Summary
Som de genetiske varianter forbundet med menneskelig sygdom begynder at blive afdækket, det stadig vigtigere at udvikle systemer, som hurtigt vurdere den biologiske betydning af de identificerede varianter. Denne protokol beskriver metoder til evaluering menneskeligt genfunktion under kvindelige meiose jeg bruger musen oocyter.
Abstract
Embryonale aneuploidi er den største genetiske årsag til infertilitet hos mennesker. De fleste af disse begivenheder stammer under kvindelige meiose, og omend positivt korreleret med moderens alder, alder alene er ikke altid intelligent af risikoen for at generere et aneuploid Foster. Derfor kan gen-varianter tegner sig for forkert kromosom segregation under oogenesen. Adgang til menneskelige oocyter er begrænset til forskningsformål, en række assays blev udviklet for at studere menneskelige genfunktion under meiose jeg bruger musen oocyter. Først, messenger RNA (mRNA) genet og genet variant af interesse er microinjected til prophase jeg-anholdt mus oocyter. Efter giver tid til udtryk, oocyter udgives synkront i meiotiske modning at fuldføre meiose jeg. Ved tagging mRNA med en sekvens af en fluorescerende reporter, såsom grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), kan lokalisering af det menneskelige protein vurderes ud over de fænotypiske forandringer. For eksempel, vinde eller tab af funktion kan undersøges ved at etablere forsøgsbetingelser, der udfordrer gen produktet til fix meiotiske fejl. Selv om dette system er en fordel i at undersøge menneskelige protein funktion under oogenesen, bør passende fortolkning af resultater foretages, da protein udtryk ikke er på endogene niveauer og, medmindre kontrolleret for (dvs. bankede ud eller ned) er murine homologs også til stede i systemet.
Introduction
Barnløshed er en sygdom, der rammer 10-15% af den menneskelige befolkning af fødedygtige alder 1, hvorfra næsten halvdelen søge lægebehandling 2. Selv om årsagen til barnløshed er mangfoldigt og i mange tilfælde multifaktoriel, er den mest almindelige genetiske abnormitet i mennesker embryonale aneuploidi 3. Aneuploidi er defineret som afvigelse (gevinst eller tab) af det rigtige antal kromosomer i en celle. Fænomenet med aneuploidi i menneskelige embryoner er fælles og øger med avanceret moderens alder 4,5. Fire randomiserede kontrollerede forsøg har fremhævet fordelen af at vælge kun chromosomally normal (euploid) embryoner til uterin overførsel, fordi denne strategi resulterede i øget implantation satser, lavere abort priser og en kortere tid for at opnå graviditet 6,7,8,9. Derfor kan forståelse ætiologien af menneskelige aneuploidi have stor betydning i assisteret reproduktion.
Selv om præ-implantation genetisk testning for aneuploidies er gavnligt i barnløshed behandlinger, mangler stadig en grundig forståelse af hvordan aneuploidies stammer. Det er almindeligt accepteret, at der er en positiv korrelation af meiotiske aneuploidies (opstod i gamet produktion) og moderens alder, men nogle kvinder nuværende embryonale aneuploidi priser, der afviger fra den gennemsnitlige sats for deres given alder 4. Disse tilfælde foreslå, at alder alene ikke er altid intelligent af risikoen for at generere et aneuploid Foster. Andre faktorer kan spille en rolle i at øge risikoen for embryonale aneuploidi, som gen-varianter.
Et centralt aspekt af efterforske det potentielle bidrag fra et gen variant til aneuploidi under oocyt meiose er at designe et system hurtigt vurdere meiotiske genfunktion. På grund af etiske begrænsninger og begrænset adgang er det upraktisk at udføre disse eksperimenter ved hjælp af menneskelige æg. Disse spørgsmål kan omgås ved hjælp af musen oocytter, og her en serie af assays til at vurdere menneskeligt genfunktion under meiose jeg er beskrevet. Af microinjecting messenger RNA (mRNA) kodning for genet variant af interesse, kan lokalisering af det menneskelige protein i mus æg visualiseres og bruges til at bestemme, hvis den Ektopisk udtryk for den wild-type og muteret humant protein resulterer i nogen fænotypiske forandringer, der kan føre til aneuploidi. Disse fænotyper omfatter en stigning i mikrotubuli, der tillægger den forkert at søster kinetochore og manglende evne til at støtte kromosom justering på metafase meiose i. vigtigere, denne protokol kan bruges til at undersøge både gevinst og tab af funktion genetiske varianter ved at etablere særlige eksperimentelle betingelser at udfordre nøglebegivenheder i oocyt meiose såsom spindel bygning og kromosom justering 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. molekylære kloning
- Opnå fuld længde kodende sekvens af gen interesse og plasmid in vitro- transskription (pIVT) vektor11.
Bemærk: Fuld længde cDNA kloner er kommercielt tilgængelige fra forskellige leverandører eller kan genereres via reverse transkription polymerase kæde reaktion (RT-PCR). National Center for bioteknologi oplysninger (NCBI) online ressource giver udskrift sekvenser af gener fra nukleotid og udtrykt sekvensen markeret (EST) databaser. For at lette protein kan ønske visualisering og analyse af udtryk niveauer, fusion til grøn fluorescerende proteiner (NGL) eller en anden egnet fluorescerende tag i strategiens kloning. - Ved hjælp af en valideret kloning strategi, indsætte den kodende sekvens af gen af interesse i regionen for flere kloning af pIVT. En detaljeret beskrivelse af molekylære kloning og de nødvendige skridt har tidligere været beskrevet 12.
Bemærk: Hvis et gen-fusion produkt der skal genereres, være sikker på, at kloning er i rammen korrekt læsning. - Sekvens konstruktion ved hjælp af Globin primere for at sikre korrekte gen indsættelse, korrekt i-frame fusion, og at ingen polymerase-induceret punktmutationer blev oprettet.
Bemærk: Hvis Sanger DNA-sekventering udstyr ikke er tilgængelig, mange virksomheder tilbyder lavpris DNA-sekventering muligheder. - Mutagenize DNA, hvis genererer enkelt nucleotid polymorfier (SNPs) eller indrykninger/sletninger (INDELS). DNA mutagenese er beskrevet i trin 1,5-1,7 nedenfor. For vildtype konstruktioner, fortsætte med linearisering trin 1.7.
- Designe mutagenese primere og komplet mutagenese PCR reaktion til at generere mutant konstruere pr. producentens protokol. PCR-medieret site-directed mutagenese har været tidligere beskrevet 13. Mange virksomheder tilbyder desuden, site-directed mutagenese kits, der omfatter protokollerne.
- Omdanne bakteriel vært mutagenized DNA. Isolere og rense plasmid.
Bemærk: Mange firmaer laver kits, der kan bruges til nemt at isolere og rense plasmid DNA. Følg producenter protokollen i overensstemmelse hermed. Hvis du bruger en gramnegative bakteriel stamme som E. coli, anbefales det at bruge et kit, der fjerner endotoksin. - Sekvens af isolerede DNA fra bakteriel transformants ved hjælp af standard Sanger DNA-sekventering for at bekræfte indførelsen af den ønskede SNP eller INDEL.
- Linearize endelige produkter ved hjælp af enkelt begrænsning enzym fordøjelsen af oprenset DNA.
Bemærk: PIVT vektor indeholder flere single-enzym skære steder listet i plasmid kort på Addgene 14. - Sikre, at produktet er lineær via Agarosen gelelektroforese. Metoden til Agarosen gelelektroforese har tidligere været defineret 14.
Bemærk: For alle resterende trin, bruge barriere (filter) afpipetteres tips og RNase-fri materialer til at sikre produktion af stabile, høj kvalitet RNA. - Rense fordøjet produktet ved hjælp af en valideret DNA oprensning protokol eller kit, og elueres i 30 µL RNase/DNase-frit vand.
Bemærk: Silica-matrix spin kolonne-baserede kits anbefales til høj kvalitet, renset DNA. Følg producenter protokollen i overensstemmelse hermed. - In vitro transskriberer DNA ved hjælp af T7 polymerase efter producentens protokol.
- Rense og elueres RNA i 30 µL af RNase/DNase gratis vand ved hjælp af en silica-matrix spin kolonne-baserede nukleinsyre rensning kit efter producentens protokol.
- Udføre denaturering Agarosen gelelektroforese med formaldehyd til at bekræfte den endelige RNA produktstørrelse. Se trin 1.13-1,22 nedenfor 14. (Figur 1).
- Forberede gel ved at opvarme 1 g Agarosen i 72 mL vand, indtil opløst, derefter afkøles til 60 ° C.
- Forberede 10 X MOPS kører buffer ved at tilføje 0,4 M MOPPER (pH 7,0), 0,1 M natriumacetat og 0,01 M EDTA.
- Der tilsættes 10 mL 10 X MOPS kører buffer, og 18 mL af 37% formaldehyd (12,3 M) til den afkølede Agarosen løsning.
- Kaste gel ved at hælde Agarosen løsning i en gel-dannende container. Brug en kam stor nok til at rumme 10 µL. Når gel har angivet og er fast at røre, forsigtigt fjerne kammen.
- Samle gel elektroforese tank, og tilføje nok 1 X MOPS kører buffer, sikre gel er helt dækket.
- Forbered RNA prøven ved at tilføje 1 µg af RNA til 0,5 X mængder af formaldehyd-indeholdende lastning farvestof.
- Tilføje ethidiumbromid til RNA løsning ved en koncentration på 10 µg/mL.
- Denaturere RNA prøveopløsningen ved 70 ° C i 5 min.
- Ved hjælp af sterile, 10 µL filter tips, indlæse 5 µL af molekylvægt markør og 5 µL af RNA stikprøveudvælgelsen i separate brønde af gel og electrophorese på 5 V/cm, indtil farvefronten har migreret mindst to tredjedele af længden af gelen.
- Visualisere RNA i gel på en UV trans illuminator. Sikre, at RNA er den rigtige størrelse ved at sammenligne med molekylvægt markør.
- For at måle koncentrationen og renheden af RNA, overføre 1,2 µL af oprenset RNA ved hjælp af steril 10 µL filter tips på Spektrofotometer UV.
Bemærk at høj kvalitet RNA bør have absorbans nøgletal for A260/280 (1,8-2.2) og 260/230 (> 1,7) henholdsvis. - Bruger 10 µL filter tips, alikvot det resterende oprensede RNA til sterile 0,5 µL centrifugeglas (3-5 µL/tube). Gemme rør ved-80 ° C indtil klar til mikroinjektion.
Bemærk: En sidste injektion koncentration af 500 ng/µL er et optimalt udgangspunkt. Det anbefales at fortynde RNA 1:2 i RNase gratis H20 før mikroinjektion at reducere klistrede af RNA i mikroinjektion pipette.
2. kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil analyse
- Opdele oocyter i lige store grupper for mikroinjektion.
Bemærk: Oocyt indsamling, overførsel, mikroinjektion og meiotiske modning er blevet beskrevet i detaljer i JoVE tidligere 15. - Microinject en gruppe med eksperimentelle mRNA og de andre målsektorers med WT kontrol og PBS eller normal god landbrugspraksis mRNA.
Bemærk: 500 ng/µL er den anbefalede injektion koncentration til at begynde med 10. En picoinjector kan bruges til at styre injektion beløb. En Injektionsvolumen af 5-10 pL anbefales 15. - Ved hjælp af en hånd eller munden drives pipettering apparater hvor glasset afpipetteres åbning er lidt dækket større end diameteren af en oocyt (100-150 µm), overførsel oocyter i en 100 µL dråbe milrinone-fri næringssubstratet i en petriskål i embryo kvalitet mineralsk olie og inkuberes oocyter i 7 timer ved 37 ° C i 5% C02 at give tilstrækkelig modning til metafase af meiose jeg (mødte jeg) 15.
- Efter inkubering tilsættes med pipette samme apparatur som ovenfor, overføre oocyter i et center-godt orgel kultur skål indeholdende pre kølet minimum essential medier (MEM) samling medium i byens godt 700 µL og 500 µL H20 i den udvendige ring og Placer fadet i isbad i 7 min.
Bemærk: Det anbefales at pre chill MEM medier og center godt orgel kultur retter ved-20 ° C i mindst 20 min. før behandling af oocytter. - Fix oocyter ved at overføre dem ved hjælp af apparatet afpipetteres i en brønd af et klart glas spot plade der indeholder 400 µL af 2% PARAFORMALDEHYD i 1 X PBS i 20 min. ved stuetemperatur.
- Ved hjælp af samme afpipetteres apparater, overføre oocyter i en anden brønd på en spot plade der indeholder 400 µL blokerende løsning (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) og butik ved 4 ° C indtil klar til at behandle for immunfarvning.
Bemærk: til lagring af oocytter ved 4 ° C, dække spot glasplade med parafilm at forhindre fordampning. - Med samme pipette apparatur, overførsel oocytter til en ny brønd på en plet plade der indeholder 400 µL permeabilization løsning (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min. overførsel oocyter hurtigt gennem tre dråber af 400 µL blokerende løsning for at fjerne enhver resterende vaskemiddel.
Bemærk: En 9-godt klare spot glasplade fungerer godt for flytte grupper gennem flere behandlinger på en enkelt fad (trin 2,4-2,5). - Udføre de resterende immuncytokemi procedurer i en fugtig kammer, beskyttet mod lys ved stuetemperatur. Brug en mellemstore plastikbeholder foret med fugtige papirservietter og tildækkes med aluminiumsfolie.
- Med pipette apparatur, overføre oocytter til 30 µL blokerende løsning på låget af en 96-brønd plade og sted inden for den befugtet kammer i 10 min.
Bemærk: Dråber er placeret i de cirkulære indentions på pladen. - At mærke centromeres og spindel, med pipette apparatur, overføre oocytter til 30 µL blokerende løsning indeholdende anti-centromeric antigen (ACA, Crest) (1:30) og anti-acetyleret tubulin (1:1000) og Inkuber i mindst 1 time.
- Skyl oocyter ved overførsel gennem tre 30 µL dråber blokering løsning i 10 min.
- Med pipette apparatur, overførsel oocytter til en 30 µL dråbe blokerende løsning indeholdende sekundære antistoffer gratis til antistofferne anvendes ovenfor (-anti-humant IgG 1:200, anti-mus IgG 1:200) og Inkuber i 1 time.
- Gentag 3, 10-min føres trin i 30 µL blokerende løsning som beskrevet i trin 2.11.
- Overføre oocytter, ved hjælp af apparatet pipette til 3-5 µL montering medium indeholdende DAPI (5,9 µg/µL) på et glas objektglas.
- Sted 4 små dråber (størrelse af en pin head) vaseline på hjørnerne af cover slip at forhindre knusning af oocyter.
- Anbring forsigtigt dækslet slip Vaselin side ned i diaset.
- Forsegle coverslip kanter med klar neglelak og lade det tørre i 5 min.
- Gem dias ved 4 ° C, beskyttet mod lys, indtil behandlingen via Konfokal mikroskopi.
Bemærk: Sikre brydningsindekset af montering medium, og coverslip, kampe mikroskop mål bliver udnyttet. Anbefalede montering materialer har tidligere været beskrevet 15. - Billede oocyter ved hjælp af en 40-63 x mål på en Konfokal mikroskop, indfange små skridt (≤ 1 µm) i z-plan, optimeret til arbejde mål og billede metafase spindel hele regionen.
Bemærk: Sørg for at billedet alle 3 kanaler baseret på specifikke sekundære antistoffer bruges i trin 2.11. Billede gennemsnit ≥ 4 og et zoom af 3 er ideelle til tilstrækkelig opløsning. En 1 µm trin størrelse giver klare visualisering af mikrotubuli og kinetochores i mus oocyter. Proceduren for billedoptagelse vil variere fra mikroskop til mikroskop. Henvises til producenter Konfokal brugervejledningen til specifikke trin om, hvordan man konfigurerer indstillinger for mikroskopet. - Identificere kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil status ved hjælp af billedbehandling software efter trin 2,21-2.23 nedenfor.
Bemærk: De følgende trin beskriver denne procedure ved hjælp af billede Jørgensen (NIH) gratis downloades software, men alternative billedbehandlingsprogrammer kan bruges. Vedhæftet fil status typer har tidligere været defineret 16 . - Åbn billedet ved at trække filen til billede Jørgensen værktøj advokatstanden.
- I den åbnede z-serie, gøre alle kanaler synlige (DNA, kinetochore og spindel) ved at klikke på "Sammenflet kanaler", tilgængelig i rullemenuen "Image" under fanen "farve" sub.
- Bruger Skift i bunden af billedet, flytte gennem hver z-skive og bestemme kinetochore mikrotubulus vedhæftet fil. Detaljerede vedhæftede beskrivelser har tidligere været beskrevet 16
3. kromosom justering udfordring Assay
- Med pipette apparatur, som beskrevet i trin 2.3, overføre oocyter i en 100 µL dråbe milrinone-fri næringssubstratet under olie og inkuberes oocyter for 7 h at give tilstrækkelig modning til metafase af meiose jeg (mødte jeg) som tidligere beskrevet taktfast 2.3 17 .
Bemærk: Oocyt indsamling, mikroinjektion og modning procedurer blev skitseret tidligere 15. Henvise til den vedhæftede fil assay protokol i trin 2.1-2.2 for kontrol og for RNA mikroinjektion koncentrationer. - Med samme pipette apparatur, overførsel oocytter til et center-godt orgel kultur fad indeholdende 700 µL næringssubstratet indeholdende monastrol [100 µM] i centrum godt og 400 µL H20 i den omkringliggende ring og inkuberes ved 37 ° C i 2 timer.
- Skyl ud monastrol ved at overføre oocytter, med pipette apparatur som ovenfor, gennem tre dråber 100 µL CZB næringssubstrat, og derefter overføre oocytter til en ny center-godt orgel kultur parabol indeholdende 700 µL næringssubstratet + MG132 [5 µM] for 3 h i centrum ring. Tilføj 400 µL H20 til uden for ringen.
- Fix oocyter ved at overføre dem, ved hjælp af apparatet afpipetteres i en brønd af et klart glas spot plade der indeholder 400 µL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 min. ved stuetemperatur.
- Efter fiksering, overføre oocytter, ved hjælp af apparatet afpipetteres i en ny brønd af et klart glas spot plade der indeholder 400 µL blokerende løsning og opbevares ved 4 ° C indtil behandlet for immunfarvning.
Bemærk: til lagring af oocytter ved 4 ° C, dække spot glasplade med parafilm at forhindre fordampning. - Permeabilize og mærke oocyter via immuncytokemi, som beskrevet i trin 2.6-2.16.
- Billede oocyter bruger en 40-63 x mål på en Konfokal mikroskop, indfange < 1 µm trin i z-flyet og sørg for at billede metafase spindel hele regionen.
- For at identificere kromosom justering åbne status billedfiler ved hjælp af software til billedbehandling.
Bemærk: De følgende trin beskriver denne procedure ved hjælp af billede Jørgensen (NIH) gratis downloades software, men alternative billedbehandlingsprogrammer kan bruges. - Træk billedet ind i billedet J Kontrolpanel.
- I den åbnede z-serie, bruge værktøjet punkt (tilgængelig ved at klikke på ikonet punkt værktøj på billedet J kontrol bar) til at markere punkter i slutningen af hver spindel pole i deres respektive z-skive ved placere værktøjet over spindel pole i billedet og klikke på billedet. Tilføje disse point til regionen af interesse (ROI) manager ved at trykke på kommando + t på tastaturet.
- Bestemme de specifikke koordinater for hver af de positioner, der er angivet i trin 3.10 ved at fremhæve det særlige punkt i ROI manager og klikke på knappen foranstaltning. Dette vil give en resultater tabel, der indeholder x- og y-koordinaterne for hvert punkt. Disse vil være punkterne X1, Y1, og X1, Y2, henholdsvis.
- Næste, bestemme den sande Z koordinat. Dette gøres ved at multiplicere den skive antal specifikke z-skive i z-stakken som spindel-stang blev identificeret (dvs. skive #2 af 6) at hvert enkelt punkt i af stakken tykkelse (dvs. 1 µm) (eksempel: skær 2 x 1 µm = 2). Disse bliver for Z1 og Z2 punkter henholdsvis.
- Bestemme spindel længde ved hjælp af den pythagoræiske læresætning ligning (en2 + b2 = c2) bruger den tidligere definerede x, y og z koordinater fra trin 3.11-3.13. For hver spindel er den endelige længde lig med:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Bestemme spindel midzone. Denne beregnes som en halv længde af spindel. Brug stregværktøjet i billedet J, ved at klikke på ikonet linje i værktøjslinjen Billede Jørgensen, tegne en linje, der er fra én spindel pole til spindel midzone. Længden vil blive vist på billedet J værktøj advokatstanden.
- Bestemme kromosom Justeringsstatus ved vurderingen af kromosom afstand fra spindel midzone ved hjælp af værktøjet streg måling. Brug stregværktøjet findes ved at klikke på ikonet linje i værktøjslinjen Billede Jørgensen, trække en linje fra spindel midzone kromosom. Længden vil blive vist på billedet J værktøj advokatstanden. Kromosomer større end 4 µm fra spindel midzone betragtes unaligned 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter in vitro vil transskription høj kvalitet RNA have en A260/A280 ratio (1,8-2.2) og en A260/A230 forholdet ≥1.7 målt ved hjælp af et spektrofotometer. Billedet i figur 1 viser migrationen af in vitro-producerede RNA på en denaturering agarosegel efter elektroforese. Et band, der er smurt i mønster eller en stikprøve, der har flere mellemstore bands kan angive forurening eller forringelse af prøven. Alternativt, flere bands kan indikere at mRNA ikke er fuldstændig denatureret, eller start plasmid var ikke helt linearisering. MRNA vil køre større end forventet på grund af poly-adenylated halen indbygget i pIVT, som giver mulighed for stabile udtryk af mRNA in vitro. Efter mikroinjektion anbefales det at sikre ensartet injektionsvolumener og udtryk niveauer via fluorescerende mikroskopi. Billedet i figur 2 viser prophase jeg-anholdt oocyter ensartet injiceres med normal god landbrugspraksis. Konsekvent mikroinjektion teknik er kritisk for denne protokol. Billede analyse software, såsom billede Jørgensen, kan bruges til at validere udtryk niveauer for at sikre ensartethed og beherskelse af teknikken. Bemærk, at subcellulært lokalisering oplysninger kan indhentes imens tænkelig nemlig begge assays. For alle mikroinjektion eksperimenter vurdere virkningerne af et gen variant, bør wild-type gen blive injiceret i en delmængde af oocytter til at tjene som en kontrol. Dette tillader en at kontrollere for potentielle overekspression fænotyper af det menneskelige gen i en mus oocyt. PBS eller normal god landbrugspraksis for fluorophore-mærket konstruktioner, bør også blive injiceret i en undergruppe af oocytter til kontrol for mikroinjektion-induceret fænotyper. For konstruktioner uden en fluorescerende tag, kan normal god landbrugspraksis mRNA være co injiceres at sikre tilstrækkelig mikroinjektion. Hvis Co indsprøjtning to eller flere konstruktioner samtidigt være sikker på at øge mRNA koncentration, således at den endelige løsning indeholder 500 ng/µL af hver mRNA.
Kolde-stabil mikrotubulus analysen giver et værdifuldt redskab til vurdering af vedhæftet fil status for kinetochores til mikrotubuli. Figur 3 er en z-projektion af en Konfokal mikroskop billede af en metafase jeg oocyt. Denne oocyt blev udsat for kolde medier behandling til depolymerize alle mikrotubuli, der ikke havde knyttet til kinetochores. Oocytter, der er blevet behandlet for en tilstrækkelig tid vil indeholde mikrotubulus fibre ikke knyttet til kromosomer (for kort resultater i alt for mange fibre) eller manglende fibre alle sammen (for lang resultater i nogen spindel struktur) og det er anbefalet at disse oocyter ikke anvendes i analysen. Metafase af meiose det, der er fælles for oocyter indeholder separate eller sidelæns vedlagte kinetochores, det anbefales derfor at en kontrolgruppe bruges i enhver vedhæftet fil undersøgelse. I gennemsnit vildtype oocyter vil indeholde 5-10% af kinetochores på MI vil ikke endnu være stabilt vedlagte 19. Det er væsentligt, at alle oocyter på det samme Stadium for analyse af kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil status. For at sikre det eksperimenterende og kontrol grupper modne med lignende tidsskalaer er det anbefales at vurdere cellecyklus kinetik. For at udføre denne analyse, bør en delmængde af kontrol og eksperimentelle oocyter modnet og visualiseret live under time-lapse microcopy. Brugen af milrinone giver oocyter skal synkroniseres i prophase af meiose, således at overgang til medier mangler milrinone med tillade genoptagelsen af meiose på samme tid 20. Oocytter fra både kontrol og eksperimentelle grupper bør presse en polar krop, vejledende nå metafase af meiose II (mødte II), på samme tidspunkter. Hvis live-celle mikroskopi ikke er tilgængelig, oocyter kan være modnet til Met jeg (7 h) og mødte II (16 h), fast, og farves at påvise DNA og mikrotubuli som beskrevet tidligere. På Met I og mødte II en tønde-formet, bipolar spindel skal være synlige. I kontrol oocytter, skal kromosomer justeres på metafase plade. Justeringen af kromosomer vil variere i eksperimentelle grupper afhængig af variant påvirker, men kromosomer bør kondenseret og knyttet til mikrotubuli med størstedelen af kromosomer centralt på spindlen. Et tilsvarende antal oocyter bør have nået meiose II i kontrol og eksperimentelle grupper. For at mindske vanskeligheder ved fastsættelsen af vedhæftet fil optimeret imaging oocyter med små skridt i z-plan, status anbefales til det specifikke arbejde mål. Analyse vil inddrage visning z-skiver individuelt og i flettede indstillinger til at bestemme, hvilken stang, der knyttet mikrotubuli udspringe fra. Figur 3B viser eksempler på unormal kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer. Vist er en bivalent i som eneste søster kinetochore par er knyttet til en spindel mikrotubulus, defineret som en ingen tilknytning. Næste, en syntelic vedhæftet er vist i hvilken begge søster kinetochore par er knyttet til den samme spindel pol. Endelig en merotelic vedhæftet er vist i hvilken én søster kinetochore er fastgjort til begge spindel polakker mens andre søster kinetochore parret er knyttet til en enkelt spindel pole.
Billeder i figur 4 illustrerer den progressive forventede DNA og spindel konfigurationer som en bevæger sig gennem trinnene til kromosom justering udfordring assay. I denne analyse er det kritisk, at forskellige eksperimentelle grupper fremskridt gennem meiose med lignende kinetik. Som beskrevet tidligere er det anbefaler for at fuldføre cellecyklus kinetik analyser inden udførelse udfordring assay. I denne analyse vurderes evne til oocyter med held rette unormal kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer. For at teste dette, oocyter er først modnet til Met jeg at tillade kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer til at blive etableret. Næste, oocyter inkuberes i monastrol, og Kinesin 5 (EG5)-hæmmer, der kollapser den bipolare spindel til en monopolære spindel 21. Generation af en monopolære spindel inducerer 100% forkert mikrotubulus-kinetochore vedhæftede filer. Monastrol-hæmmer er derefter vaskes ud for at tillader opsving. I løbet af tilbagebetalingsperioden oocyter regenerere en bipolar spindel og forsøge at rette mikrotubulus vedhæftede filer. Tilsætning af proteasom hæmmer MG132 forhindrer anaphase debut. Som et kontrolelement, en lille delmængde af oocytter fra hver eksperimentelle gruppe kan fastsættes på hvert trin i protokollen (mødte jeg, monastrol behandlet, bogføre recovery) at sikre, at alle grupper er at reagere på behandlinger, og i samme omfang. Metafase jeg oocyter bør indeholde en tønde-formet bipolar spindel med kromosomer justeret på den metafase plade. Oocytter behandlet med monastrol bør indeholde en monopolære spindel med kromosomer orienteret omkring den enkelt pole. Gendannede oocyter bør igen indeholde en tønde-formet bipolar spindel. Kromosom justering er defineret som enhver kromosomer mere end 4 μM fra spindel midzone 22. Det er nyttigt at plette oocyter at påvise DNA og kinetochores for at fastslå, hvis begge kinetochores er uden for denne centrale zone, da dette kan være vanskeligt at bestemme ved hjælp af kun DNA påvisning.
Figur 1. Denaturingagarose gelelektroforese af RNA. RNA kvalitet og størrelse kan vurderes ved elektroforese på en denaturering agarosegel. En denaturering gel anbefales at forhindre sekundær struktur dannelse. Lane 1 indeholder en RNA molekylvægt markør. Lane 2 er en RNA prøve. Bemærk, at RNA vil køre større end beregnet på grund af den indbyggede polyA hale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Validering oocyt mikroinjektion. Fluorescerende mikroskopi kan bruges til at validere vellykket oocyt mikroinjektion og udtryk. Prophase jeg-anholdt oocyter microinjected med normal god landbrugspraksis er vist efter natten udtryk for konstruktionen. Dette billede blev opnået ved hjælp af Invitrogen EVOS FL Auto imaging system udstyret med normal god landbrugspraksis lys kube. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Vurdering af kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer. (A) A repræsentative z-projektion af en kold-behandlede mødte jeg oocyt. Spindel (grøn), kinetochores (rød) og DNA (blå) er vist. Feltet angiver den optiske zoom-regionen. Pilespidser betegne udgangen på vedhæftede filer af kinetochores til mikrotubuli af en enkelt bivalent. Skalalinjen er 10 µm til spindel, kinetochore, DNA og Sammenflet kanaler. Skalalinjen for optisk zoom er 5 µm. (B) eksempler på unormal kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil typer i mus oocyter. Pilene angiver kinetochore-mikrotubulus vedhæftede fil sites. Skalalinjen er 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kromosom justering udfordring assay. Flowdiagram af proceduren med repræsentative z-fremskrivninger af oocytter på hvert trin. Oocytter er først modnet til metafase af meiose jeg (mødte jeg), derefter overført til en ny parabol indeholdende monastrol for 2 h til at fremkalde monopolære spindel dannelse. Næste oocyter er tilladt at inddrive i modning medium suppleret med en proteasom-hæmmer (MG132) at forhindre anaphase debut for 3 h. Når gendannede oocyter er fast, mærket for spindel (grøn), kinetochores (rød) og DNA (blå) og afbildet via Konfokal mikroskopi til at bestemme Justeringsstatus. Linjer angiver længden af spindel (40 µm) og spindel midzone (20 µm) bestemmes ved hjælp af pythagoræiske læresætning ligning. Pilene angiver punkt værktøj positioner på hver pol. Enhver kinetochores > 4 µm fra spindel midzone betragtes unaligned. Stjerne angiver unaligned kromosom (5,6 µm fra midzone). Skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den hurtige og stigende identifikation af menneskers genetiske varianter forbundet med sygdom, er det vigtigt, at systemerne er etableret for at evaluere deres biologiske betydning. Forstå protein funktion i menneskelige meiose skaber særlige udfordringer, fordi menneskelige oocyter er dyrebare og sjældne og menneskelige sædceller er ikke indstillet til genmanipulation. Musen oocyter er et pattedyr modelsystem værdifulde for evaluering meiotiske menneskegener funktion 10,23. Denne model omgår anførelsen af ved hjælp af menneskelige æg mens giver en let tilgængelig kilde til billig, manipulerbare oocytter, der undergår meiose svarende til menneskelige kønsceller, mens at være nyttige for at forstå hvordan genetiske varianter kan påvirke kvinde frugtbarhed.
Fordi disse metoder beskæftiger Ektopisk udtryk for den menneskelige protein i mus oocyter via mikroinjektion, er det afgørende at først oprette en koncentration af kontrol, wild-type RNA, der ikke ændrer meiotiske modning. Det anbefales at meiotiske modning kinetik er overvåget (nuclear kuvert opdeling, polar body ekstrudering) i kontrol oocyter baseline parametre, samt vurderingen af spindel og kromosom morfologi. Derudover sikrer ensartet mikroinjektion diskenheder er kritisk at sammenligne grupper. Herunder en fluorescerende tag på gen af interesse kan forenkle denne tekniske udfordring. Teknikker til mastering oocyt mikroinjektion har været tidligere dokumenteret 15. Visualisering af injicerede oocyter under et fluorescens mikroskop eller bestemmelse af protein udtryk via vestlige skamplet er også værdifulde værktøjer for at bekræfte konsekvent injektion koncentrationer.
Fordi fejl i kromosom adskillelse i pattedyr oocyter er en førende årsag til embryonale aneuploidi og graviditet tab5, analyse af kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer giver et værdifuldt redskab til at vurdere et gen af interesse påvirker kromosom adskillelse (dvs. forkert vedhæftede filer vil medføre mis adskillelse). En 10 min eksponering kølet medier er tilstrækkelig til at depolymerize mikrotubuli, der ikke har foretaget en kinetochore-mikrotubulus vedhæftet fil, tillade visualisering af stabil vedhæftede filer via konfokalmikroskopi 24. For denne analyse er det vigtigt at ikke chill over oocytter, da dette vil føre til depolymerization af stabil mikrotubuli. Derudover er optimering af farvning procedurer nøglen til visualisering af kinetochore og mikrotubulus strukturer. At sikre tilstrækkelig billedopløsning for analyse, små skridt (≤ 1 μm) i z-plan ved hjælp af en 40 x-63 x mål skal registreres, og får billeder gennem hele spindel struktur til at sikre alle vedhæftede filer er synlige. Bemærk, at det er almindeligt at have separate kinetochores under prometaphase af meiose jeg 25.
Kromosom justering udfordring assay er nyttige til vurdering af gevinst eller tab af funktion varianter. Gevinst af funktion varianter kan være svært at vurdere, fordi musen oocytter fra unge hunner har lave niveauer af aneuploidi. Denne analyse overvinder denne forhindring ved at generere en situation, hvor oocyt skal rette eksperimentelt inducerede forkert kinetochore-mikrotubulus vedhæftede filer. Om oprettelse af et tidspunkt, hvor kontrollen oocyter indeholde 1-2 fejljusteret kromosomer efter recovery giver en kvantificerbar scenario for at afgøre, hvorvidt en mutant giver øget tilpasning effektivitet (dvs. bedre tilpasning kapaciteter vil beskytte euploidy). Til kvantificering af kromosom forskydning, en tidligere etableret protokol i hvilke kromosomer, der er større end 4 μm fra spindel midzone karakteriseres som unaligned kan være brugt 18.
For at studere tab af funktion varianter, er yderligere eksperimentelle betingelser nødvendige på grund af den endogene homolog inden for undersøgelse system. En måde at afhjælpe dette problem er at bruge generere en knockout musemodel af varianten af interesse. Fremkomsten af skarpere/Cas9 systemet kan give en hurtig måde at generere sådanne knockouts 26. Alternativt, hvis en knockout model ikke er en mulighed, kunne klassisk knockdown teknikker såsom Co indsprøjte antisense morpholino oligonukleotider eller små interfererende RNA'er ansat. Opmærksomhed til sekvens design er dog forpligtet til at undgå enhver potentiel interferens med den microinjected variant under undersøgelsen. For eksempel, kunne morpholino oligonukleotid designes til at binde i 5' utranslaterede regionen (5' UTR) af mus-genet, der ikke er inkluderet i den menneskelige mRNA variant indført via mikroinjektion. Hvis bruger små indblanding kunne RNA'er en målrette en ikke-homologe sekvens region eller indføre tavse punktmutationer i det menneskelige gen, der ville unddrage målretning. Imidlertid kan har den endogene protein kopi stadig til stede efter udtryk for varianten være oplysende, som mange varianter findes i heterozygous tilstand i det menneskelige genom.
Endelig, selv om ikke beskrevet i denne protokol, kromosom aneuploidi vurdering kan let vurderes i mødte II æg som den endelige assay i pipeline for menneskelige variant analyse. En detaljeret beskrivelse af denne i situ kromosom sprede protokollen har tidligere beskrevet 15. Kort, microinjected oocyter er modnet i vitro indtil de når mødte II scenen, efter behandling med en meiotiske spindel-depolymerizing agent før fiksering. Kinetochore og kromosom farvning som beskrevet her mulighed for vurdering af kromosom indhold.
Mens musen oocyter give et værdifuldt redskab for studiet af proteiner afgørende for kvindelige meiose nogle begrænsninger at model exist. Overekspression af proteiner kan forurolige meiotiske modning og derfor et RNA-koncentrationen kan ikke eksisterer der ikke inducerer en fænotype. Derudover kan endogene mus homolog interferere med lokalisering af eksogene humane proteiner. Generation af knockout musemodeller giver en løsning på dette problem; dog kan dette ikke være muligt i alle situationer. En alternativ fremgangsmåde ville være at nedbryder mus protein af co indsprøjte RNAi eller morpholino oligonukleotider designet til ikke målet eksogene RNA og protein. Endelig er det vigtigt at bemærke, at mens mange proteiner er homologe mellem mennesker og mus, forskelle må findes, fører til forskelle i lokalisering og funktion, der kunne udelukke denne form for cross-arter analyse. Som genetisk manipulation værktøjer som Cas9-genom redigering27 bliver billigere og mere fælles-sted, denne protokol kan udvikle sig til at banke, humaniseret mus linjer i stedet for at påberåbe sig mikroinjektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskning tilskud fra American Society for Reproductive Medicine og Charles og Johanna Busch Memorial Fund på Rutgers, The State University i NJ til K.S. A.L.N. blev støttet af en bevilling fra N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
