坐标的结果表。这些将分别是 X1、Y1 和 X1、Y2 分。
- 接下来, 确定真正的 Z 坐标。这是通过将特定 z 切片的切片数乘以在其中识别主轴极点 (即切片 #2 6), 每个单独点都由堆栈粗细 (即1 µm) 来实现 (例如: 切片 2 x 1 µm = 2)。这些将分别是 Z1 和 Z2 点。
- 使用毕达哥拉斯定理方程 (2 + b2 = c2) 用以前定义的 x、y 和 z 坐标从步骤 3.11-3. 13 确定主轴长度。对于每个主轴, 最终长度等于:
√ (X1-X2)2+ (Y1 Y2)2+ (Z1 Z2)2) - 确定主轴 midzone。计算为主轴长度的一半。使用图像 j 中的线条工具, 通过单击图像 j 工具栏中的线条图标, 绘制从一个主轴杆到主轴 midzone 的直线。长度将显示在图像 J 工具栏上。
- 通过使用线测量工具, 通过评估主轴 midzone 的染色体距离来确定染色体对准状态。通过单击图像 J 工具栏中的线条图标, 可以使用直线工具, 从主轴 midzone 到染色体绘制一条直线。长度将显示在图像 J 工具栏上。从主轴 midzone 中超过4µm 的染色体被视为齐18。
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Representative Results
在体外转录高品质的 RNA 将有一个 A260/A280 比 (1.8-2.2) 和 A260/A230 比≥1.7 时使用分光光度计。图 1中的图片显示了在电泳后变性琼脂糖凝胶上体外产生的 RNA 的迁移。在图案中涂抹的带或具有多个尺寸波段的样本可以指示样品的污染或降解。另外, 多波段可能表明 mRNA 不是完全变性, 或起始质粒没有完全线性化。mrna 的运行比预测的要大, 因为 adenylated 的尾巴被内置在 pIVT 中, 这允许 mrna在体外的稳定表达。注射后, 建议通过荧光显微镜确保均匀的注射量和表达水平。图 2中的图片显示了与Gfp一致注射的前期 I-被捕获的卵母细胞。一致的显微注射技术对该协议至关重要。图像分析软件, 如图像 J, 可用于验证表达式级别, 以确保技术的一致性和掌握。请注意, 在对两种检测进行成像时, 可以获得亚细胞定位信息。对于所有的微注射实验, 评估基因变异的影响, 野生型基因应注射到卵母细胞的子集作为控制。这允许一个控制在小鼠卵母细胞中的人类基因可能的过度表达表型。PBS 或用于荧光标记的构造的Gfp也应被注入卵母细胞子群中, 以控制微注射诱导的表型。对于没有荧光标记的构造, 可以对Gfp mRNA 进行联合注射, 以确保充分的显微注射。如果同时联合注射两个或更多的结构, 一定要增加 mrna 浓度, 这样最终的解决方案包含每个 mRNA 的500µL。
冷稳定微管检测为评估动粒对微管的附着状态提供了一个有价值的工具。图 3是一个 z 投影的一个中期 i 卵母细胞共焦显微镜图像。该卵母细胞受到冷媒治疗, depolymerize 所有未附着于动粒的微管。在没有足够时间治疗的卵母细胞将含有不附着在染色体上的微管纤维 (太短的结果太多的纤维) 或缺乏纤维 (太长导致没有纺锤结构), 建议这些卵母细胞不用于分析。在减数分裂中期, 卵母细胞通常含有未连接或侧向附着的动粒, 因此建议在任何附件研究中使用对照组。平均来说, 野生型卵母细胞将包含5-10% 动粒在 MI 将不稳定地附加 19. 所有卵母细胞在同一个阶段动粒-微管附着状态的分析是至关重要的。为了确保实验和控制组成熟的时间尺度相近, 建议对细胞周期动力学进行评估。为了进行这项试验, 应成熟的控制和实验性卵母细胞的子集, 并可视化生活在时间推移显微镜。使用米力农允许卵母细胞在减数分裂 I 前期进行同步, 这样就可以释放到缺乏米力农的介质中, 同时允许在20同时恢复减数分裂。来自控制和实验组的卵母细胞应该挤压一个极性体, 预示着在类似的时间点达到减数分裂 ii (见 ii) 中期。如果没有活细胞显微镜, 卵母细胞可以成熟, 以满足 i (7 小时) 和满足 II (16 小时), 固定, 并染色检测 DNA 和微管如前所述。在遇见 i 和遇见 II 桶形, 双极纺锤应该是可看见的。在控制卵母细胞中, 染色体应在中期板块对齐。根据变异影响, 染色体的排列将会有所不同, 但是, 染色体应该凝聚并附着在微管上, 而大多数染色体集中在主轴上。同样数量的卵母细胞在控制和实验组中应该达到减数分裂 II。为了减少在确定附件状态方面的困难, 建议使用 z 平面上的小步骤, 为特定的工作目标优化成像卵母细胞。分析将包括分别查看 z 切片和合并设置, 以确定附加微管的极点。图 3B演示了异常动粒微管附件的示例。所示是一个双价, 其中只有一个姐妹动粒对连接到主轴微管, 定义为无附件。接下来, syntelic 附件显示, 其中两个姐妹动粒对连接到同一主轴杆。最后, 一个 merotelic 附件显示, 其中一个姐妹动粒连接到两个主轴杆, 而另一姐妹动粒的一对是连接到一个单一的主轴杆。
图 4中的图像说明了渐进式的预期 DNA 和主轴配置, 因为一步步进行染色体对准挑战检测。在这种分析中, 重要的是, 不同的实验组的进展, 通过减数分裂与类似的动力学。如前所述, 建议在进行挑战化验之前完成细胞周期动力学分析。在这项试验中, 评估卵母细胞成功纠正异常动粒微管附件的能力。为了测试这一点, 卵母细胞首先成熟, 以满足我允许动粒微管附件建立。接下来, 卵母细胞在 monastrol 中孵化, Kinesin 5 (EG5) 抑制剂, 将双极主轴折叠成单主轴21。单主轴的生成导致100% 个不正确的微管动粒附件。然后 monastrol 抑制剂被冲出以允许恢复。在恢复期间, 卵母细胞再生双极纺锤体, 并试图纠正微管附件。蛋白酶体抑制剂 MG132 的添加可以防止后期发病。作为一个控制, 每个实验组的卵母细胞的一个小子集可以固定在协议的每个阶段 (满足 I, monastrol 治疗, 后恢复), 以确保所有组对治疗作出反应, 并在相同的程度。中期 I 卵母细胞应包含一个筒形双极纺锤体, 染色体排列在中期板上。用 monastrol 治疗的卵母细胞应包含一根围绕单极的染色体的单纺锤体。恢复的卵母细胞应再次包含一个桶形双极主轴。染色体对齐是指从主轴 midzone 224 微米以上的任何染色体。这是有益的染色卵母细胞, 以检测 DNA 和动粒建立, 如果两个动粒都在这个中心区域以外, 因为这可能是很难确定使用只有 DNA 检测。
图1。RNA 的 Denaturingagarose 凝胶电泳.RNA 的质量和大小可以用电泳对变性琼脂糖凝胶进行评估。建议采用变性凝胶防止次生结构形成。1车道含有 RNA 分子量标记。2车道是 RNA 样品。请注意, 由于内置的波利亚尾部, RNA 的运行比计算的要大。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。验证卵母细胞显微注射.荧光显微镜可用于验证成功的卵母细胞显微注射和表达。前期 I-被拘捕的卵母细胞杏仁与Gfp在结构的隔夜表示之后显示。这张照片是使用 Invitrogen EVOS 的自动成像系统, 配备了 GFP 光立方体。刻度条为100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图3。评估动粒微管附件。(A) 一个具有代表性的 z 投影的冷处理满足 I 卵母细胞。显示主轴 (绿色)、动粒 (红色) 和 DNA (蓝色)。该框指示光学变焦的区域。箭头表示动粒的末端附着物到单价微管。刻度条为主轴、动粒、DNA 和合并通道的10µm。缩放条为光学变焦是5µm. (B) 小鼠卵母细胞中异常动粒微管附着类型的例子。箭头表示动粒微管附件站点。刻度条为5µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图4。染色体对准挑战检测.步骤流程图的过程中有代表性的 z 投射卵母细胞在每一步。卵母细胞首先成熟到减数分裂的中期 i (遇见 i), 然后转移到一个新的菜包含 monastrol 2 h 诱导单纺锤形成。下一个卵母细胞可以在成熟培养基中恢复, 并辅以蛋白酶体抑制剂 (MG132), 以防止3小时的后期发作。一旦恢复的卵母细胞是固定的, 标记为主轴 (绿色), 动粒 (红色) 和 DNA (蓝色), 并通过共焦显微镜成像, 以确定对齐状态。线表示主轴的长度 (40 µm) 和主轴 midzone (20 µm) 确定使用毕达哥拉斯定理方程。箭头表示每个极点的点工具位置。任何动粒 > 4 µm 从主轴 midzone 被视为齐。星号表示齐染色体 (5.6 µm 从 midzone)。刻度条为10µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
由于与疾病有关的人类遗传变异的快速和不断增加的识别, 必须建立系统来评估其生物学意义。了解人类减数分裂中的蛋白质功能会带来特殊的挑战, 因为人类卵母细胞是珍贵的, 稀有的, 人类的精子不能服从基因的操纵。小鼠卵母细胞是哺乳动物模型系统, 对评估人类减数分裂基因功能有价值10,23。这个模型绕过了使用人类卵子的不切实际之处, 同时提供了一个很容易获得的低成本、可操作卵母细胞的来源, 它们经历了类似于人类生殖细胞的减数分裂, 同时也有助于理解基因变异如何影响女性。肥力。
由于这些方法通过显微注射在小鼠卵母细胞中使用人蛋白的异位表达, 首先建立一个控制浓度, 不改变减数分裂成熟的野生型 RNA 是至关重要的。建议在控制卵母细胞中监测减数分裂成熟动力学 (核包络击穿, 极性体挤压), 建立基线参数, 并评估纺锤和染色体形态学。此外, 确保均匀的显微注射量对比较组是至关重要的。在感兴趣的基因上包括荧光标记可以简化这个技术挑战。以前已经演示了用于掌握卵母细胞显微注射的技术15。荧光显微镜下注射卵母细胞的可视化或通过西方印迹确定蛋白质的表达, 也是确认一致注射浓度的重要工具。
由于哺乳动物卵母细胞染色体分离的错误是导致胚胎体检和妊娠丢失的主要原因5, 动粒微管附件的分析为评估感兴趣的基因是否影响染色体隔离 (即不正确的附件将导致错误隔离)。10分钟的接触冷却介质足以 depolymerize 微管, 没有做过动粒的附件, 允许可视化稳定的附件通过共焦显微镜 24. 对于这种检测, 重要的是不要过度冷却的卵母细胞, 因为这将导致降解的稳定微管。此外, 染色程序的优化是动粒和微管结构可视化的关键。为了确保足够的图像解析, 在 z 平面上使用 40 x 63 x 目标的小步骤 (≤1微米) 应该被捕获, 并通过整个主轴结构获取图像, 以确保所有附件都可见。请注意, 在 prometaphase 减数分裂 I 25期间有独立动粒是常见的。
染色体对准挑战分析是有用的评估增益或功能损失的变体。由于年轻雌性的小鼠卵母细胞的体检水平较低, 所以功能变异可能很难评估。这种检测克服了这一障碍, 产生的情况下, 卵母细胞必须纠正实验性诱导不正确的动粒微管附件。建立一个时间点, 其中控制卵母细胞在恢复后包含1-2 条不齐染色体提供了一个可量化的场景, 用于确定突变体是否提供了更高的对准效率 (即更好的对齐保护 euploidy)。对于染色体失调的量化, 以前建立的协议, 其中的染色体大于4微米从主轴 midzone 的特点是齐可以使用18。
为了研究功能损失的变体, 由于研究系统内内源同源, 需要额外的实验条件。缓解这个问题的一个方法是使用或生成一个挖空鼠标模型的兴趣变体。Crisper/Cas9 系统的出现可以提供一种快速生成此类挖空26的方法。或者, 如果挖空模型不是一个选项, 可以使用经典的击倒技术, 如共注射反义吗啉代寡核苷酸或小干扰 rna。然而, 需要注意序列设计, 以避免任何潜在的干扰与杏仁变体正在研究。例如, 吗啉代寡核苷酸可以被设计成绑定到 5 ' 未翻译的区域 (5 ' UTR) 的小鼠基因, 这是不包括在人类 mRNA 变种引进通过显微注射。如果使用小干扰 rna, 你可以针对一个非同源序列区域或引入无声点突变的人类基因, 将规避目标。然而, 由于在人类基因组的异型状态中发现了许多变种, 所以在变种的表达上仍然存在内源蛋白拷贝是有用的。
最后, 尽管本议定书没有说明, 染色体体检评估可以很容易地评估在第二次卵子中作为人体变异分析管道的最后化验。此就地染色体扩展协议的详细说明以前曾描述过15。简单地, 杏仁卵母细胞成熟的在体外, 直到他们达到第二阶段, 在治疗之前与减数分裂纺锤-解聚剂在固定之前。这里所描述的动粒和染色体染色允许对染色体含量进行评估。
虽然小鼠卵母细胞为研究女性减数分裂的关键蛋白质提供了一个宝贵的工具, 但对该模型存在一些局限性。过度表达蛋白质可以扰乱减数分裂成熟, 因此 RNA 浓度可能不存在, 不诱导表型。此外, 内源性小鼠同源可能干扰外源人类蛋白的定位。生成挖空鼠标模型提供了解决这个问题的办法;然而, 在所有情况下, 这可能是不可行的。另一种方法是通过共注射 rna 或吗啉代寡核苷酸来耗尽老鼠的蛋白质, 而设计的目的是不针对外源核糖核酸和蛋白质。最后, 重要的是要注意的是, 虽然许多蛋白质是同源的人和老鼠, 差异可能存在, 导致差异的本地化和功能, 可以排除这种类型的跨物种分析。正如 Cas9-genome 编辑27这样的基因操作工具变得更便宜和更常见, 这个协议可能演变成制造闯入, 人性化的鼠标线, 而不是依靠显微注射。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自美国生殖医学协会的研究补助金, 以及来自罗格斯大学的查尔斯和乔安娜. 布希纪念基金的支持, 新泽西州的 k.s.a. L.N. 得到了美国 (F31 HD0989597) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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