Summary
Come le varianti genetiche associate con la malattia umana cominciano a diventare scoperto, sta diventando sempre più importante sviluppare sistemi con cui valutare rapidamente il significato biologico di quelle varianti identificate. Questo protocollo descrive i metodi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi femminile che usando i oocytes del mouse.
Abstract
L'aneuploidia embrionale è la principale causa genetica di infertilità nell'uomo. La maggior parte di questi eventi hanno origine durante la meiosi femminile, e seppur correlata positivamente con l'età materna, età da solo non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Pertanto, le varianti del gene potrebbero rappresentare segregazione del cromosoma non corretto durante l'oogenesi. Dato che l'accesso di ovociti umani è limitato per scopi di ricerca, una serie di saggi sono stati sviluppati per studio di funzione del gene umano durante la meiosi I usando i oocytes del mouse. In primo luogo, RNA messaggero (mRNA) del gene e la variante del gene di interesse vengono microiniettati nei oocytes del mouse mi-arrestato profase. Dopo dando il tempo di espressione, gli ovociti vengono rilasciati in modo sincrono nella maturazione meiotica per completare la meiosi I. Contrassegnando il mRNA con una sequenza di un reporter fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (Gfp), la localizzazione della proteina umana può essere valutata oltre le alterazioni fenotipiche. Ad esempio, guadagno o perdita di funzione può essere indagata attraverso la definizione di condizioni sperimentali che sfidano il prodotto del gene per correggere errori meiotic. Anche se questo sistema è vantaggioso nelle indagini di funzione della proteina umana durante l'oogenesi, un'adeguata interpretazione dei risultati dovrebbe essere intrapreso dato che l'espressione della proteina non è ai livelli endogeni e, se non controllato per (cioè bussato fuori o verso il basso), omologhi murini sono anche presenti nel sistema.
Introduction
La sterilità è una condizione che colpisce il 10-15% della popolazione umana dell'età riproduttiva 1, da cui quasi metà Cerca cure mediche 2. Anche se l'eziologia dell'infertilità è vario e in molti casi multifattoriali, l'anomalia genetica più comune in esseri umani è aneuploide embrionali 3. Aneuploide è definita come la deviazione (guadagno o perdita) del numero corretto di cromosomi in una cella. Il fenomeno di aneuploide in embrioni umani è comune e aumenta con l'età materna avanzata 4,5. Quattro studi controllati randomizzati hanno evidenziato i benefici della selezione solo cromosomicamente normali (euploide) degli embrioni per il trasferimento uterino perché questa strategia ha provocato l'impianto aumento tariffe, tassi più bassi di aborto spontaneo e tempi più brevi per raggiungimento di gravidanza 6,7,8,9. Di conseguenza, capire l'eziologia di aneuploide umana possono avere importanti implicazioni nella riproduzione assistita.
Anche se la prova genetica preimpianto per aneuploidie è vantaggiosa in trattamenti di sterilità, manca ancora una conoscenza approfondita di come origine degli aneuploidi. È ampiamente accettato che esiste una correlazione positiva di aneuploidie meiotiche (originati durante la produzione di gameti) e l'età materna, tuttavia, alcuni tassi di aneuploide embrionali presenti donne che si discostano dal tasso medio per loro era dato 4. Questi casi suggeriscono che la sola età non è sempre predittivi del rischio di generare un embrione aneuploide. Altri fattori possono svolgere un ruolo nell'aumento del rischio di aneuploidia embrionale, come varianti del gene.
Un aspetto fondamentale di studiare il potenziale contributo di una variante del gene di aneuploide durante la meiosi ovocitaria è quello di progettare un sistema per valutare rapidamente la funzione del gene meiotica. A causa di limitazioni di carattere etici e accesso limitato, è poco pratico per eseguire questi esperimenti utilizzando ovuli umani. Questi problemi possono essere aggirati utilizzando oocytes del mouse, e qui una serie di saggi per valutare la funzione del gene umano durante la meiosi io sono descritti. Da microinjecting del RNA messaggero (mRNA) che codifica per la variante del gene di interesse, la localizzazione della proteina umana nell'uovo del mouse può essere visualizzata e utilizzata per determinare se l'espressione ectopica della proteina wild-type e mutanti umana risultati in qualsiasi alterazioni fenotipiche che potrebbero portare a aneuploide. Questi fenotipi comprendono un aumento in microtubuli che si attaccano all'improprio alla sorella cinetocore e l'incapacità di sostenere allineamento cromosomi in metafase della meiosi I. d'importanza, questo protocollo può essere usato per studiare il guadagno e la perdita della funzione varianti genetiche attraverso la definizione di specifiche condizioni sperimentali per sfidare gli eventi chiave nella meiosi ovocitaria come mandrino allineamento edificio e del cromosoma 10.
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Protocol
1. molecolare clonazione
- Ottenere la figura intera sequenza di codificazione del gene di interesse e la trascrizione in vitro plasmide (pIVT) vector11.
Nota: Cloni di cDNA integrale sono disponibili in commercio da vari fornitori o possono essere generati tramite reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR). Centro nazionale per la risorsa online Biotechnology Information (NCBI) fornisce sequenze di trascrizione per i geni dal Nucleotide e sequenza espressa contrassegnati database (EST). Per facilità di proteina nella strategia di clonazione si potrebbe desiderare la visualizzazione e l'analisi dei livelli di espressione, fusione di proteina fluorescente verde (Gfp) o un altro tag fluorescente adatto. - Utilizzando una strategia di clonazione convalidata, inserire la sequenza di codificazione del gene di interesse della regione di clonazione più di pIVT. Una descrizione dettagliata della clonazione molecolare e i passaggi necessari sono stati precedentemente descritto 12.
Nota: Se un prodotto di fusione del gene deve essere generato, essere sicuri che la clonazione è nel telaio della lettura corretta. - Sequenza del costrutto utilizzando primers globina affinché il gene corretto inserimento, corretto in-struttura fusion, e che nessuna mutazione di punto della polimerasi-indotto sono stata creata.
Nota: Se l'attrezzatura di sequenziamento Sanger DNA non è disponibile, molte aziende offrono opzioni di sequenziamento del DNA a basso costo. - Mutagenizzare DNA se generando polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) o inserzioni/delezioni (INDELS). Mutagenesi di DNA è descritto in passaggi 1.5-1.7 sotto. Per i costrutti di tipo selvatico, procedere con il passo di linearizzazione 1.7.
- Disegnare primers di mutagenesi e completare la reazione di PCR di mutagenesi per generare la costruzione del mutante secondo il protocollo del produttore. PCR-mediata di mutagenesi sito-diretta è stato descritto in precedenza 13. Inoltre, molte aziende offrono kit di mutagenesi sito-diretta, che comprendono protocolli.
- Trasformare mutagenized DNA batterico host. Isolare e purificare il plasmide.
Nota: Molte aziende fanno kit che può essere utilizzato facilmente isolare e purificare il DNA del plasmide. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza. Se si utilizza un ceppo batterico gram-negativo come e. coli, si consiglia di utilizzare un kit che rimuove le endotossine. - Sequenza del DNA isolato da batteriche trasformanti utilizzando standard sequenziamento Sanger per confermare introduzione di SNP o INDEL desiderato.
- Linearizzare prodotti finali mediante digestione singolo enzima di restrizione del DNA purificato.
Nota: Il vettore pIVT contiene più single-enzima tagliata siti elencati nella mappa del plasmide su Addgene 14. - Assicurarsi che il prodotto sia lineare tramite l'elettroforesi del gel dell'agarosi. La metodologia per l'elettroforesi del gel dell'agarosi precedentemente è stata definita 14.
Nota: Per tutti i passaggi rimanenti, utilizzare barriera (filtro) dispensare consigli e materiali RNasi-free per garantire una produzione di alta qualità stabile del RNA. - Purificare il prodotto digerito utilizzando un protocollo di pulizia del DNA o kit convalidato ed eluire in acqua privo di RNAsi e dnasi di 30 µ l.
Nota: Rotazione di silice-matrice kit a base di colonna sono raccomandati per l'alta qualità, purificato del DNA. Seguire il protocollo di produttori di conseguenza. - In vitro trascrivere DNA usando T7 polimerasi seguendo il protocollo del produttore.
- Purificare ed eluire RNA in 30 µ l di acqua gratuita di RNAsi/dnasi utilizzando un kit di purificazione basata sulla colonna dell'acido nucleico di spin di silice-matrice seguendo il protocollo del produttore.
- Eseguire Denaturare Elettroforesi del gel di agarosio utilizzo di formaldeide per confermare il formato finale del prodotto di RNA. Vedere i passaggi 1.13-1.22 sotto il 14. (Figura 1).
- Preparare il gel di riscaldamento 1 g agarosio in 72 mL acqua fino a completa dissoluzione, poi raffreddare a 60 ° C.
- Preparare 10 X MOPS tampone di corsa aggiungendo 0,4 M MOPS (pH 7.0), acetato di sodio 0.1 M ed EDTA 0,01 M.
- Aggiungere 10 mL di 10 X MOPS in esecuzione buffer e 18 mL di formaldeide al 37% (12,3 M) per la soluzione di agarosio raffreddato.
- Casta il gel versando la soluzione di agarosio in un contenitore di gelificanti. Utilizzare un pettine grande abbastanza per ospitare 10 µ l. Dopo gel è impostata ed è sodo al tatto, rimuovere delicatamente il pettine.
- Assemblare il gel nel serbatoio dell'elettroforesi e aggiungere abbastanza 1 tampone in esecuzione X MOPS, assicurando il gel è completamente coperto.
- Preparare campione di RNA mediante l'aggiunta di 1 µ g di RNA a 0,5 volumi X della tintura di caricamento contenenti formaldeide.
- Aggiungere il bromuro di etidio alla soluzione di RNA ad una concentrazione di 10 µ g/mL.
- Denaturare soluzione di campione di RNA a 70 ° C per 5 min.
- Utilizzando sterile, 10 µ l filtro consigli, caricare 5 µ l di marcatore di peso molecolare e 5 µ l di RNA dei campioni in pozzetti separati del gel ed elettroforesi a 5 V/cm fino a quando il colorante è migrato almeno i due terzi della lunghezza del gel.
- Visualizzare il RNA nel gel su un illuminatore di trans UV. Garantire che RNA è la dimensione corretta confrontando il marker di peso molecolare.
- Per misurare la concentrazione e la purezza del RNA, trasferire 1,2 µ l di RNA purificato utilizzando sterile 10 µ l filtro consigli su uno spettrofotometro di UV.
Si noti che il RNA di alta qualità deve avere rapporti di assorbanza di A260/280 (1.8-2.2) e 260/230 (> 1.7) rispettivamente. - Utilizzando 10 µ l filtro consigli, aliquotare il rimanente RNA purificato nelle provette di sterile 0,5 µ l centrifuga (3-5 µ l/tubo). Archivio tubi a-80 ° C fino al momento per il microinjection.
Nota: Una concentrazione di iniezione finale di 500 ng / µ l è un punto di partenza ottimo. Si consiglia di diluire RNA 1:2 in RNasi free H20 prima microiniezione per ridurre la viscosità di RNA in pipetta microiniezione.
2. cinetocore-Microtubule allegato Assay
- Dividere gli ovociti in gruppi uguali per il microinjection.
Nota: Raccolta degli ovociti, trasferimento, microiniezione e maturazione meiotica è stata descritta in dettaglio in Giove precedentemente 15. - Microinject un gruppo con mRNA sperimentale e il o i gruppi con il controllo WT e PBS o Gfp mRNA.
Nota: 500 ng / µ l è la concentrazione di iniezione consigliati per iniziare con 10. Un picoinjector può essere utilizzato per controllare la quantità di iniezione. Un volume di iniezione di 5-10 pL è consigliato 15. - Usando una mano o bocca apparato pipettaggio azionato dove il vetro pipetta apertura è leggermente più grande del diametro di un ovocita (100-150 µm), trasferimento ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone in una capsula Petri coperto in embrione qualità olio minerale e incubare gli ovociti per 7 h a 37 ° C in 5% C02 per consentire la maturazione sufficiente alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) 15.
- Dopo l'incubazione, utilizzando la stessa apparecchiatura di pipetta come sopra, trasferire gli ovociti in un piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l del mezzo di raccolta di pre-refrigerati media essenziale minimo (MEM) nel centro ben e 500 µ l di H20 nell'anello esterno e piatto posto sul ghiaccio per 7 min.
Nota: Si consiglia di pre-chill media MEM e centrare bene piatti di cultura di organo a-20 ° C per almeno 20 minuti prima del trattamento degli ovociti. - Difficoltà gli ovociti trasferendoli utilizzando l'apparato di pipetta in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l di 2% paraformaldeide in 1X PBS per 20 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando la stessa pipetta apparato, trasferire gli ovociti in un altro pozzo su un piatto posto contenente 400 µ l di soluzione bloccante (PBS + 0,3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0,02% NaN3) e store a 4 ° C fino al momento di elaborare per immunostaining.
Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione. - Con la stessa pipetta apparecchiatura, ovociti di trasferimento ad un nuovo pozzo in un luogo piatto contenente soluzione di permeabilizzazione 400 µ l (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 20 ovociti trasferimento rapidamente attraverso tre gocce di 400 µ l blocco soluzione per rimuovere eventuali residui di detersivo.
Nota: Un piatto di vetro trasparente 9-pozzo posto funziona bene per lo spostamento di gruppi attraverso trattamenti multipli su un singolo piatto (passaggi 2.4-2.5). - Eseguire le restanti procedure di immunocitochimica in una camera umidificata, al riparo dalla luce a temperatura ambiente. Utilizzare un contenitore di plastica medie foderato con tovaglioli di carta umidi e coprire con foglio di alluminio.
- Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferire gli ovociti a 30 µ l blocco soluzione sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti e posto all'interno della camera umidificata per 10 min.
Nota: Gocce vengono inseriti nella circolare indentions sulla piastra. - Per etichettare i centromeri e mandrino, utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti in 30 µ l blocco soluzione contenente antigene anti-centromeriche (ACA, Crest) (01:30) e anti-acetilato tubulina (1: 1000) e incubare per almeno 1 h.
- Risciacquare gli ovociti trasferendo attraverso gocce tre 30 µ l di soluzione per 10 minuti ciascuno, di blocco.
- Utilizzando l'apparato di pipetta, trasferimento ovociti per un 30 µ l goccia di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari gratuiti agli anticorpi utilizzati sopra (anti-human IgG 1: 200, 1: 200 IgG anti-topo) e incubare per 1 h.
- Ripetere i passaggi di risciacquo 10 min 3, in 30 µ l soluzione di blocco come descritto al punto 2.11.
- Trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in 3-5 µ l montaggio medio contenente DAPI (5,9 µ g / µ l) su un vetrino per microscopio.
- Posto 4 piccole gocce (dimensioni di una testa di spillo) di gelatina di petrolio sugli angoli dei vetrini coprioggetto antischiacciamento degli ovociti.
- Delicatamente posizionare il lato di gelatina di petrolio di vetrini coprioggetto sulla diapositiva.
- Guarnizione vetrino coprioggetti bordi con chiaro smalto per unghie e lasciare per asciugare per 5 min.
- Archiviare le diapositive a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino al trattamento tramite microscopia confocale.
Nota: Assicurarsi che l'indice di rifrazione del mezzo di montaggio e il vetrino coprioggetti, partite i microscopio obiettivi utilizzati. Consigliata per il montaggio materiali precedentemente sono stati descritti 15. - Immagine utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando piccoli passi di ovociti (≤ 1 µm) nel piano z, ottimizzato per il lavoro obiettivo e l'immagine l'intera regione del mandrino metafase.
Nota: Assicurarsi che tutti i 3 canali basati su specifici anticorpi secondari utilizzati nel passaggio 2.11 di immagine. Immagine in media ≥ 4 e uno zoom di 3 è ideali per un'adeguata risoluzione. Una dimensione di passaggio 1 µm offre una visualizzazione chiara dei microtubuli e cinetocori in oocytes del mouse. La procedura per l'acquisizione immagine varierà da un microscopio. Consultare la Guida utente confocale produttore per istruzioni specifiche su come configurare le impostazioni di microscopio. - Identificare microtubulo-cinetocore allegato stato utilizzando il software di imaging seguendo passaggi 2,21-2.23 qui sotto.
Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo. Lo stato di attaccamento tipi precedentemente sono stati definiti 16 . - Apri immagine trascinando file nella barra degli strumenti immagine J.
- Aperto di z-serie, rendere tutti i canali visibili (DNA, cinetocore e mandrino) cliccando su "canali di Unione", disponibile nel menu a discesa "immagine", sotto la scheda di sub "colore".
- Utilizzando l'interruttore nella parte inferiore dell'immagine, spostare attraverso ogni fetta z e determinare allegato microtubule cinetocore. Allegato dettagliata descrizioni sono stati precedentemente descritti 16
3. cromosoma allineamento Challenge test
- Utilizzando l'apparato di pipetta come descritto al punto 2.3, trasferire gli ovociti in una goccia di 100 µ l di terreno di coltura privo di milrinone sott'olio e incubare gli ovociti per 7 h per consentire sufficiente maturazione alla metafase della meiosi ho (ho incontrato) come precedentemente descritto nel passaggio 2.3 17 .
Nota: Le procedure di raccolta, microiniezione e maturazione degli ovociti sono state delineate in precedenza 15. Riferisca al protocollo del saggio allegato nei passaggi 2.1-2.2 per i controlli e per le concentrazioni di microiniezione di RNA. - Con la stessa pipetta apparecchiatura, trasferimento ovociti ad una cultura centro-pozzo organo piatto contenente 700 µ l di coltura contenente monastrol [100 µM] in centro ben e 400 µ l H20 nell'anello circostante e incubare a 37 ° C per 2 h.
- Sciacquare monastrol trasferendo gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta come sopra, attraverso tre gocce di 100 µ l di CZB coltura e quindi trasferire gli ovociti per un nuovo piatto di cultura centro-pozzo organo contenente 700 µ l terreno di coltura + MG132 [5 µM] per 3 h al centro anello. Aggiungere 400 µ l H20 anello esterno.
- Difficoltà gli ovociti trasferendoli, utilizzando l'apparato di pipetta, in un pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l 2% paraformaldeide in PBS per 20 min a temperatura ambiente.
- Dopo la fissazione, trasferire gli ovociti, utilizzando l'apparato di pipetta, in un nuovo pozzetto di una piastra di vetro trasparente posto contenente 400 µ l soluzione bloccante e conservare a 4 ° C fino a elaborati per immunostaining.
Nota: per la memorizzazione di ovociti a 4 ° C, vetro di copertura piatto posto con parafilm per evitare l'evaporazione. - Permeabilize ed etichettare gli ovociti tramite immunocitochimica, come descritto nei passaggi 2.6-2.16.
- Immagine di ovociti utilizzando un obiettivo x 40-63 su un microscopio confocale, catturando < 1 µm passi nel piano z assicurandosi di tutta la regione del mandrino metafase di immagine.
- Per identificare l'allineamento del cromosoma stato aprire file di immagine utilizzando il software di imaging.
Nota: I passaggi seguenti descrivono questa procedura utilizzando il software scaricabile gratuitamente Image J (NIH), tuttavia, può essere utilizzato software di imaging alternativo. - Trascinare l'immagine nel pannello di controllo di immagine di J.
- Aperto di z-serie, utilizzare lo strumento punto (disponibile facendo clic sull'icona dello strumento punto sulla barra di controllo immagine J) per segnare punti alla fine di ciascun polo dell'alberino nei loro rispettivo fetta z posizionando lo strumento sopra il palo del mandrino nell'immagine e cliccando sull'immagine. Aggiungere questi punti nella regione di interesse (ROI) manager premendo comando + t sulla tastiera.
- Determinare le coordinate specifiche per ciascuna delle posizioni impostate al punto 3.10 mettendo in evidenza il punto specifico in gestione ROI e facendo clic sul pulsante di misura. Ciò fornirà un risultati contenenti tabella coordinate x e y per ogni punto. Questi saranno i punti X1, Y1 e X1, Y2, rispettivamente.
- Successivamente, determinare la coordinata Z true. Questo viene fatto moltiplicando il numero di slice della z-fetta specifico nello z-stack in cui è stato identificato il polo dell'alberino (cioè fetta #2 di 6) che ogni singolo punto è dallo spessore dello stack (cioè 1 µm) (esempio: affettare 2 x 1 µm = 2). Questi saranno i punti Z1 e Z2, rispettivamente.
- Determinare la lunghezza del mandrino usando l'equazione del teorema di Pitagora (a2 + b2 = c2) utilizzando il precedentemente definito coordinate x, y e z da passaggi 3.11-3.13. Per ogni mandrino lunghezza finale è uguale a:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Determinare la fosforila mandrino. È calcolato come metà della lunghezza del mandrino. Utilizzando lo strumento di riga di immagine J, facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea che va da un polo di mandrino a fosforila il mandrino. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J.
- Determinare lo stato di allineamento del cromosoma valutando la distanza del cromosoma dalla fosforila mandrino utilizzando lo strumento di misurazione di linea. Utilizzando lo strumento della riga disponibile facendo clic sull'icona linea nella barra degli strumenti immagine J, disegnare una linea da fosforila il mandrino al cromosoma. La lunghezza verrà visualizzata sulla barra degli strumenti immagine J. Maggiore di 4 µm da fosforila il mandrino di cromosomi sono considerati non allineati 18.
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Representative Results
Dopo in vitro trascrizione RNA di alta qualità avrà un rapporto A260/A280 di (1.8-2.2) e un ≥1.7 di rapporto A260/A230 quando misurata con uno spettrofotometro. L'immagine nella Figura 1 Mostra la migrazione di in vitro-prodotto RNA su un gel di agarosio denaturante dopo elettroforesi. Una band che è spalmata in modello o un campione che ha bande di dimensioni multiple può indicare contaminazione o degradazione del campione. In alternativa, bande multiple possono indicare che il mRNA non è completamente denaturato, oppure il plasmide di partenza non era completamente linearizzato. Il mRNA verrà eseguito più grandi del previsto a causa della coda di poli-adenylated costruita in pIVT, che permette l'espressione stabile di mRNA in vitro. Dopo microiniezione si raccomanda di garantire volumi di iniezione uniforme ed i livelli di espressione tramite microscopia fluorescente. L'immagine nella Figura 2 Mostra profase ovociti sono-arrestato uniformemente iniettati con Gfp. Tecnica di microiniezione coerente è fondamentale per questo protocollo. Software di analisi di immagine, come immagine J, può essere utilizzato per convalidare i livelli di espressione per garantire uniformità e padronanza della tecnica. Si noti che la localizzazione sottocellulare informazioni possono essere ottenute facendo l'imaging per entrambe le analisi. Per tutti gli esperimenti di microiniezione valutare gli effetti di una variante del gene, il gene del tipo selvatico deve essere iniettato in un sottoinsieme degli ovociti per servire come un controllo. Questo permette al controllo per potenziali fenotipi di sovraespressione del gene umano in un oocita di mouse. PBS, o Gfp per costrutti fluoroforo, dovrebbe essere anche essere iniettato in un sottogruppo di ovociti al controllo per fenotipi microiniezione-indotta. Per i costrutti senza un tag fluorescente, Gfp mRNA può essere co-iniettate per garantire sufficiente microiniezione. Se co-iniezione simultaneamente due o più costrutti assicuratevi di aumentare la concentrazione di mRNA, tale che la soluzione finale contiene 500 ng / µ l di ciascun mRNA.
Il dosaggio dei microtubuli freddo-stable fornisce uno strumento prezioso per valutare lo stato di attaccamento dei cinetocori ai microtubuli. Nella figura 3 è una z-proiezione di un'immagine al microscopio confocale di una metafase ho degli ovociti. Questo ovocita è stato sottoposto a trattamento freddo media per depolymerize tutti i microtubuli che non avevano attaccato ai cinetocori. Gli ovociti che sono stati trattati per un tempo insufficiente conterrà fibre di microtubuli non associate a cromosomi (troppo breve risultati in troppe fibre) o mancanza di fibre tutti insieme (troppo lungo risultati in nessuna struttura mandrino) ed è raccomandato che questi ovociti non essere usato nell'analisi. A metafase della meiosi è comune per gli ovociti contenere cinetocori non collegati o lateralmente fissati, pertanto si raccomanda che un gruppo di controllo essere utilizzato in qualsiasi studio di attaccamento. In media, selvaggio-tipo ovociti conterranno 5-10% dei cinetocori a volontà MI non ancora essere stabilmente allegato 19. È essenziale che tutti gli ovociti sia nella stessa fase per analisi dello stato di microtubulo-cinetocore allegato. Per garantire che sperimentali e gruppi di controllo maturo con simili scale temporali si consiglia di valutare la cinetica del ciclo cellulare. Per eseguire questo test, un sottoinsieme di controllo e di ovociti sperimentali dovrebbe essere regolato e visualizzato dal vivo sotto microcopy time-lapse. L'uso di milrinone permette ovociti da sincronizzare in profase della meiosi I, tale che il rilascio in media carenti milrinone con consentono la ripresa della meiosi al tempo stesso 20. Ovociti da gruppi sperimentali sia di controllo dovrebbero estrudere un corpo polare, indicativo di raggiungere metafase della meiosi II (II incontrato), intervalli di tempo simile. Se non è disponibile la microscopia di cellule vive, ovociti possono essere maturati al Met ho (7 h) e al Met II (16h), fissa e macchiato per rilevare il DNA e i microtubuli come descritto in precedenza. Al Met I e II ha incontrato un mandrino a forma di botte, bipolare dovrebbe essere visibile. In ovociti di controllo, i cromosomi devono essere allineati alla piastra di metafase. L'allineamento dei cromosomi differirà in gruppi sperimentali a seconda della variante colpisce, tuttavia, i cromosomi devono essere condensati e associati ai microtubuli con la maggior parte dei cromosomi in posizione centrale sul mandrino. Un simile numero di ovociti dovresti aver raggiunto meiosi II nel controllo e nei gruppi sperimentali. Per ridurre le difficoltà nella determinazione allegato stato che è consigliabile imaging ovociti utilizzando piccoli passi nel piano z, ottimizzato per l'obiettivo specifico di lavoro. Analisi coinvolgerà visualizzazione le z-fette singolarmente e nelle impostazioni Unite per determinare quale polo associato microtubuli emanano da. Figura 3B illustra esempi di attacchi anormale cinetocore-dei microtubuli. Viene mostrato un bivalente in cui solo una sorella coppia cinetocore è collegato a un microtubulo mandrino, definito come nessun allegato. Successivamente, un allegato di syntelic è mostrato nella quale entrambi sorella paia cinetocore è attaccati al Polo mandrino stesso. Per concludere, un allegato di merotelic è indicato in quale una sorella cinetocore sono collegata a entrambi i poli mandrino mentre l'altra sorella cinetocore della coppia sono attaccata ad un palo singolo mandrino.
Le immagini nella Figura 4 illustrano il DNA previsto progressivo e mandrino configurazioni come uno si muove attraverso i passi del test cromosoma allineamento sfida. In questo test è fondamentale che i differenti gruppi sperimentali progredire attraverso meiosi con cinetica di simile. Come descritto in precedenza è consigliabile per la realizzazione di analisi cinetica ciclo cellulare prima di svolgere l'analisi di sfida. In questa analisi, è valutata la capacità per ovociti correggere con successo gli allegati anormale cinetocore-dei microtubuli. Per eseguire questo test, gli ovociti sono maturati prima al Met ho per consentire gli allegati del microtubulo-cinetocore da stabilire. Successivamente, gli ovociti vengono incubati nei monastrol e 5 chinesina (EG5) inibitore, che collassa il mandrino bipolare in un monopolare mandrino 21. La generazione di un monopolare mandrino induce allegati non corretti microtubulo-cinetocore 100%. L'inibitore di monastrol allora è lavato per permettere il recupero. Durante il periodo di recupero gli ovociti rigenerano un mandrino bipolare e tentano di correggere gli allegati dei microtubuli. Aggiunta di inibitore del proteosoma MG132 previene la comparsa di anafase. Come un controllo, un piccolo sottoinsieme di ovociti da ogni gruppo sperimentale può essere fissato in ogni fase nel protocollo (incontrato I, monastrol trattati, recupero post) per garantire a tutti i gruppi stanno rispondendo ai trattamenti e nella stessa misura. Metafase I oocytes dovrebbe contenere un mandrino bipolare a forma di botte con cromosomi allineati alla piastra di metafase. Ovociti trattati con monastrol devono contenere un monopolare mandrino con cromosomi orientati intorno al palo singolo. Ovociti recuperati ancora una volta dovrebbero contenere un mandrino bipolare a forma di botte. Allineamento del cromosoma è definito come qualsiasi cromosomi più di 4 μM dal mandrino midzone 22. È utile colorare gli ovociti per rilevare il DNA e i cinetocori per stabilire se entrambi cinetocori sono all'esterno di questa zona centrale come questo può essere difficile determinare utilizzando solo la rilevazione del DNA.
Figura 1. L'elettroforesi del gel di Denaturingagarose di RNA. Dimensioni e qualità di RNA può essere valutate tramite l'elettroforesi su un gel denaturante dell'agarosi. Un gel denaturante è raccomandato per prevenire la formazione di struttura secondaria. Lane 1 contiene un marcatore di peso molecolare di RNA. 2 Lane è un campione di RNA. Nota che il RNA viene eseguito più grande di quanto calcolato a causa della coda di polyA incorporato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Convalida di microiniezione ovocitaria. Microscopia fluorescente può essere utilizzata per convalidare espressione e microiniezione di successo degli ovociti. Gli ovociti sono-arrestato profase microiniettati con Gfp sono indicati dopo una notte espressione del costrutto. Questa immagine è stata ottenuta usando il Invitrogen EVOS FL Auto sistema dotato di cubo luminoso GFP di imaging. Barra della scala è 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Valutare gli allegati cinetocore-microtubule. (A), A rappresentante z-proiezione di un freddo-trattati ho incontrato degli ovociti. Mandrino (verde), Chinetocori (rossi) ed il DNA (blu) vengono visualizzati. La casella indica la regione dello zoom ottico. Le frecce indicano fine-su allegati dei cinetocori ai microtubuli di un singolo bivalente. Barra della scala è di 10 µm per mandrino, cinetocore, DNA e canali di tipo merge. Barra della scala per lo zoom ottico è 5 µm. (B) esempi di tipi di allegati di anormale cinetocore-microtubule nei oocytes del mouse. Le frecce indicano siti allegato microtubulo-cinetocore. Barra della scala è 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Il test di sfida di allineamento di cromosomica. Diagramma di flusso della procedura con rappresentante z-le proiezioni degli ovociti ad ogni passo. Gli ovociti sono maturati prima alla metafase della meiosi ho (ho incontrato), poi trasferito in un nuovo piatto contenente monastrol per 2 h per indurre la formazione di monopolare mandrino. Prossimi ovociti sono autorizzati a recuperare in medium di maturazione completate con un inibitore del proteasoma (MG132) per impedire l'inizio di anafase per 3 h. Una volta recuperati gli ovociti sono fissi, etichettati per mandrino (verde), Chinetocori (rossi) ed il DNA (blu) e imaged tramite microscopia confocale per determinare lo stato di allineamento. Le linee indicano la lunghezza del mandrino (40 µm) e mandrino fosforila (20 µm) determinata tramite l'equazione del teorema di Pitagora. Le frecce indicano posizioni utensile punto a ciascun polo. Qualsiasi cinetocori > 4 µm da fosforila il mandrino sono considerati non allineati. Asterisco indica cromosoma non allineato (5,6 µm da fosforila). Barra della scala è 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
A causa l'identificazione rapida e crescente di varianti genetiche umane associati alla malattia, è essenziale che i sistemi sono stabiliti per valutare il loro significato biologico. Capire la funzione della proteina in meiosi umana pone sfide particolari perché ovociti umani sono preziosi e raro e umano dello sperma non è suscettibile di manipolazione genetica. Oocytes del mouse sono un sistema di modello mammifero prezioso per la valutazione umana del gene meiotica funzione 10,23. Questo modello consente di ignorare i vincoli dell'utilizzo di ovuli umani fornendo al contempo una fonte prontamente disponibile di ovociti a basso costo, manipolabile che subiscono meiosi simili alle cellule germinali umane mentre essendo utili per comprendere le varianti genetiche come può avere un impatto donna fertilità.
Poiché questi metodi utilizzano l'espressione ectopica della proteina umana nei oocytes del mouse tramite microiniezione, è fondamentale innanzitutto stabilire una concentrazione di controllo, RNA di tipo selvatico che non alterano la maturazione meiotica. È consigliabile che la cinetica di maturazione meiotica sono monitorati (involucro nucleare ripartizione, estrusione corpo polare) in ovociti di controllo per stabilire i parametri della linea di base e valutazione morfologia dell'alberino e del cromosoma. Inoltre, garantire volumi di microiniezione uniforme è fondamentale per confronto tra gruppi. Tra cui un tag fluorescente il gene di interesse, è possibile semplificare questa sfida tecnica. Tecniche per padroneggiare la microiniezione degli ovociti sono state precedentemente dimostrata 15. Visualizzazione degli ovociti iniettati sotto un microscopio a fluorescenza o determinare l'espressione della proteina tramite western blot sono anche strumenti preziosi per la conferma di concentrazioni di iniezione costante.
Perché errori nella segregazione del cromosoma in mammiferi ovociti sono delle cause principali di aneuploide embrionali e gravidanza perdita5, analisi di allegati cinetocore-microtubule forniscono uno strumento prezioso per valutare se un gene di interesse colpisce segregazione del cromosoma (cioè improprio allegati causerà mis-segregazione). Un'esposizione di 10 min a mezzi refrigerati è sufficiente depolymerize microtubuli che non hanno un attaccamento microtubulo-cinetocore, permettendo la visualizzazione di allegati stabili tramite microscopia confocale 24. Per questo test, è importante non over-chill gli ovociti come questo porterà alla depolimerizzazione dei microtubuli stabili. Inoltre, ottimizzazione delle procedure di colorazione è la chiave per la visualizzazione delle strutture cinetocore e dei microtubuli. Per garantire la risoluzione di immagine adeguata per l'analisi, piccoli passi (≤ 1 μm) nel piano z-utilizzando un 40x x-63 obiettivo dovrebbe essere catturato, e ottenere immagini attraverso la struttura intera mandrino per garantire tutti gli allegati sono visibili. Si noti che è comune avere unattached cinetocori durante prometafase della meiosi ho 25.
Il dosaggio di sfida di allineamento del cromosoma è utile per la valutazione delle varianti di guadagno o perdita di funzione. Varianti di guadagno di funzione possono essere difficile da valutare perché oocytes del mouse da giovani femmine hanno bassi livelli di aneuploidia. Questo test supera questo ostacolo generando una situazione in cui l'ovocita deve correggere gli allegati cinetocore-microtubule non corretto sperimentalmente indotta. Che istituisce un punto di tempo in cui gli ovociti controllo contengono 1-2 disallineati cromosomi dopo recupero fornisce uno scenario quantificabile per determinare se un mutante fornisce efficienza maggiore allineamento (cioè migliore allineamento funzionalità sarà proteggere euploidia). Per la quantificazione di disallineamento del cromosoma, un protocollo precedentemente stabilito in quali cromosomi maggiori di 4 μm dal mandrino fosforila sono caratterizzati come non allineato possono essere usate 18.
Per studiare la perdita di funzione varianti, ulteriori condizioni sperimentali sono necessari a causa dell'omologo endogena all'interno del sistema di studio. Un modo per alleviare questo problema è quello di utilizzare o generare un modello del mouse di knockout della variante di interesse. L'avvento del sistema Crisper/Cas9 potrebbe fornire un modo rapido per generare tali fori 26. In alternativa, se un modello di knockout non è un'opzione, tecniche di atterramento classiche come co-iniezione di oligonucleotidi antisenso morpholino o small interfering RNA potrebbero essere impiegati. Tuttavia, attenzione per il design di sequenza è necessaria per evitare potenziali interferenze con la variante iniettata sotto studio. Ad esempio, gli oligonucleotidi morfolino potrebbero essere concepito per legarsi alla regione 5' non tradotta (5' UTR) del gene del mouse che non è incluso nella variante mRNA umano introdotta mediante microiniezione. Se utilizza interferire piccolo RNAs uno potrebbe una regione non-omologo sequenza di destinazione o introdurre silenziose mutazioni puntiformi nel gene umano che potrebbe eludere il targeting. Tuttavia, avendo la copia di proteina endogena ancora presente al momento di espressione della variante può essere informativo come molte varianti si trovano nella condizione eterozigotica nel genoma umano.
Infine, anche se non descritto in questo protocollo, valutazione di aneuploide del cromosoma può essere facilmente valutata in uova incontrato II come il saggio finale in cantiere per analisi di variante umana. Una descrizione dettagliata di questo in situ cromosoma diffuso protocollo precedentemente ha descritto 15. Brevemente, gli ovociti iniettati sono maturate in vitro fino a raggiungere la fase II ha incontrato, dopo il trattamento con un agente dell'alberino-destrin meiotico prima della fissazione. Cinetocore e cromosoma colorazione come descritto qui consentire per la valutazione del contenuto di cromosoma.
Mentre oocytes del mouse forniscono un prezioso strumento per lo studio delle proteine critiche alla meiosi femminile alcune limitazioni per l'esiste modello. Sovraespressione di proteine possa perturbare la maturazione meiotica e quindi una concentrazione di RNA non può esistere che non induce un fenotipo. Inoltre, omologo del topo endogena può interferire con la localizzazione della proteina umana esogena. Generazione di modelli murini knockout fornisce una soluzione a questo problema; Tuttavia, questo potrebbe non essere fattibile in tutte le situazioni. Un approccio alternativo sarebbe per vuotare la proteina del mouse iniettando co-RNAi o oligonucleotidi morfolino progettato per non bersaglio esogeno RNA e proteina. Infine, è importante notare che mentre molte proteine sono omologhi tra umano e del mouse, possono esistere differenze, che portano a differenze di localizzazione e funzione che poteva ostare a che questo tipo di analisi cross-specie. Come strumenti di manipolazione genetica come Cas9-genoma editing27 diventano meno costoso e più comune-posto, questo protocollo potrebbe evolvere in rendendo topo knock-in, umanizzato linee invece di affidarsi a microiniezione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un Grant di ricerca della American Society for Reproductive Medicine e da Charles e Johanna Busch Memorial Fund presso la Rutgers, The State University di NJ per K.S. A.L.N. era sostenuta da una sovvenzione del N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
