Summary
İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.
Abstract
Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.
Introduction
Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3' tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve daha kısa bir süre için bu strateji sonuçlandı çünkü tek kromozom normal (euploid) embriyolar rahim transfer için seçme yararı sermiştir gebelik 6,7,8,9ulaşmak. Bu nedenle, insan anöploidi etyolojisinde anlama önemli etkileri yardımcı üreme olabilir.
Aneuploidies için ön-implantasyon genetik test kısırlık tedavi sonuçlarının karşılaştırılması yararlı olmakla birlikte, nasıl aneuploidies kaynaklanan kapsamlı bir anlayış hala eksik. Bu yaygın segregasyonun aneuploidies (gamet üretim sırasında kökenli) ve maternal yaş, ancak, onların belirli yaş 4için ortalama oranı sapma bazı kadınlar mevcut embriyonik anöploidi oranları pozitif bir korelasyon olduğu kabul edilir. Bu gibi durumlarda yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil öneririz. Diğer faktörler gen türevleri gibi embriyonik anöploidi riski artan bir rol oynayabilir.
Bir gen varyantı anöploidi potansiyel katkısını oosit mayoz sırasında araştıran bir anahtar hızla segregasyonun gen işlevini değerlendirmek için bir sistem tasarımı için yönüdür. Etik kısıtlamaları ve sınırlı erişim nedeniyle, insan yumurta kullanılarak bu deneyler yapmak zordur. Bu sorunları fare yumurta kullanarak atlatılabilmişlerdir, ve deneyleri mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için bir dizi ben burada açıklanan. Mesajcı RNA (mRNA) faiz gen türevi için kodlama microinjecting tarafından fare yumurta insan protein lokalizasyonu olabilir görüntülenir ve vahşi-türü ve mutasyona uğramış insan proteini Ektopik ifade herhangi içinde sonuçları belirlemek için kullanılan fenotipik değişiklikler anöploidi için neden olabilir. Bu protokolü kazanç ve fonksiyon kaybı araştırmak için kullanılabilir, bu fenotipleri bir artış için uygun olmayan kız kardeşimin kinetochore ve metafaz, kromozom hizalamasını mayoz ı. önemlisi desteklemek için yetersizlik iliştirdiği mikrotübüller içerir. oosit mayoz önemli olaylar gibi meydan okumak için belirli deneysel koşullar kurarak genetik varyantların bina ve kromozom hizalama 10iğ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Moleküler klonlama
- Gen faiz ve plazmid vitro transkripsiyon (pIVT) vektör11tam uzunlukta kodlama dizisi elde edilir.
Not: Tam uzunlukta cDNA klonlar çeşitli satıcılardan ticari olarak kullanılabilir veya ters transkripsiyon Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yolu ile oluşturulabilir. Dışavurumu sıra (EST) veritabanları öğesini ve biyoteknoloji bilgi (NCBI) online kaynak için Ulusal Merkezi transkript dizileri genler için nükleotit sağlar. Protein kolaylığı için görselleştirme ve analiz ifade düzeyleri, füzyon yeşil flüoresan protein (Gfp) veya başka bir uygun floresan etiket klonlama stratejisinde istenen. - Doğrulanmış bir klonlama strateji kullanarak, ilgi genin kodlama dizisi pIVT birden çok klonlama bölgesine ekleyebilirsiniz. Moleküler klonlama ayrıntılı bir açıklama ve gerekli adımları daha önce açıklanan 12olmuştur.
Not: bir gen-füzyon ürün oluşturulacak ise, klonlama uygun okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun. - Doğru gen ekleme, uygun çerçeve fusion ve hiçbir polimeraz kaynaklı nokta mutasyonlar oluşturulan emin olmak için globin primerler kullanılarak inşa etmek sıra.
Not: Sanger DNA sıralama ekipman kullanılabilir değilse, birçok şirket düşük maliyetli DNA Sıralama seçenekleri sunuyoruz. - DNA tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) veya ekleme/silme (INDELS) üreten varsa mutagenize. DNA mutagenesis adımları 1.5-1.7 açıklanmıştır. Vahşi-türü yapıları için Doğrusallaştırma adım 1.7 ile devam edin.
- Mutagenesis astar tasarım ve üreticinin iletişim kuralı başına mutant yapı oluşturmak için mutagenesis PCR reaksiyon tamamlayın. PCR-aracılı site yönettiği mutagenesis yukarıda açıklanan 13oldu. Ayrıca, birçok şirket iletişim kuralları içerir sitesi yönetmen mutagenesis kitleri teklif.
- Mutagenized DNA'sı bakteriyel konak dönüşümü. İzole ve plazmid arındırmak.
Not: Birçok şirket kolayca ayırmak ve plazmid DNA arındırmak için kullanılan kitleri olun. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. E. coligibi gram-negatif bakteri zorlanma kullanıyorsanız, endotoxins kaldırır bir kit kullanılması önerilir. - Bakteriyel transformants getirilmesi istenen SNP veya INDEL onaylamak için standart Sanger DNA sıralama kullanarak izole DNA'dan sıra.
- Son ürünler tek restriksiyon enzimi sindirim saf DNA kullanarak linearize.
Not: PIVT vektör birden çok tek-enzim Addgene 14plazmid haritada listelenen siteler kesmek içerir. - Ürün özel Jel Elektroforez ile doğrusal olduğundan emin olun. Özel Jel Elektroforez yöntemi önceden tanımlanmış 14oldu.
Not: tüm kalan adımları için kararlı, yüksek kaliteli RNA üretimini sağlamak için bariyer (filtre) damlalıklı ipuçları ve RNase içermeyen malzemeler kullanın. - Doğrulanmış bir DNA temizlik Protokolü veya kit kullanılarak sindirilir ürün arındırmak ve 30 µL RNase/Dnaz-Alerjik suda elute.
Not: silikat-matrix spin sütunlara göre kitleri için yüksek kaliteli, tavsiye edilir saf DNA. Üreticileri Protokolü buna göre izleyin. - Vitro T7 polimeraz üreticinin protokol sonrası kullanarak DNA uyarlamak.
- Arındırmak ve RNA RNase/Dnaz ücretsiz su üreticinin protokol sonrası bir silikat-matrix spin sütunlara göre nükleik asit arıtma kit kullanarak 30 µL içinde elute.
- Denaturing özel Jel Elektroforez son RNA ürün boyutu onaylamak için formaldehit kullanarak gerçekleştirin. 14aşağıdaki adımları 1,13-1.22 bakın. (Şekil 1).
- Jel 72 ml 1 g özel Isıtma tarafından eriyene kadar su hazırlamak, sonra 60 ° C'ye serin
- 10 X 0.4 M BEZLERİ (pH 7,0), 0.1 M sodyum asetat ve 0.01 M EDTA ekleyerek tampon çalıştıran MOPS hazırlayın.
- 10 mL 10 X MOPS tampon ve % 37 formaldehit (12,3 M) 18 mL soğutmalı özel çözüm çalışan ekleyin.
- Kast özel çözüm bir jel şekillendirme konteyner içine dökme tarafından jel. 10 µL kapsayacak kadar geniş bir tarak kullanın. Jel belirledi ve dokunmak için sert olması sonra yavaşça tarak kaldırın.
- Jel Elektroforez tank montajı ve yeterli 1 X arabellek, çalışan jel tamamen kaplıdır sağlanması MOPS ekleyin.
- RNA örnek formaldehit içeren yükleme boya 0.5 X birimlerine RNA'ın 1 µg ekleyerek hazırlayın.
- Etidyum bromür 10 µg/mL bir konsantrasyon RNA çözüm ekleyin.
- RNA örnek çözümü 5 min için 70 ° C'de denatüre.
- Steril kullanarak 10 µL filtre ipuçları, molekül ağırlığı işaretleyicinin 5 µL yük ve RNA'ın 5 µL jel ayrı kuyu sample(s) ve boya jel uzunluğu en az üçte göç kadar 5 V/cm electrophorese.
- Bir UV trans ışığı üzerinde jel RNA görselleştirin. RNA moleküler ağırlık işaretçiyi karşılaştırarak doğru boyutu olduğundan emin olun.
- Konsantrasyon ve RNA saflığı ölçmek için steril 10 µL filtre ipuçları UV Spektrofotometre üzerine kullanarak arıtılmış RNA'ın 1.2 µL aktarın.
Not yüksek kaliteli RNA A260/280 (1.8-2.2) ve 260/230 Absorbans oranları olmalıdır (> 1,7) anılan sıraya göre. - 10 µL filtre ipuçları, aliquot kalan saf RNA steril 0.5 µL santrifüj tüpler içine (3-5 µL/tüp) kullanarak. Mikroenjeksiyon için hazır kadar tüpler-80 ° C'de depolayın.
Not: 500 ng/µL son enjeksiyon yoğunlukta bir en iyi başlangıç noktasıdır. Bu RNA 1: 2'RNase H20 RNA yapışkanlık mikroenjeksiyon pipet içinde azaltmak için mikroenjeksiyon öncesinde ücretsiz sulandırmak için tavsiye edilir.
2. kinetochore-Mikrotubul ek tahlil
- Yumurtalar mikroenjeksiyon için eşit gruplara bölün.
Not: Yumurta toplama, transfer, mikroenjeksiyon ve segregasyonun olgunlaşma tarif edilmiştir ayrıntılı olarak Jüpiter daha önce 15. - Deneysel mRNA içeren bir grup ve diğer grup WT denetim ve PBS veya Gfp ile microinject mRNA.
Not: 500 ng/µL 10ile başlamak için önerilen enjeksiyon bölgedir. Bir picoinjector enjeksiyon tutarları kontrol etmek için kullanılabilir. 5-10 pL bir enjeksiyon hacmi 15önerilir. - Bir yumurta (100-150 µm), transfer yumurta içine bir kültür ortamında milrinon içermeyen bir petri 100 µL damla çapı daha büyük embriyo kalitesi madeni yağ kaplı bir el ya da ağız nerede cam pipet açılış işletilen pipetting aparatı biraz olduğunu kullanarak ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek için %5 C02 37 ° C'de 7 h için kuluçkaya ben (Met) 15.
- Yukarıdaki gibi aynı pipet cihazları kullanarak kuluçka sonra yumurta önceden soğutulmuş minimum temel medya (MEM) koleksiyon orta iyi Center'da 700 µL ve 500 µL H20 dış halkası içeren bir merkezi-şey organ kültür çanak içine aktarmak ve 7 dakika buzda çanak yerleştirin.
Not: Önceden MEM medya soğuk ve de organ kültür yemekleri için en az 20 dk önce yumurta tedavisinde-20 ° C'de ortalamak için önerilir. - Yumurta % 2 paraformaldehyde 1 X PBS için oda sıcaklığında 20 dk içinde 400 µL içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanarak aktararak düzeltmek.
- Kullanarak pipet aparatı, yumurta başka bir kuyunun içine 400 µL engelleme çözüm (PBS + % 0,3 BSA + % 0,01 ara-20 + %0,02 NaN3) ve mağaza içeren spot bir tabağa aktarın. immunostaining için işlemek için hazır kadar 4 ° C'de.
Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için. - Aynı pipet cihazları kullanarak, bir yerde yeni bir kuyu için transfer yumurta içeren 400 µL permeabilization çözüm (PBS % 0,3 BSA + %0.1 TritonX-100 + %0,02 NaN3) plaka ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle üç üzerinden hızlı bir şekilde Transfer yumurtalar kuluçkaya 400 µL damla herhangi bir kalıntı deterjan kaldırmak için çözüm engelleme.
Not: Bir 9-şey açık cam spot tabak iyi grupları birden fazla tedavi ile tek bir yemek (Adım 2.4-2.5) üzerinde hareket etmek için çalışır. - Kalan immunocytochemistry yordamları bir oksijen odasında ışık oda sıcaklığında korunan gerçekleştirmek. Kullanım bir orta ölçekli plastik konteyner nemli kağıt havlu ve alüminyum folyo ile kapatın ile kaplı.
- Pipet cihazları kullanarak, yumurtalar için 30 µL transfer çözüm bir 96-şey plaka ve oksijen Odası 10 dk içinde yer kapağındaki engelleme.
Not: Damla plaka üzerinde dairesel boynundaki yerleştirilir. - Sentromerler ve Milli, pipet cihazları kullanarak etiket, yumurtalar için 30 µL transfer için anti-centromeric antijen (ACA, Crest) içeren çözüm engelleme (1:30) ve anti-acetylated tübülin (1: 1000) ve en az 1 h için kuluçkaya.
- Yumurtalar üç 30 µL damla 10 min için çözüm engelleme yoluyla aktararak durulayın.
- Pipet cihazları, transfer yumurta kullanarak için 30 µL engelleme çözüm ikincil antikorlar (Anti-insan IgG 1: 200, Anti-fare IgG 1: 200) kullanılan antikor için ücretsiz içeren bırakın ve 1 h için kuluçkaya.
- 3, 10 dk 30 µL durulama adımlarını yineleyin 2.11. adımda açıklandığı gibi çözüm engelleme.
- Pipet cihazları, 3-5 µL orta içeren DAPI montaj kullanarak yumurta transferi (5.9 µg/µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki.
- Vazelin 4 küçük damla (bir PIN kafa boyutunu) Yumurta kırma önlemek için kapak Not köşelerinde yer.
- Yavaşça kapak notu vazelin yan slayt yerleştirin.
- Mühür kenarları ile tırnak cilası temizlemek ve 5 min için kurumasını alışverişi coverslip.
- Slaytları işleme confocal mikroskobu ile kadar gelen ışık, korumalı 4 ° C'de depolayın.
Not: montaj orta ve coverslip, maç Kırılma indisi kullanılmaktadır belgili tanımlık mikroskop objektif olun. Önerilen montaj malzemeleri daha önce olmuştur 15nitelendirdi. - Görüntü 40-63 x amaç küçük adımlar yakalama confocal mikroskobunun kullanarak yumurta (≤ 1 µm) z-uçak, optimize edilmiş çalışma amaç ve görüntü metafaz iğ tüm bölge için.
Not: 2.11 adımda kullanılan belirli ikincil antikorlar temel alan tüm 3 kanal görüntü emin olun. ≥ 4 ve zoom 3 ortalama görüntü için yeterli çözünürlük idealdir. 1 µm adım boyu mikrotübüller ve fare yumurta kinetochores açık görselleştirme sağlar. Yordamı fotoðraf çekmek için mikroskop mikroskop değişir. Lütfen nasıl mikroskop ayarlarını yapılandırmak için belirli adımlar için üreticileri confocal kullanıcı kılavuzuna bakın. - Aşağıdaki adımları 2.21 2,23 takip düşsel bilgisayar yazılımı kullanarak kinetochore-Mikrotubul eki durumunu tanımlar.
Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. Ek durum türleri daha önce olmuştur 16 tanımlı. - Dosya resim J araç çubuğuna sürükleyerek resmi aç.
- Açılan z-serisi, tüm kanallar görünür (DNA, kinetochore ve spindle) "renk" alt sekmesi altında "kanalları Birleştir", "görüntü" açılır menüsünde bulunan tıklayarak yapmak.
- Geçişi görüntü altındaki kullanarak, her z dilimli taşımak ve kinetochore Mikrotubul eki belirler. 16 ayrıntılı ek açıklamaları daha önce olmuştur açıklanan
3. kromozom hizalama Challenge tahlil
- Pipet aparatı 2.3. adımda açıklandığı gibi kullanarak, aktarım milrinon ücretsiz kültür orta petrol altında bir 100 µL damla içine yumurta ve yumurta yeterli olgunlaşma mayoz metafaz için izin vermek 7 h için kuluçkaya ben (Met) daha önce 2,3 17. adımda açıklandığı gibi .
Not: Oosit toplanması, mikroenjeksiyon ve olgunlaşma yordamlar özetlenen daha önce 15. Ek tahlil Protokolü adım 2.1-2.2 denetimleri ve RNA mikroenjeksiyon konsantrasyonları bakın. - Aynı pipet cihazları kullanarak, Merkezi-şey organ kültürüne transfer yumurta içeren 700 µL Kültür Merkezi iyi ve 400 µL H20 çevreleyen halka monastrol [100 µM] içeren orta çanağı ve 37 ° c 2 h için kuluçkaya.
- Yumurtalar, pipet aparatı olarak yukarıda, 100 µL CZB kültür orta, üç damla aracılığıyla kullanarak aktarma tarafından monastrol dışarı durulama ve yumurta içeren 700 µL kültür orta + MG132 yeni bir merkezi-şey organ kültür çanak transfer [5 mikron] Merkezi 3 h için yüzüğü. 400 µL H20 dış halka ekleyin.
- Yumurtalar, PBS içinde oda sıcaklığında 20 dakika için 400 µL % 2 paraformaldehyde içeren bir açık cam spot kalıbının kuyuya pipet cihazları kullanılarak aktarım tarafından tamir.
- Fiksasyon sonra yumurta transferi, pipet cihazları, şeffaf cam spot plaka 400 µL içeren yeni bir kuyunun içine kullanarak engelleme çözüm ve mağaza kadar 4 ° C'de işleme için immunostaining.
Not: 4 ° c, cam spot plaka buharlaşma önlemek için parafilm ile yumurtalar depolamak için. - Permeabilize ve yumurta immunocytochemistry via 2.6-2.16 adımlarda açıklandığı gibi etiket.
- Görüntü yakalama, 40-63 x amaç üzerinde confocal mikroskop kullanarak yumurta < 1 µm adım z-uçak metafaz iğ tüm bölge görüntü emin olmak istedim.
- Durum kromozom hizalamasını belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü dosyaları açın.
Not: Aşağıdaki adımlar, görüntü J (NIH) ücretsiz indirilebilir yazılım kullanarak bu yordamı açıklar, ancak, diğer düşsel bilgisayar yazılımı-ebilmek var olmak kullanılmış. - Görüntü resmi J kontrol paneline sürükleyin.
- Açılan z-serisi, nokta aracını (görüntü J kontrol çubuğu noktası aracı simgesini tıklatarak bulunur) kullanın aracı görüntüdeki Milli direk üzerine yerleştirip resmine tıklayarak onların anılan sıraya göre z-dilim her işmili kutbunda sonunda Puan işaretlemek için. Bu noktalar, Command + t klavye tuşlarına basarak faiz (ROI) Yöneticisi bölgesine ekleyin.
- Her adım 3.10 ROI Yöneticisi'nde belirli nokta vurgulama ve ölçü birimi düğmesini tıklatarak ayarlama pozisyonlar için belirli koordinatları belirleyin. Bu bir sonuçları sağlayacaktır tabloyu içeren x ve y koordinatlarını her noktası için. Bunlar sırasıyla X1, Y1 ve X1, Y2, Puan olacaktır.
- Daha sonra gerçek Z Koordinat belirleyin. Bu hangi Milli direk tespit z yığınındaki belirli z-dilim dilim sayısı çarpılarak yapılır (Yani dilim #2 / 6) bireysel her noktası yığının kalınlığı (Yani 1 µm) tarafından olan (örnek: 2 x 1 µm dilim = 2). Bunlar sırasıyla Z1 ve Z2 noktalarında olacak.
- Pisagor teoremi denklemi kullanarak iğ uzunluğunu belirleyin (2 + b2 = c2) önceden tanımlanmış kullanarak x, y ve z koordinatları adımlardan 3.11-3.13. Son uzunluğu her mil için eşittir:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - İğ midzone belirler. Bu yarım mil uzunluğu hesaplanır. Çizgi aracı görüntü J kullanarak, görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak bir Milli Kutbu'ndan iğ midzone olduğunu bir çizgi çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir.
- Kromozom hizalama durum satırı ölçüm aracını kullanma iğ midzone kromozom Uzaktan değerlendirilmesi tarafından belirler. Görüntü J araç çubuğunda çizgi simgesini tıklatarak Çizgi aracını kullanarak, bir çizgi için kromozom iğ midzone çizin. Uzunluğu görüntü J araç çubuğunda görüntülenir. Kromozomlar iğ midzone üzerinden 4 µm den büyük hizalanmamış 18olarak kabul edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vitro sonra transkripsiyon kaliteli RNA (1.8-2.2) A260/A280 oranını ve ne zaman bir Spektrofotometre kullanarak ölçülen bir A260/A230 oranı ≥1.7 olacak. Şekil 1 ' deki resmi vitrogeçiş gösterir-RNA üzerinde denaturing bir özel Jel Elektroforez sonra üretilen. Desen veya çoklu boy bands sahip bir örnek bulaşmış bir grup kirlenme veya bozulması örnek gösterebilir. Alternatif olarak, birden çok grup mRNA değil tamamen denatüre veya başlangıç plazmid değil tamamen doğrusallaştırılmış olduğunu gösteriyor olabilir. MRNA mRNA içinde vitroistikrarlı ifade veren pIVT inşa Poli-adenylated kuyruk yüzünden tahmin daha büyük çalışır. Mikroenjeksiyon sonra tek tip enjeksiyon birimleri ve floresan mikroskobu ile ifade düzeyleri sağlamak için önerilir. Şekil 2 resimde profaz-tutuklandı yumurta düzgün Gfpile enjekte gösterir. Tutarlı mikroenjeksiyon tekniği bu iletişim kuralı için önemlidir. Görüntü analiz yazılımı, görüntü J gibi homojenlik ve teknik ustalık sağlamak için ifade düzeylerini doğrula için kullanılabilir. Not hücre altı yerelleştirme bilgi görüntüleme için her iki deneyleri yaparken elde edilebilir. Bir gen varyantı etkilerini değerlendirirken tüm mikroenjeksiyon deneyler için vahşi tipi gen yumurtalar bir denetimi hizmet kümesini içine enjekte. Bu bir fare oosit bir potansiyel overexpression fenotipleri insan gen için denetime izin verir. PBS veya Gfp yapıları, fluorophore etiketli için olması gerektiğini de yumurta mikroenjeksiyon kaynaklı fenotipleri için denetime bir alt içine enjekte. Floresan etiketi olmadan yapıları için Gfp mRNA yeterli mikroenjeksiyon emin olmak için ortak enjekte olabilir. İki veya daha fazla yapıları aynı anda birlikte enjekte öyle ki nihai çözüm 500 ng/µL her mRNA içerir mRNA konsantrasyonu artırmak emin olun.
Soğuk-kararlı Mikrotubul tahlil kinetochores mikrotübüller için eki durumunu değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Şekil 3 z projeksiyon bir metafaz confocal mikroskop görüntünün olduğunu ben yumurta. Bu yumurta soğuk ortam tedaviye kinetochores için bağlı değil tüm mikrotübüller depolymerize maruz bırakıldı. Bu yumurtalar tavsiye için yeterli bir süre kromozomlar (çok kısa sonuçlarında çok fazla lifleri) veya eksikliği lifleri hep birlikte bağlı değil Mikrotubul lifleri (çok uzun sonuçlarında hiçbir Milli yapı) içerir ve bu tedavi yumurta analizde kullanılan. Mayoz metafaz ben bekâr veya yanal ekli kinetochores içeren yumurta için ortak, bu nedenle bu bir kontrol grubu herhangi bir ek çalışma odasında kullanılması önerilir. Ortalama olarak, vahşi tipi yumurta kinetochores de MI olacak % 5-10'u içermez henüz stabil ekli 19yaşına. Tüm yumurta kinetochore-Mikrotubul ek durum analizi için aynı aşamada olması esastır. Bu deneysel sağlamak ve grupları denetlemek için benzer zaman ölçekleri ile olgun hücre döngüsü Kinetik değerlendirmek için tavsiye öyle. Bu tahlil gerçekleştirmek için denetim ve deneysel yumurtalar bir alt kümesini olgunlaştı ve canlı hızlandırılmış microcopy altında görüntülenir. Yayın milrinon ile eksik medya içine izin öyle ki yeniden başlamasını mayoz aynı saat 20yumurta eşitlenecek mayoz profaz içinde ben, milrinon kullanımına izin verir. Yumurta kontrol ve deneysel grupları bir kutup vücut, mayoz II (II) bir araya geldi, benzer zaman noktalarda metafaz yüksekliğe gösterge A'ya. Live-cep mikroskobu yoksa, yumurta Met'e olgunlaştı ben (7 saat) ve bir araya geldi sabit ve lekeli DNA ve mikrotübüller daha önce anlatıldığı gibi algılamak için II (16 h). Met ı ve II bir araya geldi bir varil şeklinde, iki kutuplu iğ görünür olmalıdır. Denetim yumurtalar, kromozomlar metafaz plaka uyumlaştırılması gerekmektedir. Kromozomlar hizalamasını değişken etkiler bağlı olarak deneysel gruplardaki farklı olacaktır, ancak, kromozomlar yoğunlaşmak ve mikrotübüller için kromozomlar iğ üzerinde merkezi bir konumda bulunan çoğunluğu ile bağlı. Yumurtalar benzer bir dizi mayoz II kontrolü ve deneysel grupları ulaşmış olmanız gerekir. Eki belirleme zorlukları azaltmak için bu önerilir durumu z-uçak, küçük adımlarla yumurta Imaging belirli çalışma amaç için optimize. Analiz z-dilimleri ayrı ayrı görüntülenmesini içerir ve mikrotübüller bağlı hangi kutup belirlemek için birleştirilmiş ayarlarında dan sızmak. Şekil 3B anormal kinetochore-Mikrotubul ekleri örnekleri gösterilmektedir. Hangi tek bir kardeş kinetochore çifti bir hiçbir ek olarak tanımlanan bir Milli Mikrotubul bağlı olduğu bir bivalent gösterilir. Ardından, syntelic eki hangi her iki kardeş kinetochore çiftleri aynı iğ kutup bağlı gösterilir. Son olarak, merotelic eki hangi bir kardeş diğer kız kardeşi ise her iki Milli Polonyalılar kinetochore bağlı olduğu gösterilmiştir kinetochore çiftinin tek iğ direğe bağlı.
Şekil 4 Albümdeki kromozom hizalama sınama tahlil adımları boyunca bir hamle olarak ilerici beklenen DNA ve Milli yapılandırmaları gösterilmektedir. Bu tahlil farklı deneysel grupları aracılığıyla mayoz benzer Kinetik ile ilerleme önemlidir. Açıklandığı gibi daha önce bu önce meydan tahlil iletken hücre döngüsü Kinetik analizleri tamamlamak için tavsiye. Bu tahlil başarıyla anormal kinetochore-Mikrotubul ekleri düzeltmek yumurta için yetenek değerlendirilir. Bu test etmek için yumurta ilk Met'e olgunlaştı ben kurulabilmesi için kinetochore-Mikrotubul eklere izin vermek için. Daha sonra yumurta monastrol ve iki kutuplu iğ monopolar iğ 21çöker Kinesin 5 (EG5) inhibitörü, inkübe. Monopolar iğ nesil % 100 yanlış Mikrotubul-kinetochore ekleri neden olmaktadır. Monastrol inhibitörü sonra kurtarma izin vermek için yıkanır. İyileşme süresi sırasında yumurtalar İki kutuplu bir iğ yeniden ve Mikrotubul ekleri düzeltmek için çalışır. Proteasome inhibitörü MG132 ilavesi anafaz başlangıçlı engeller. Bir denetim olarak yumurta her deney grubu üzerinden küçük bir alt-ebilmek saptanmak protokol içinde her aşamada (ı, tedavi, monastrol bir araya geldi kurtarma sonrası) tüm grupları yanıt tedaviler ve aynı ölçüde emin olmak için. Metafaz ben yumurta metafaz plaka hizalanmış kromozom ile namlu şeklinde bipolar iğ içermelidir. Monastrol ile tedavi yumurta monopolar iğ tek kutup odaklı kromozom ile içermelidir. Kurtarılan yumurta bir kez daha bir varil şeklinde bipolar iğ içermelidir. Kromozom hizalama herhangi bir kromozom tanımlanan iğ midzone 22daha--dan 4 mikron. DNA ve kinetochores her iki kinetochores bu sadece DNA tespit kullanarak belirlemek zor olabilir bu Merkez bölgesi dışından şunlardır Eğer kurmak için algılamak için yumurta leke yararlıdır.
Şekil 1. Denaturingagarose Jel Elektroforez RNA'ın. RNA kalite ve boyutu üzerinde bir denaturing özel Jel Elektroforez tarafından tespit edilebilir. Denaturing jel ikincil yapı oluşumunu önlemek için tavsiye edilir. 1 yolu için bir RNA moleküler ağırlık işaretçisi içerir. 2 yolu için bir RNA örneğidir. Not RNA yerleşik polyA kuyruk nedeniyle hesaplanan daha büyük çalışır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Oosit mikroenjeksiyon doğrulanıyor. Floresan mikroskopi başarılı oosit mikroenjeksiyon ve ifade doğrulamak için kullanılabilir. Gfp ile microinjected profaz-tutuklandı yumurta inşa gecede ifadeden sonra gösterilir. Bu resmi Invitrogen EVOS FL görüntüleme sistemi GFP ışık küp ile donatılmış otomatik kullanarak elde edildi. Ölçek çubuğu var. 100 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kinetochore-Mikrotubul ekleri değerlendirilmesi. (A) A temsilcisi z-projeksiyon soğuk tedavi ben oosit tanıştım. İğ (yeşil), kinetochores (kırmızı) ve DNA (mavi) görüntülenir. Kutuyu görme duyusuyla ilgili vınlamak bölge gösterir. Ok uçları son tarihinde tek bir bivalent mikrotübüller kinetochores, ekleri göstermek. Ölçek çubuğu iğ, kinetochore, DNA ve kanalları Birleştir için 10 µm var. Ölçek çubuğu görme duyusuyla ilgili vınlamak için 5 µm. (B) anormal kinetochore-Mikrotubul eki türü örnekleri fare yumurta var. Oklar kinetochore-Mikrotubul eki siteleri gösterir. Ölçek çubuğu var. 5 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Kromozom hizalama sınama tahlil. Yumurtalar her adımda temsilcisi z-projeksiyonları ile akış şeması yordam. Yumurta ilk mayoz metafaz için olgunlaştı ben (Ben araya), o zaman monopolar iğ oluşumu ikna etmek 2 h için monastrol içeren yeni bir tabak transfer. Sonraki yumurta proteasome inhibitörü (MG132 3 h için anafaz başlangıçlı önlemek için) ile takıma olgunlaşma ortamda kurtarmak için izin verilir. Bir kez kurtarılan yumurta spindle (yeşil), kinetochores (kırmızı) ve DNA (mavi) için etiketli, sabit ve hizalama durumunu belirlemek için confocal mikroskobu ile görüntüsü. Hatları Milli (40 µm) uzunluğunu belirtmek ve Pisagor teoremi denklemi kullanarak kararlı midzone (20 µm) iğ. Oklar her kutup noktası aracı pozisyonlarında gösterir. Herhangi bir kinetochores > Milli midzone üzerinden 4 µm olarak kabul edilir hizalanmamış. Yıldız işareti hizalanmamış kromozom (midzone 5.6 µm) gösterir. Ölçek çubuğu var. 10 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl genetik varyantların anlamak için yararlı olan erkek etkisi olabilir iken mayoz insan germ hücreleri için benzer tabi düşük maliyetli, manipulable yumurtalar hazır bir kaynak sağlanması sırasında insan yumurta kullanılarak impracticalities atlar doğurganlık.
Çünkü bu yöntemler fare yumurta mikroenjeksiyon yolu ile insan proteinin Ektopik ifade istihdam, ilk önce bir konsantrasyon kontrolü, segregasyonun olgunlaşma değiştirmez vahşi tipi RNA yapmanız önemlidir. Bu segregasyonun olgunlaşma Kinetik olduğunu tavsiye edilir (nükleer zarf gruplarına göre kutup vücut ekstrüzyon) temel parametreleri ve değerlendirilmesi iğ ve kromozom morfolojisi kurmak için denetim yumurta içinde izlenir. Buna ek olarak, tek tip mikroenjeksiyon birimleri sağlanması grupları karşılaştırmak için önemlidir. Faiz gen floresan etiketinde de dahil olmak üzere bu teknik sorun basitleştirebilirsiniz. Oosit mikroenjeksiyon mastering için teknikleri daha önce gösterdiği 15olmuştur. Floresan mikroskop ya da protein ifade western blot yoluyla belirleme altında enjekte yumurta görselleştirme tutarlı enjeksiyon konsantrasyonları doğrulanması için değerli araçlar mevcuttur.
Kromozom segregasyon memeli yumurta içinde hataları embriyonik anöploidi ve gebelik kaybı5önde gelen nedenidir olduğundan, kinetochore-Mikrotubul ekleri analizini sağlamak bir gen ilgi olup olmadığını değerlendirmek için değerli bir araç etkiler Kromozom ayrımı (Yani uygunsuz ekleri mis segregasyon neden olur). Soğutulmuş medya 10 dk maruz görselleştirme istikrarlı eklerin confocal mikroskobu 24üzerinden sağlayan bir kinetochore-Mikrotubul eki yapmadığınız mikrotübüller depolymerize yeterli olur. Bu tahlil için bu istikrarlı mikrotübüller bozulumu için yol açacak gibi yumurta aşırı soğuk değil önemlidir. Buna ek olarak, optimizasyon yordamlar boyama görselleştirme kinetochore ve Mikrotubul yapıları için anahtardır. Analiz, küçük adımlar için yeterli görüntü çözünürlüğü sağlamak için (≤ 1 mikron) z-uçak 40 x-63 x kullanarak amaç yakalanması ve tüm ekleri emin olmak için tüm iğ yapısında alma görüntülerdir görünür. Var yaygın olduğuna dikkat edin bekâr kinetochores sırasında prometafaz mayoz, ben 25.
Kromozom hizalama sınama tahlil kazanç veya işlev kaybı türevleri değerlendirme için yararlıdır. Kazancı işlevi değişik fare yumurta genç kadın üzerinden anöploidi seviyesinin düşük olduğundan değerlendirmek zor olabilir. Bu tahlil oosit deneysel İndüklenmiş yanlış kinetochore-Mikrotubul ekleri düzeltmeniz gereken bir durum oluşturarak bu engeli üstesinden gelir. Bir mutant artan hizalama verimliliği (yetenekleri olacakYani daha iyi uyum sağlayıp sağlamadığını belirlemek için ölçülebilir bir senaryo kurtarma sağlar sonra içinde 1-2 yanlış hizalanmış kromozomlar denetim yumurta içeren bir zaman noktası oluşturma korumak euploidy). Kromozom hatalı hizalaması, içinde hangi kromozomlar iğ üzerinden 4 mikron daha büyük midzone karakterizedir gibi hizalanmamış olabilir bir daha önce oluşturulmuş protokol miktar için kullanılan 18yaşında.
İşlev kaybı türevleri çalışmaya, ek deneysel koşullar nedeniyle çalışma sistemi içinde endojen homolog gereklidir. Bu sorunu hafifletmek için bir ilgi türevi bir nakavt fare modeli oluşturmak veya kullanmak için yoludur. Keskin/Cas9 sistem gelişiyle böyle knockouts 26oluşturmak için hızlı bir yol sağlayabilir. Alternatif olarak, bir nakavt model bir seçenek değilse, antianlamlı morpholino oligonucleotides veya küçük müdahale RNA'ların ortak enjekte gibi klasik devirme teknikler istihdam olabilir. Ancak, sıra tasarım dikkatleri microinjected değişken altında eğitim potansiyel bir girişimi engellemek için gereklidir. Örneğin, morpholino Oligonükleotid 5' Çevrilmeyen bölgesi (5' UTR) bağlamak için mikroenjeksiyon yolu ile tanıtılan insan mRNA versiyonu dahil değildir fare genin tasarlanabilir. Küçük müdahale kullanıyorsanız RNA'ların bir homolog sırası bölge hedef veya hedefleme kaçmasına insan gen sessiz noktası mutasyonların tanıtmak olabilir. Ancak, insan genomu heterozigoz durumda adl değişik olarak endojen protein kopya hala mevcut varyant ifade sahip bilgilendirici olabilir.
Son olarak, bu protokol için açıklanmayan rağmen kromozom anöploidi değerlendirme kolayca bir araya geldi II yumurta son tahlil insan varyant analizi için boru hattı olarak değerlendirilebilir. Bu in situ yaymak kromozom Protokolü ayrıntılı bir açıklama daha önce 15nitelendirdi. Kısaca, tedavi fiksasyon önce bir segregasyonun iğ depolymerizing maddesi ile aşağıdaki bir araya geldi II sahne gelinceye microinjected yumurta olgunlaştı vitro vardır. Kinetochore ve burada açıklandığı gibi kromozom boyama kromozom içerik değerlendirilmesi için izin verir.
Fare yumurta değerli bir araç proteinler için kadın mayoz kritik çalışma için bazı sınırlamalar modeli EXIST için sunarken. Overexpression proteinlerin segregasyonun olgunlaşma huzursuz ve bu nedenle bir RNA konsantrasyonu bir fenotip neden değil olmayabilir. Buna ek olarak, endojen fare homolog eksojen insan proteini lokalizasyonu ile girişime neden olabilir. Nakavt fare modelleri nesil bu soruna bir çözüm sağlar; Ancak, bu tüm durumlarda mümkün olmayabilir. Alternatif bir yaklaşım ortak RNAi enjekte edilerek fare protein tüketmek olacaktır veya morpholino oligonucleotides eksojen RNA ve protein değil hedef için tasarlanmış. Son olarak, birçok protein arasında homolog olmakla birlikte bu unutmamak önemlidir insan ve fare, farklılıklar var, Yerelleştirme ve türler arası analiz bu tür engel işlev farklılıkları lider. Daha ucuz ve daha ortak yer Cas9-genom düzenleme27 gibi genetik manipülasyon araçları olmak gibi bu protokol üzerinde mikroenjeksiyon güvenmek yerine çakma, insanlaşmış fare hatları içine yapım gelişmeye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
