Summary
인간의 질병과 관련 된 유전자 변종 발견 될 하기 시작, 그것은 점점 더 빠르게 그 확인 된 이체의 생물학적 의미를 평가 하는 시스템을 개발 하는 것이 중요 되고있다. 이 프로토콜에는 인간 유전자 기능 여성 감수 분열 동안 마우스 oocytes를 사용 하 여 나로 평가 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
배아 이수성은 인간에서 불모의 주요 유전 원인입니다. 이러한 이벤트의 대부분 여성 감수 분열 동안 시작 하며 나이 혼자 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측은 긍정적으로 산 모 나이 상관, 이기는 하지만. 따라서, 유전자 변형 oogenesis 동안 잘못 된 염색체 분리에 대 한 계정 수 있습니다. 인간의 oocytes에 대 한 액세스는 제한 된 연구 목적을 위해, 분석 실험의 시리즈 마우스 oocytes를 사용 하 여 내가 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 공부에 개발 되었다. 첫째, 유전자 및 유전자 변형 관심의 메신저 RNA (mRNA) 의향 나 체포 마우스 oocytes에 microinjected 있다. 후 식에 대 한 시간을 허용, oocytes 동기적으로 감수 분열을 완료 meiotic 성숙에 출시 되 나. 형광 기자, 녹색 형광 단백질 (Gfp) 등의 순서로 mRNA에 태그를 추가 하 여 인간의 단백질의 지역화 phenotypic 변경 뿐만 아니라 평가 수 있습니다. 예를 들어 이득 또는 기능의 손실 meiotic 오류를 해결 하기 위해 유전자 제품에 도전 하는 실험 조건을 설정 하 여 조사 수 있습니다. 이 시스템은 유리한 oogenesis 동안 인간의 단백질 기능을 조사, 결과의 적절 한 해석 이루어져야 한다 단백질 표정은 내 생 수준에서 그에 주어진 고 (즉, 절에 대 한 제어 하지 않는 한 밖으로 또는 아래로), murine homologs 시스템에 있습니다.
Introduction
불 임은 재생산 나이 1에서 거의 절반 추구 치료 2인간의 인구의 10-15%에 영향을 미치는 조건이 다. 많은 경우 multifactorial 및 불 임 증의 병 인은 다양 한 인간에서 가장 흔한 유전 이상이 배아 이수성 3입니다. 이수성은 염색체 셀에 올바른 수의 편차 (이득 또는 손실)로 정의 됩니다. 인간 태아의 이수성의 현상 일반적 이며 진보 된 임산부 나이 4,5증가. 이 전략 증가 주입 속도, 낮은 유산 률과에 대 한 짧은 시간에 결과 때문에 자 궁 전송만 chromosomally 정상 (euploid) 배아 선택의 혜택을 강조 하는 4 개의 무작위 통제 실험 임신 6,7,,89를 달성. 따라서, 도움된을 재생산에 중요 한 의미를 가질 수 있습니다 인간의 이수성의 병 인을 이해.
Aneuploidies에 대 한 사전 주입 유전자 검사 하는 것이 불 임 치료에 도움이 있지만 aneuploidies 시작 하는 방법에 대 한 철저 한 이해는 여전히 부족 한. 그러나 Meiotic aneuploidies (생식 체 생산 동안 유래)와 산 모 나이,, 일부 여성 현재 배아 이수성 속도 그들의 주어진된 나이 4에 대 한 평균 속도에서 이탈 하는 긍정적인 상관관계가 있다는 것을 널리 받아들여진다. 이러한 경우는 혼자 나이 항상 aneuploid 배아 생성의 위험 예측 하지 것이 좋습니다. 다른 요인 배아 이수성, 유전자 변형 등의 위험 증가에 역할을 재생할 수 있습니다.
빠르게 meiotic 유전자 기능을 평가 하는 시스템 설계 조사 oocyte 감수 분열 동안 이수성을 유전자 이체의 잠재적인 기여의 핵심 요소가입니다. 윤리적 제약 및 제한 된 액세스, 인간의 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하는 실용적입니다. 마우스 oocytes를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 있으며 여기 감수 분열 동안 인간 유전자 기능을 평가 하기 위해 분석 실험의 시리즈 나 설명. 관심사의 유전자 변형에 대 한 코딩 하는 메신저 RNA (mRNA) microinjecting에 의해 마우스 달걀에서 인간 단백질의 지역화 시각 고 수 경우는 야생 형 및 돌연변이 인간 단백질의 소성 식에서 결과 확인 하는 데 사용 이수성 이어질 수 있는 phenotypic 변경 Kinetochore 그리고 중요 한 것은 감수 분열 나의 분열에서 염색체 맞춤 지원 못하는 동생에 게 부적 절 한에 연결 하는 microtubules에 증가 포함 하는이 고기, 이득 및 기능의 상실을 조사 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 도전 oocyte 감수 분열의 키 이벤트와 같은 특정 실험 조건 설정 하 여 유전 이체는 건물 및 염색체 정렬 10스핀 들.
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Protocol
1. 분자 클로닝
- 관심과 전사 (pIVT) 벡터11 생체 외에서 플라스 미드의 유전자의 전체 길이 코딩 시퀀스를 가져옵니다.
참고: 전장 cDNA 클론 상업적으로 다양 한 공급 업체에서 제공 또는 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR)을 통해 생성 될 수 있습니다. 생물 공학 정보 (NCBI) 온라인 리소스에 대 한 국립 센터는 뉴클레오티드에서 유전자에 대 한 사본을 시퀀스를 제공 합니다 및 명시적 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스. 단백질의 용이성에 대 한 시각화 및 분석 식 수준, 녹색 형광 단백질 (Gfp)를 융합 또는 다른 적합 한 형광 태그의 복제 전략에 원하는 수 있습니다. - 유효한 복제 전략을 사용 하 여, pIVT의 다중 복제 영역에 관심사의 유전자의 코딩 순서를 삽입 합니다. 분자 클로닝의 자세한 설명 및 필요한 단계는 이전 설명된 12왔다 합니다.
참고: 유전자 융합 제품 생성 해야 하는 복제를 사용 하는 경우 적절 한 독서 프레임입니다. - 순서를 올바른 유전자 삽입, 적절 한 프레임에 융합, 그리고 아무 중 합 효소 유도 점 돌연변이 생성 된 Globin 뇌관을 사용 하 여 구문.
참고: 생어 DNA 시퀀싱 장비를 사용할 수 없는 경우 많은 기업 저가 DNA 시퀀싱 옵션을 제공 합니다. - 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 (Snp) 또는 삽입/삭제 (INDELS) 생성 하는 경우 DNA를 mutagenize. DNA mutagenesis 단계 1.5-1.7 아래에 설명 되어 있습니다. 야생-타입 구문에 대 한 선형화 단계 1.7 진행.
- Mutagenesis 뇌관을 디자인 하 고 제조 업체의 프로토콜 당 돌연변이 구문을 생성 하 mutagenesis PCR 반응 완료. 사이트 감독 mutagenesis PCR 중재는 앞에서 설명한 13되었습니다. 또한, 많은 회사는 프로토콜을 포함 하는 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 제공 합니다.
- Mutagenized DNA 세균성 호스트 변환. 분리 하 고 순화 하는 플라스 미드.
참고: 많은 회사 확인 키트 쉽게 격리 하 고 플라스 미드 DNA를 정화 하는 데 사용할 수 있습니다. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. 대장균같은 그램 음성 세균성 긴장을 사용 하는 경우 독을 제거 하는 키트를 사용 하는 것이 좋습니다. - 표준 생어 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 원하는 SNP 나 INDEL의 소개를 확인 하는 세균성 transformants에서 고립 된 DNA 순서.
- 순화 된 DNA의 단일 제한 효소 소화를 사용 하 여 최종 제품 선형화
참고: pIVT 벡터에는 여러 단일 효소 Addgene 14에 플라스 미드 지도에 나열 된 사이트 컷이 포함 되어 있습니다. - 제품 agarose 젤 전기 이동 법을 통해 선형 인지 확인 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법에 대 한 방법론 이전 정의 14되었습니다.
참고: 모든 나머지 단계를 사용 하 여 장벽 (필터) 피펫으로 팁과 RNase 자유 자재 안정적이 고 높은 품질 RNA의 생산을 위해. - 유효성이 검사 된 DNA 정리 프로토콜 또는 키트를 사용 하 여 소화 제품을 정화 하 고 30 µ L RNase/DNase 무료 물에 elute.
참고: 열 기반 장비 높은 품질을 위해 권장 하는 실리 카 매트릭스 스핀 DNA 정화. 그에 따라 제조 업체 프로토콜을 따릅니다. - 시험관에서 DNA 제조 업체의 프로토콜을 따르고 T7 중 합 효소를 사용 하 여 녹음.
- 정화 하 고 RNA RNase/DNase 무료 물 실리 카 매트릭스의 스핀 열 기반 핵 산 정화 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 30 µ L에 elute.
- 변성 agarose 젤 전기 이동 법 최종 RNA 제품 크기를 확인 하는 포름알데히드를 사용 하 여 수행 합니다. 1.13-1.22 14아래 단계를 참조 하십시오. (그림 1)입니다.
- 해산 때까지 물 72 mL에 1 g agarose를가 열 하 여 젤을 준비 다음 60 ° c에 냉각
- 10 X MOPS 0.4 M MOPS (pH 7.0), 아세트산 나트륨 0.1 M, 0.01 M EDTA를 추가 하 여 버퍼를 실행을 준비 합니다.
- 10 X MOPS 실행 버퍼, 그리고 37% 포름알데히드 (12.3 M)의 18 mL 냉각된 agarose 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
- 젤 젤 형성 컨테이너에 agarose 솔루션을 붓는 의해 계급. 충분히 10 µ L 큰 빗을 사용 합니다. 젤 설정 터치 회사를 후 부드럽게 빗을 제거 합니다.
- 젤 전기 이동 법 탱크에 조립 하 고 충분 한 1 X MOPS 버퍼, 실행 젤 완전히 덮여 보장을 추가 합니다.
- 0.5 X 양의 포름알데히드 포함 된 로드 염료에 RNA의 1 µ g을 추가 하 여 RNA 샘플을 준비 합니다.
- 10 µ g/mL의 농도에서 RNA 솔루션 ethidium 평범한 사람을 추가 합니다.
- 5 분 동안 70 ° C에서 RNA 샘플 솔루션 변성
- 살 균을 사용 하 여, 10 µ L 필터 팁, 분자량 마커의 5 µ L을 로드 하 고 RNA의 5 µ L 젤의 별도 우물으로 sample(s) 될 때까지 염료가 젤의 길이의 2/3 이상 5 V/cm에 electrophorese.
- UV 트랜스 조명 기에 젤에 RNA를 시각화 합니다. RNA 분자 무게 마커를 비교 하 여 올바른 크기 인지 확인 합니다.
- 농도 및 RNA의 순도 측정, UV 분 광 광도 계에 무 균 10 µ L 필터 팁을 사용 하 여 순화 된 RNA의 1.2 µ L를 전송 합니다.
참고 높은 품질 RNA A260/280 (1.8-2.2)와 260/230의 흡 광도 비율 있어야 (> 1.7) 각각. - 살 균 0.5 µ L 원심 분리기 튜브 (3-5 µ L/튜브)로 10 µ L 필터 팁, aliquot 잔여 순화 된 RNA를 사용합니다. Microinjection에 대 한 준비까지-80 ° C에서 튜브를 저장 합니다.
참고: 500 ng / µ L의 최종 주입 농도 최적의 출발점입니다. 1:2 RNase H20 microinjection microinjection 피 펫에서 RNA의 끈 적 거 림을 줄이기 위해 이전 무료 RNA를 희석 하는 것이 좋습니다.
2. kinetochore-Microtubule 첨부 파일 분석 결과
- Microinjection에 대 한 동등한 그룹으로 oocytes를 나눕니다.
참고: Oocyte 수집, 전송, microinjection, 및 meiotic 성숙 설명 하고있다 정돈에 자세히 이전 15. - 실험적인 mRNA와 하나의 그룹과 WT 제어 및 PBS 또는 Gfp 다른 그룹 microinject mRNA.
참고: 500 ng / µ L 10권장된 주입 농도 이다. 주입 양을 제어 하는 picoinjector는 사용할 수 있습니다. 5-10 pL의 주입 볼륨 15것이 좋습니다. - 손 또는 입 어디 유리 플라스틱 개방 운영된 pipetting 기구는 약간 사용 하는 oocyte (100-150 µ m), 페 트리 접시에 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭으로 전송 oocytes의 직경 보다 큰 덮여 배아 품질 미네랄 오일 그리고 5% C02 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록에서 37 ° C에서 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 15.
- 위의 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 부 화 후 잘 센터에 미리 냉장된 최소 필수 미디어 (MEM) 컬렉션 매체의 700 µ L 500 µ H L20 외부 반지에서 포함 된 센터 잘 기관 문화 접시에 oocytes를 전송 및 7 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다.
참고: 미리 진정 MEM 미디어 센터 oocytes의 치료 전에 적어도 20 분 동안-20 ° C에서 기관 문화 요리 잘 하 추천 된다. - 실 온에서 20 분에 대 한 1 X PBS에 2 %paraformaldehyde 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여는 oocytes를 수정.
- 플라스틱 장치, 전송에 oocytes 다른 잘으로 400 µ L 차단 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.01% 트윈 20 + 0.02% 할머니3) 및 저장소를 포함 하는 자리 접시에 동일을 사용 하 여 immunostaining을 처리할 준비가 될 때까지 4 ° C에서.
참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장. - 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여, 전송 oocytes 자리에 새로운 우물을 포함 400 µ L permeabilization 솔루션 (PBS + 0.3 %BSA + 0.1 %TritonX-100 + 0.02% 할머니3) 플레이트와 3를 통해 신속 하 게 전송 oocytes 20 분에 대 한 실 온에서 품 어 400 µ L의 삭제 차단 어떤 잔류 세제를 제거 하는 솔루션.
참고: 9-잘 분명 유리 자리 접시 (2.4-2.5 단계) 한 접시에 여러 치료를 통해 그룹을 이동 하기 위한 잘 작동 합니다. - 실 온에서 빛 으로부터 보호 습도 챔버에 나머지 immunocytochemistry 절차를 수행. 중간 크기의 플라스틱 용기를 사용 하 여 젖은 종이 수건 및 알루미늄 호 일 커버 늘어서 있다.
- 30 µ L oocytes 전송 피 펫 장치를 사용 하 여 10 분 동안 습도 챔버 내에서 장소와 96 잘 접시의 뚜껑에 솔루션을 차단.
참고: 방울은 접시에 원형 들여쓰기에 배치 됩니다. - Centromeres 및 스핀 들, 피 펫 장치를 사용 하 여, 30 µ L에 oocytes를 전송 차단 항 centromeric 항 원 (ACA, 크레스트)를 포함 하는 솔루션 (1:30) 및 안티 acetylated tubulin (1:1000) 및 적어도 1 시간에 대 한 품 어.
- 10 분에 대 한 솔루션을 차단의 세 가지 30 µ L 획득 옮겨서 oocytes를 씻어.
- 피 펫 장치, 전송 oocytes를 사용 하 여 30 µ L을 포함 하는 2 차 항 체 항 체 (반대로 인간 IgG 1: 200, 반대로 마우스 IgG 1: 200) 위에 사용 무료 차단 솔루션의 드롭하고 1 시간에 품 어.
- 30 µ L 3, 10 분 헹 구는 단계를 반복 단계 2.11에에서 설명 된 대로 솔루션을 차단.
- Oocytes, 3-5 µ L 중간 포함 DAPI 장착으로 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 (5.9 µ g / µ L) 유리 현미경 슬라이드에서.
- 석유 젤리의 4 작은 방울 (핀 머리의 크기)는 oocytes의 분쇄를 방지 하기 위해 커버 슬립의 모서리에 놓습니다.
- 슬라이드에 커버 슬립 석유 젤리 측면 아래로 부드럽게 장소.
- 가장자리를 매니큐어를 취소 하 고 5 분 동안 말리는 것을 허용 하는 coverslip 인감.
- 4 ° C, confocal 현미경 검사 법을 통해 처리까지 빛에서 보호에 슬라이드를 저장 합니다.
참고: 설치 매체 및 coverslip, 일치의 굴절률 널리 사용 되 고 현미경 목표를 확인 합니다. 자료 이전 되었습니다 권장된 장착 설명 15. - Oocytes confocal 현미경, 작은 단계를 캡처에 40-63 x 목표를 사용 하 여 이미지 (≤ 1 µ m) z-평면에서 작업 목적과 이미지 분열 스핀 들의 전체 영역에 대 한 최적화.
참고: 단계 2.11에서에서 사용 하는 특정 이차 항 체에 따라 모든 3 채널의 이미지를 확인 하십시오. 평균 ≥ 4와 3의 확대/축소 하는 이미지는 적절 한 해상도 이상적입니다. 1 µ m 스텝 크기 microtubules 마우스 oocytes에서 kinetochores의 명확한 시각화를 제공합니다. 이미지 캡처를 위한 절차 현미경 현미경에서 달라질 수 있습니다. 현미경 설정을 구성 하는 방법에 대 한 특정 단계에 대 한 제조 업체 confocal 사용자 가이드를 참조 하십시오. - 다음 단계 2.21-2.23 아래 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 kinetochore microtubule 첨부 파일 상태를 식별 합니다.
그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 첨부 파일 상태 유형 되었습니다 이전 16 정의. - 오픈 이미지 이미지 J 도구 모음에 파일을 드래그 하 여.
- 열린된 z 시리즈에서 모든 채널 표시 (DNA, kinetochore, 및 스핀 들) "병합 채널", "이미지" 메뉴에서 사용할 수 있는 "색상" 하위 탭에서 클릭 하 여 확인 합니다.
- 이미지의 하단에 토글을 사용 하 여, 각 z 슬라이스를 통해 이동 하 고 kinetochore microtubule 첨부 파일을 결정 합니다. 설명 이전 되었습니다 자세한 첨부 파일 설명 16
3. 염색체 맞춤 도전 분석 결과
- 2.3 단계에서 설명한 대로 피 펫 장치를 사용 하 여, 기름에서 milrinone 무료 문화 매체의 100 µ L 드롭에 oocytes 전송과 감수 분열의 분열에 충분 한 성숙 수 있도록 7 h oocytes를 품 어 난 (내가 만난) 2.3 17 단계에서 앞에서 설명한 .
참고: Oocyte 컬렉션, microinjection, 및 성숙 절차 설명 했다 이전 15. 2.1-2.2 컨트롤에 대 한 단계와 단계에서 RNA microinjection 농도 대 한 첨부 파일 분석 결과 프로토콜을 참조 하십시오. - 동일한 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 oocytes 센터 잘 기관 문화 접시 포함 700 µ L 문화 매체 센터 잘하고 400 µ L H20 주변 링에서 monastrol [100 µ M]를 포함 하 고 2 h 37 ° C에서 품 어.
- Monastrol oocytes를 100 µ L CZB 문화 매체의 3 드랍 스를 통해 위의 피 펫 장치를 사용 하 여 전송 하 여 밖으로 헹 구 고 700 µ L 문화 매체 + MG132를 포함 하는 새로운 센터 잘 기관 문화 접시 oocytes 전송 [5 µ M] 센터에서 3 h 링입니다. 외부 반지에 400 µ H L20을 추가 합니다.
- 피 펫 장치를 사용 하 여 실 온에서 20 분에 대 한 PBS에 400 µ L 2 %paraformaldehyde 포함 하는 투명 유리 자리 격판덮개의 우물에 그들을 전송 하 여는 oocytes를 수정.
- 고정, 후에 oocytes, 400 µ L을 포함 하는 투명 유리 자리 판의 새로운 우물으로 피 펫 장치를 사용 하 여 차단 솔루션 및 저장소까지 4 ° C에서 immunostaining에 대 한 처리.
참고:에 대 한 4 ° C, parafilm 증발을 방지 하기 위해 커버 유리 별색 플레이트에 oocytes를 저장. - Permeabilize 및 단계 2.6 2.16에에서 설명 된 대로 immunocytochemistry 통해 oocytes를 레이블.
- Oocytes는 confocal 현미경에 40-63 x 목표를 사용 하 여, 캡처 이미지 < 분열 스핀 들의 전체 영역을 이미지를 확인 하 고 z-평면에서 1 µ m 단계.
- 염색체 맞춤 식별 하려면 상태 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다.
그러나 참고: 다음 단계 이미지 J (NIH) 무료 다운로드할 수 있는 소프트웨어를 사용 하 여이 절차를 설명 합니다, 그리고, 대체 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. - 이미지 J 컨트롤 패널에 이미지를 드래그 합니다.
- 열린된 z 시리즈에서 (이미지 J 컨트롤 바에는 도구 아이콘을 클릭 하 여 사용 가능) 포인트 도구 사용 하 여 이미지에서 스핀 들 극 위에 도구를 배치 하 고 이미지를 클릭 하 여 그들의 각 z 슬라이스 각 스핀 들 장 대의 끝에 포인트를 표시. 명령 + t를 눌러 키보드에 관심 (ROI) 관리자의 지역에이 포인트를 추가 합니다.
- 각 위치 단계 3.10에서에서 ROI 관리자에서 특정 시점을 강조 표시 하 고 측정값 단추를 클릭 하 여 설정에 대 한 특정 좌표를 결정 합니다. 이 결과 제공할 것입니다 x 테이블을 포함 하 고 각 포인트에 대 한 y 좌표. 이들은 각각 X1, Y1, X1, Y2, 포인트를 될 것입니다.
- 다음으로, 진정한 Z 좌표를 결정 합니다. 이 스핀 들 극 확인 되었다 z 스택의 특정 z 슬라이스 조각 수를 곱하여 이루어집니다 (즉, # 2의 조각 6) 각 개별 포인트에 있는 스택 두께 (즉, 1 µ m)에 의해 (예: 슬라이스 2 x 1 µ m = 2). 이들은 각각 Z1 그리고 Z2 포인트 될 것입니다.
- 피타고라스의 정리 방정식을 사용 하 여 스핀 들 길이 결정 (2 + b2 c2를 =) 사용 하 여 이전에 정의 된 x, y 및 z 좌표 단계 3.11 3.13에서에서. 각 스핀 들에 대 한 최종 길이 동일 하:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - 스핀 들 midzone을 확인 합니다. 이 스핀 들의 길이 1/2로 계산 됩니다. 이미지 J에 선 도구를 사용 하 여, 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 하나의 스핀 들 극에서 스핀 들 midzone 하는 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다.
- 선 측정 도구를 사용 하 여 스핀 들 midzone에서 염색체 거리를 평가 하 여 염색체 정렬 상태를 확인 합니다. 이미지 J 도구 모음에서 줄 아이콘을 클릭 하 여 사용할 수 있는 선 도구를 사용 하 여, 염색체에 스핀 들 midzone에서 선을 그립니다. 길이는 이미지 J 도구 모음에 표시 됩니다. 스핀 들 midzone에서 4 µ m 보다 큰 염색체 정렬된 18간주 됩니다.
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Representative Results
생체 외에서 후 전사 고품질 RNA (1.8-2.2) A260/A280 비율과 A260/A230 비율 ≥1.7은 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 하는 때 있을 것 이다. 그림 1 에서 그림 보여준다 생체 외에서의 마이그레이션-변성 agarose 젤 전기 이동 법 후 RNA 생성. 패턴 또는 여러 크기의 밴드는 샘플에 얼룩져 밴드 오염 또는 샘플의 저하를 나타낼 수 있습니다. 또는, 여러 밴드는 mRNA 완전히 변성 하지 또는 시작 플라스 미드는 완전히 선형화를 나타낼 수 있습니다. MRNA는 mRNA 체 외의 안정적인 식 수 있는 pIVT에 내장 된 폴 리 adenylated 꼬리 때문에 예상 보다 큰 실행 됩니다. Microinjection 후 균일 한 주입 볼륨 및 형광 현미경 검사 법을 통해 식 수준을 보장 하기는 것이 좋습니다. 그림 2에서 그림 나 체포 oocytes Gfp균일 하 게 주입 의향을 보여줍니다. 일관 된 microinjection 기술은이 프로토콜에 대 한 중요 하다. 이미지 J 같은 이미지 분석 소프트웨어, 균일성과 기술의 숙달 되도록 식 수준을 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 참고 두 분석 실험에 대 한 이미지를 하 고 있는 동안 subcellular 지역화 정보를 가져올 수 있습니다. 모든 microinjection 유전자 이체의 효과 평가, 실험에 대 한 야생-타입 유전자 oocytes 컨트롤 역할의 하위 집합에 주입 한다. 이 마우스 oocyte에서 인간의 유전자의 잠재적인 overexpression 고기에 대 한 제어를 하나를 수 있습니다. PBS, 또는 Gfp fluorophore 표시 된 구문 이어야 한다 또한 oocytes microinjection 유도 고기에 대 한 제어의 하위 그룹에 주입. 형광 태그 없이 구문, Gfp mRNA 충분 한 microinjection를 위해 공동 주입 될 수 있습니다. 공동 두 개 이상의 구조를 동시에 주입 하는 경우에 최종 솔루션 각 mRNA의 µ 500 ng/L 포함 되도록 mRNA 농도 증가 해야 합니다.
감기-안정 microtubule 분석 결과 microtubules에 kinetochores의 부착 상태를 평가 하기 위한 유용한 도구를 제공 합니다. 그림 3 은 분열의 confocal 현미경 이미지의 z-투 나 oocyte. 이 oocyte kinetochores에 첨부 하지 했다 모든 microtubules depolymerize를 차가운 매체 처리를 복종 되었다. 시간 부족 microtubule 섬유 염색체 (너무 짧은 결과 너무 많은 섬유에) 또는 모두 함께 부족 섬유에 부착 되지 않습니다 (너무 긴 결과 없는 스핀 들 구조에) 포함 하 고 그것은 취급 된 oocytes를 이러한 oocytes를 좋습니다. 분석에 사용 되지. 감수 분열의 분열에서 나 일반적입니다 첨부 되지 않은 또는 옆으로 연결 된 kinetochores 포함 oocytes, 따라서 것이 좋습니다 제어 그룹 모든 첨부 파일 연구에 사용할 수 있습니다. 평균, 야생-타입 oocytes 하지 미 자유로이 kinetochores의 5-10%를 포함 하는 것입니다 아직 안정적으로 연결 된 19. 그것은 필수적인 모든 oocytes kinetochore microtubule 첨부 상태 분석에 대 한 같은 무대에 있을입니다. 그 실험 및 그룹 제어 비슷한 시간 비늘으로 성숙한 그것은 세포 주기 활동을 평가 하는 것이 좋습니다. 이 분석 결과 수행 하기 위해 제어 및 실험 oocytes의 하위 집합 해야 성숙 되며 시간 경과 microcopy에서 라이브 시각. Milrinone 사용 하 여 미디어와 milrinone 부족으로 릴리스 같은 시간 20에 감수 분열의 재개를 허용 되도록 oocytes를 감수 분열의 의향에, 난을 동기화 할 수 있습니다. 제어 및 실험 그룹에서 oocytes 극 몸, 감수 분열 II (만난 II), 비슷한 시간 포인트에서의 분열에 도달 나타내는 압출 성형 한다. 메트로에 oocytes를 성숙 수 있습니다 라이브 셀 현미경 사용할 수 없는 경우 나 (7h)와 만난 ii (16h), 고정, 및 스테인드 DNA와 microtubules 앞에서 설명한 대로 검색 하. 메트로에서 만난 제 배럴 모양, 바이 폴라 스핀 들 표시 되어야 합니다. 제어 oocytes에서 염색체 분열 중 기 격판덮개에 정렬 한다. 그러나 염색체의 맞춤 변형 영향에 따라 실험 그룹에서 다를 것 이다,, 염색체 응축 해야 하 고 대부분의 스핀 들에 위치 해 염색체 microtubules에 연결 된. Oocytes의 유사한 수 해야 제어 및 실험 그룹의 감수 분열 II에 도달 했습니다. 첨부 파일 확인에 어려움을 줄이기 위해 상태 좋습니다 이미징 oocytes z-평면에서 작은 단계를 사용 하 여 특정 작업 목적을 위해 최적화 됩니다. 분석 z 슬라이스를 개별적으로 표시 해야 하 고 병합된 설정을 결정 microtubules 첨부는 극에서 나 다. 그림 3B 비정상적인 kinetochore microtubule 첨부 파일의 예를 보여 줍니다. 표시 하는 것은는 한 자매에 kinetochore 쌍 없음 첨부 파일로 정의 된 스핀 들 microtubule에 연결입니다. 다음으로, syntelic 첨부는 두 자매에 kinetochore 쌍 같은 스핀 들 극에 연결 된 표시 됩니다. 마지막으로, merotelic 첨부 파일 어느 한 자매 kinetochore는 다른 자매 동안 두 스핀 들 극에 첨부 되어 표시 되는 쌍의 kinetochore 단일 스핀 들 극에 연결.
그림 4에서 이미지 진보적인 예상된 DNA 및 스핀 들 구성 염색체 맞춤 도전 분석 결과의 단계를 통해 하나의 움직임으로 설명합니다. 이 분석 결과에서 그것은 중요 한 다른 실험 그룹 비슷한 속도와 감수 분열을 통해 진행입니다. 기술 이전은 도전 시험 실시 전에 세포 주기 론 분석을 완료 하는 것이 좋습니다. 이 분석 결과에 oocytes 성공적으로 비정상적인 kinetochore microtubule 첨부 파일 수정에 대 한 능력 평가입니다. 이 테스트 하려면 oocytes는 메트로를 먼저 성숙 kinetochore microtubule 첨부 파일을 설정할 수 있도록 내가. 다음, oocytes는 monastrol, 및 monopolar 스핀 들 21으로 바이 폴라 스핀 들을 축소 하는 Kinesin 5 (EG5) 억제제 인 큐베이 팅. Monopolar 스핀 들의 세대는 100% 잘못 된 microtubule-kinetochore 첨부 파일을 유도합니다. Monastrol 억제제는 다음 복구를 허용 하도록 밖으로 세척 됩니다. 복구 기간 동안에 oocytes 바이 폴라 스핀 들을 다시 생성 하 고 microtubule 첨부 파일 수정. 프로테아좀 억제제 MG132의 추가 anaphase 발병을 방지합니다. 컨트롤, oocytes 각 실험 그룹에서의 작은 하위 프로토콜의 각 단계에서 해결할 수 있습니다 (I, monastrol 처리, 만난 복구 게시) 모든 그룹 치료, 응답은 동일한 정도로 되도록. 분열 중 기 나 oocytes 염색체 분열 중 기 격판덮개에 정렬 된 배럴 모양의 바이 폴라 스핀 들을 포함 해야 합니다. Monastrol 치료 oocytes 단일 극 주위 지향 염색체를 가진 monopolar 스핀 들을 포함 해야 합니다. 복구 된 oocytes 다시 한번 배럴 모양의 바이 폴라 스핀 들을 포함 해야 합니다. 어떤 염색체로 염색체 맞춤 정의 스핀 들 midzone 22에서 이상의 4 μ M. DNA와 kinetochores DNA 검출만을 사용 하 여 결정 하기 어려운 수 두 kinetochores이 중앙 영역 밖에 있다면 설정 감지 oocytes 얼룩을 도움이 됩니다.
그림 1입니다. RNA의 Denaturingagarose 젤 전기 이동 법. RNA의 품질 및 크기에 변성 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 평가 될 수 있다. 변성 젤 2 차 구조 형성을 방지 하는 것이 좋습니다. 레인 1에는 RNA 분자 무게 마커를 포함 되어 있습니다. 레인 2는 RNA 샘플입니다. Note는 RNA 내장 polyA 꼬리 때문에 계산 보다 큰 실행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 유효성 검사 oocyte microinjection. 형광 현미경 검사 법은 성공적인 oocyte microinjection 및 식 확인을 사용할 수 있습니다. 의향 나 체포 oocytes Gfp 와 microinjected 구문이 하룻밤 식 후 표시 됩니다. 이 사진은 Invitrogen EVOS 플로리다 자동 이미징 GFP 빛 큐브를 갖춘 시스템을 사용 하 여 얻은 했다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Kinetochore-microtubule 첨부 파일 평가. 감기 치료의 (A) A 대표 z-프로젝션 oocyte 난을 만났다. 스핀 들 (녹색), kinetochores (빨간색), 그리고 DNA (파란색)이 표시 됩니다. 상자는 광학 줌의 영역을 나타냅니다. 화살촉 끝에 첨부 파일을 kinetochores의 microtubules의 단일가를 나타냅니다. 눈금 막대는 스핀 들, kinetochore, DNA, 및 병합 채널 10 µ m. 광학 줌에 대 한 눈금 막대 5 µ m. (B) 마우스 oocytes에서 비정상적인 kinetochore microtubule 첨부 파일 형식의 예입니다. 화살표는 kinetochore microtubule 첨부 파일 사이트를 나타냅니다. 눈금 막대는 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 염색체 맞춤 도전 분석 결과. 흐름 차트 절차의 각 단계에서 oocytes의 대표 z 계획입니다. Oocytes는 먼저 감수 분열의 분열을 성숙 난 (내가 만난), 2 h monopolar 스핀 들 형성을 유도 하는 것에 대 한 monastrol를 포함 하는 새로운 접시에 전송. 다음 oocytes 프로테아좀 억제제 (MG132) 3 h anaphase 발병을 방지 하기 위해 보충 성숙 매체에서 복구할 수 있습니다. 일단 복구 된 oocytes는 고정, 스핀 들 (녹색), kinetochores (빨간색), 그리고 DNA (블루)에 대 한 분류 및 정렬 상태를 결정 하는 confocal 현미경 검사 법을 통해 몇 군데. 라인 및 스핀 들 midzone (20 µ m) 피타고라스 정리 방정식을 사용 하 여 결정 스핀 들 (40 µ m)의 길이 나타냅니다. 화살표는 각 극에서 포인트 도구 위치를 나타냅니다. 어떤 kinetochores > 스핀 들 midzone에서 4 µ m로 간주 됩니다 정렬 되지 않은. 별표는 정렬 되지 않은 염색체 (midzone에서 5.6 µ m)를 나타냅니다. 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
질병과 관련 된 인간의 유전 이체의 신속 하 고 증가 식별, 때문에 그들의 생물 학적 중요성을 평가 하기 위해 시스템 설립은 필수적 이다. 때문에 인간의 oocytes 소중한 희귀 하 고 인간의 정자는 의무가 유전자 조작 인간 감수 분열 포즈 특정 과제에서 단백질 기능을 이해. 마우스 oocytes는 인간의 meiotic 유전자 기능 10,23를 평가 하기 위한 귀중 한 포유류 모델 시스템입니다. 어떻게 유전 이체를 이해 하는 데 유용 되 고 여성 영향을 줄 수 있습니다 인간의 생식 세포와 유사한 감수 분열을 받 다 낮은-비용, manipulable oocytes의 쉽게 사용할 수 있는 소스를 제공 하면서 인간의 계란을 사용 하 여 impracticalities를 무시 하는이 모델 불 임입니다.
때문에 이러한 메서드 microinjection 통해 마우스 oocytes에서 인간 단백질의 소성 식 사용, 제어, meiotic 성숙 변경 하지 않는 야생-타입 RNA의 농도 설정에 중요 하다. Meiotic 성숙 속도 하는 것이 좋습니다 (핵 붕괴, 극 지 몸 돌출) 기준 매개 변수 및 사정 스핀 들 및 염색체 형태를 설정 제어 oocytes 모니터링. 또한, 유니폼 microinjection 볼륨을 보장이 비교 그룹에 중요 합니다. 관심사의 유전자에 형광 태그를 포함 하 여이 기술 문제를 단순화할 수 있습니다. Oocyte microinjection 마스터링에 대 한 기술 이전 시연된 15되었습니다. 형광 현미경 또는 서쪽 오 점 통해 단백질 표정 결정에서 주입 된 oocytes의 일관 된 주입 농도 확인 하는 데 유용한 도구 있습니다.
포유류 oocytes에서 염색체 분리에 오류 배아 이수성 및 임신 손실5의 주요 원인 이므로, kinetochore microtubule 첨부 파일의 분석 여부 관심사의 유전자를 평가 하기 위한 유용한 도구에 영향을 제공합니다 염색체 분리 (즉 잘못 된 첨부 파일 잘못 분리를 일으킬 것입니다). 냉장 미디어 10 분 노출은 depolymerize kinetochore microtubule 첨부 파일, confocal 현미경 검사 법 24통해 안정적인 첨부 파일의 시각화 수 있도록 만들지 microtubules 충분 합니다. 이 분석 결과 대 한 하지-진정에 oocytes이 안정적인 microtubules의 depolymerization으로 이어질 것으로 중요 하다. 또한, 최적화 절차 얼룩의 kinetochore microtubule의 시각화에 대 한 키입니다. 분석, 작은 단계에 대 한 적절 한 이미지 해상도 확인 하려면 (≤ 1 μ m) 40 x-63 x를 사용 하 여 z-평면에서 목표를 체포 한다, 및 모든 첨부 파일을 보장 하기 위해 전체 스핀 들 구조를 통해 얻는 이미지를 볼 수 있습니다. 것이 일반적인 중 첨부 되지 않은 kinetochores 감수 분열의 prometaphase 나 25.
염색체 맞춤 도전 분석 결과 이득 또는 손실의 기능 이체의 평가 위해 유용합니다. 이득의 기능 이체는 젊은 여성에서 마우스 oocytes 이수성의 낮은 수준을 있기 때문에 평가 하기 어려울 수 있습니다. 이 분석 결과 oocyte 실험적으로 유도 된 잘못 된 kinetochore microtubule 첨부 파일을 수정 해야 하는 상황을 생성 하 여이 장애물을 극복. 에 제어 oocytes 포함 1-2 고르지 염색체 돌연변이 증가 정렬 효율 (즉, 더 나은 맞춤 기능 것을 제공 하는지 여부를 결정 하기 위한 정량 시나리오를 제공 하는 복구 후 시간 포인트 설정 euploidy 보호). 염색체 부정합, 스핀 들에서 4 μ m 보다 큰 어떤 염색체에서 midzone는 정렬 되지 않은 수 있습니다 특징 이전 설립된 프로토콜의 정량화에 대 한 사용 18.
공부 하 고 손실의 기능 변형, 추가 실험 조건 연구 시스템 내에서 내 생 체 때문에 필요 하다. 이 문제를 완화 하는 방법 중 하나를 사용 하거나 관심의 variant의 녹아웃 마우스 모델입니다. Crisper/Cas9 시스템의 출현 같은 녹아웃 26를 생성 하는 빠른 방법을 제공할 수 있습니다. 또는, 녹아웃 모델 옵션 없으면, 공동 센스 morpholino oligonucleotides 또는 작은 방해 RNAs를 주입 하는 등 클래식 최저의 기법 채택 될 수 있습니다. 그러나, 시퀀스 디자인에 관심은 연구에서 microinjected 변종 어떤 잠재적인 간섭을 방지 하는 데 필요한. 예를 들어 morpholino oligonucleotide 인간 mRNA 변종 microinjection 통해 도입에 포함 되지 않은 마우스 유전자의 5' 되지 않은 지역 (5' UTR)에 바인딩할 디자인 될 수 있었다. 작은 방해 사용 하는 경우 RNAs 하나 수 비 동종 시퀀스 지역 대상 또는 인간의 유전자를 대상으로 하는 것을 회피 것에 침묵 지점 돌연변이 소개. 그러나, 내 생 단백질 복사본 variant의 표현에 따라 여전히 존재 수 있습니다 유익한 인간 게놈에 heterozygous 상태에서 발견 되는 많은 변종으로.
마지막으로,이 프로토콜에 설명 되지 않은, 비록 염색체 이수성 평가 수 쉽게 부과 만난 II 계란에서 인간의 변형 분석에 대 한 파이프라인에 마지막 시험으로. 이 제자리에 확산 하는 염색체 프로토콜의 자세한 설명 이전 15를 설명 했다. 간단히, microinjected oocytes 성숙 체 외에 고정 이전 meiotic 스핀 들 depolymerizing 에이전트와 치료 다음과 만난 II 단계를 도달할 때까지. Kinetochore 및 염색체 얼룩이 지기 여기에 설명 된 대로 염색체 콘텐츠의 평가 대 한 수 있습니다.
동안 마우스 oocytes 여성 감수 분열에 중요 한 단백질의 연구에 대 한 몇 가지 제한이 모델 존재 귀중 한 도구 제공 합니다. 단백질의 overexpression meiotic 성숙 교란 할 수 있다 하 고 따라서 RNA 농도 없을 수 있습니다 그는 표현 형을 유도 하지 않습니다. 또한, 내 생 마우스 체 외 인 인간의 단백질의 지 방화를 방해할 수 있습니다. 녹아웃 마우스 모델의 세대;이 문제에 해결책을 제공 한다 그러나,이 모든 상황에서 가능한 않을 수 있습니다. 다른 방법은 공동 RNAi를 주입 하 여 마우스 단백질을 고갈 하는 것 또는 morpholino oligonucleotides 설계 하지 대상 외 인 RNA와 단백질. 마지막으로, 그것은 많은 단백질은 동종 간의 유의 해야 인간의 마우스, 현지화 및 기능 간 종 분석의이 유형을 배제 수 차이에 선도 차이 있을 수 있습니다. Cas9-게놈 편집27 같은 유전자 조작 도구 저렴 하 고 더 일반적인 곳으로,이 프로토콜 microinjection에 의존 하지 않고 노크, 인간 답게 마우스 라인 만들기로 진화 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 미국 생식 의학 협회와 찰스와 요한 나 부시 기념 기금 Rutgers에 연구 보조금에 의해 지원 되었다에 주립 대학 뉴저지 K.S. A.L.N.에 N.I.H. (F31 HD0989597)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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