Summary
Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.
Abstract
Embryonalen Aneuploidie ist die große genetische Ursache der Unfruchtbarkeit beim Menschen. Stammen die meisten dieser Ereignisse während der weibliche Meiose, und wenn auch positiv korreliert mit dem mütterlichen Alter, Alter allein ist nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Daher könnten falsche Chromosom Abtrennung während Oogenese Genvarianten entfallen. Angesichts der Tatsache, dass Zugang zu menschlichen Eizellen für Forschungszwecke beschränkt ist, eine Reihe von Tests wurden entwickelt, um menschliche Gen-Funktion während der Meiose ich benutze Maus Eizellen untersuchen. Erstens sind Boten-RNA (mRNA) des Gens und Genvariante des Interesses in Prophase-verhaftet Maus Eizellen mikroinjiziert. Nachdem Sie Zeit für Ausdruck, Eizellen sind synchron freigesetzt meiotische Reifung Meiose abgeschlossen ich. Durch die Kennzeichnung der mRNA mit einer Abfolge von fluoreszierenden Reporter, wie grün fluoreszierendes Protein (Gfp), kann die Lokalisierung des menschlichen Proteins neben der phänotypischen Veränderungen beurteilt werden. Z. B. Gewinn oder Verlust der Funktion durch die Gründung der experimenteller Bedingungen, die das Genprodukt meiotischen Fehler beheben Herausforderung untersucht werden kann. Obwohl dieses System bei der Untersuchung von menschlichen Proteinfunktion während Oogenese vorteilhaft ist, sollten angemessene Interpretation der Ergebnisse durchgeführt werden, da die Proteinexpression auf endogene Ebenen nicht ist und, sofern nicht für (d.h. klopfte gesteuert heraus oder unten) sind murinen homologe auch im System vorhanden.
Introduction
Unfruchtbarkeit ist eine Erkrankung, die 10-15 % der menschlichen Bevölkerung der gebärfähigen Alter 1, betroffen, von denen fast die Hälfte medizinische Behandlung 2suchen. Obwohl die Ätiologie der Unfruchtbarkeit vielfältig ist und in vielen Fällen multifaktoriell, die häufigste genetische Anomalie beim Menschen embryonale Aneuploidie 3 ist. Aneuploidie ist definiert als die Abweichung (Gewinn oder Verlust) der die richtige Anzahl an Chromosomen in einer Zelle. Das Phänomen der Aneuploidie in menschlicher Embryonen ist verbreitet und steigt mit dem mütterlichen Alter 4,5. Vier randomisierte kontrollierte Studien haben deutlich gemacht, dass den nutzen nur chromosomal normale (euploide) Embryonen für uterine Übertragung zu wählen, weil diese Strategie führte zu erhöhten Implantation Raten, niedrigere fehl- und eine kürzere Zeit für Schwangerschaft- 6,7,8,9zu erreichen. Daher haben Verständnis der Ätiologie der menschlichen Aneuploidie wichtige Implikationen in der assistierten Reproduktion.
Obwohl vor der Implantation Gentests für Aneuploidien bei unfruchtbarkeitbehandlungen vorteilhaft ist, fehlt noch ein gründliches Verständnis der wie Aneuploidien stammen. Es ist weithin anerkannt, dass es eine positive Korrelation von meiotischen Aneuploidien (entstanden während der Produktion von Gameten) und Alter der Mutter, aber einige Frauen anwesend embryonalen Aneuploidie-Preise, die von den Mittelkurs für ihre bestimmten Alter 4abweichen. Diese Fälle zeigen, dass Alter allein nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Andere Faktoren können eine Rolle bei der Erhöhung des embryonalen Aneuploidie, z. B. Genvarianten spielen.
Ein wesentlicher Aspekt den möglichen Beitrag der eine Genvariante, Aneuploidie während der Eizelle Meiose zu untersuchen ist, ein System für meiotische Genfunktion schnell bewerten zu entwerfen. Aufgrund der ethischen Einschränkungen und begrenzten Zugang ist es unpraktisch, diese Experimente mit menschlichen Eizellen. Diese Probleme können mithilfe der Maus Eizellen umgangen werden, und hier eine Reihe von Tests zu menschlichen Gens Funktion während der Meiose zu beurteilen sind ich beschrieben. Von microinjecting, die Boten-RNA (mRNA) Kodierung für die Genvariante von Interesse, die Lokalisierung des menschlichen Proteins in der Maus Ei visualisiert und verwendet, um festzustellen, ob die ektopische Expression des Wildtyp und mutierten menschlichen Proteins ergibt sich eine phänotypischen Veränderungen, die Aneuploidie führen könnte. Diese Phänotypen gehören eine Erhöhung der Mikrotubuli, die an die falsche Schwester Kinetochor und die Unfähigkeit, Chromosom Ausrichtung auf Metaphase der Meiose I. vor allem zu unterstützen, dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gewinn und Verlust der Funktion untersuchen genetische Varianten durch die Festlegung von bestimmter experimenteller Bedingungen wie herausfordern Schlüsselereignisse in Eizelle Meiose Spindel Gebäude und Chromosom Ausrichtung 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
(1) molecular Cloning
- Full-Length kodierende Sequenz des Gens von Interesse erhalten und die Plasmid in Vitro Transkription (pIVT) Vektor-11.
Hinweis: In voller Länge cDNA Clones sind von verschiedenen Herstellern im Handel erhältlich oder können über reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) generiert werden. Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Online-Ressource bietet Transkript Sequenzen für Gene aus der Nucleotide und ausgedrückt Sequenz markiert (EST) Datenbanken. Zur Erleichterung des Proteins können Visualisierung und Analyse von Ausdruck Niveaus, Fusion, grün fluoreszierendes Protein (Gfp) oder eine andere geeignete fluoreszierende Tag in der Klonen Strategie erwünscht sein. - Mittels einer validierten Klonen Strategie legen Sie die kodierende Sequenz des Gens von Interesse in mehreren Klonen und Umgebung pIVT. Eine detaillierte Beschreibung der molekularen Klonen und die erforderlichen Schritte wurden zuvor beschriebenen 12.
Hinweis: Wenn ein Gen-Fusion Produkt generiert werden, sicher sein, dass das Klonen ist in den richtigen Leseraster. - Sequenz das Konstrukt mit Globin Primer um sicherzustellen korrekte gen einsetzen, richtige in-Frame Fusion und keine Polymerase-induzierte Punktmutationen entstanden.
Hinweis: Wenn DNA Sanger-Sequenzierung Ausrüstung nicht verfügbar ist, bieten viele Unternehmen kostengünstige Optionen der DNA-Sequenzierung. - Mutagenize DNA, wenn Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Einfügungen/Löschungen (INDELS) zu generieren. DNA-Mutagenese wird in Schritte 1.5-1.7 unten beschrieben. Wildtyp Konstrukte fahren Sie fort mit der Linearisierung Schritt 1,7.
- Design-Mutagenese Primer und vervollständigen die Mutagenese-PCR-Reaktion um mutierte Konstrukt pro des Herstellers Protokoll zu generieren. PCR-vermittelten Site-verwiesene Mutagenese wurde zuvor beschriebenen 13. Darüber hinaus bieten viele Unternehmen Site-verwiesene Mutagenese-Kits die Protokolle enthalten.
- Verwandeln Sie mutagenisierter DNA in bakterielle Host. Isolieren und Plasmid zu reinigen.
Hinweis: Viele Unternehmen stellen Kits, die lässt sich leicht isolieren und reinigen Plasmid DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend. Wenn ein gramnegatives Bakterienstamm wie E. Coliverwenden, empfiehlt es sich, ein Kit zu verwenden, die Endotoxine entfernt. - Die isolierte DNA aus bakteriellen transformanten verwenden standard Sanger-Sequenzierung zur Bestätigung der Einführung des gewünschten SNP oder INDEL-Sequenz.
- Linearisieren Sie Endprodukte mit einzelnen Beschränkung Enzym Verdauung der gereinigte DNA.
Hinweis: Der pIVT Vektor enthält mehrere Single-Enzym schneiden in der Plasmid-Karte auf Addgene 14aufgeführten Websites. - Stellen Sie sicher, dass das Produkt linear über Agarose-Gelelektrophorese. Die Methodik für die Agarose-Gelelektrophorese wurde zuvor definierten 14.
Hinweis: Für alle verbleibenden Schritte verwenden Sie Barriere (Filter) pipettieren Tipps und RNase-freie Materialien zur Herstellung von stabilen, hochwertigen RNA zu gewährleisten. - Reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem validierten DNA-Aufräum Protokoll oder Kit und eluieren in 30 µL RNase/DNase-freies Wasser.
Hinweis: Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Kits sind empfehlenswert für qualitativ hochwertige, gereinigte DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend. - In-vitro- Transkription DNA mit Hilfe T7-Polymerase nach Protokoll des Herstellers.
- Reinigen Sie und eluieren Sie RNA in 30 µL RNase/DNase freies Wasser mit einem Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Nukleinsäure Reinigung Kit nach der Hersteller-Protokolls.
- Führen Sie denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese mit Formaldehyd, um die endgültige Größe der RNA-Produkt zu bestätigen. Finden Sie unter Schritte 1.13-1.22 unter 14. (Abbildung 1).
- Bereiten Sie Gel durch Erhitzen 1 g Agarose in 72 mL Wasser aufgelöst, dann auf 60 ° c abkühlen lassen
- Bereiten Sie 10 X MOPS laufen Puffer durch Zugabe von 0,4 M MOPS (pH 7,0), 0,1 M Natriumacetat und 0,01 M EDTA vor.
- Zugeben Sie 10 mL 10 X MOPS laufen Puffer und 18 mL 37 % Formaldehyd (12,3 M) bis zur gekühlten Agarose-Lösung.
- Kaste das Gel durch die Agarose-Lösung in einem gelbildenden Behälter gießen. Verwenden Sie einen Kamm groß genug für 10 µL. Nachdem Gel gesetzt hat und fest im Griff ist haben, entfernen Sie vorsichtig den Kamm.
- Montieren Sie das Gel in der Elektrophorese-Tank, und fügen Sie genug 1 X MOPS laufen Puffer, sicherzustellen, dass das Gel vollständig bedeckt ist.
- Bereiten Sie RNA-Probe durch Zugabe von 1 µg RNA bis 0,5 X Datenmengen formaldehydhaltigen laden Farbstoff vor.
- RNA-Lösung mit einer Konzentration von 10 µg/mL Interkalation Bromid hinzufügen.
- Denaturieren Sie RNA Beispiellösung bei 70 ° C für 5 Minuten.
- Verwendung von sterilen, 10 µL Filterspitzen, laden 5 µL Molekulargewicht Marker und 5 µL RNA Probe(n) in separaten Vertiefungen des Gels und electrophorese mit 5 V/cm, bis der Farbstoff mindestens zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat.
- Visualisieren Sie die RNA in das Gel auf eine UV-Trans-Hilfslicht. Sicherstellen Sie, dass die RNA die richtige Größe hat, durch den Vergleich mit dem Molekulargewicht Marker.
- Zur Messung der Konzentration und Reinheit der RNA übertragen Sie 1,2 µL gereinigten RNA mit sterilen 10 µL-Filter-Tips auf einem UV-Spektrophotometer.
Beachten Sie, dass hochwertige RNA Extinktion Verhältnisse der A260/280 (1,8-2,2) und 260/230 haben sollte (> 1,7) beziehungsweise. - Verwenden 10 µL Filterspitzen, aliquoten die restlichen gereinigte RNA in sterile 0,5 µL Zentrifuge Röhren (3-5 µL/Rohr). Röhren bei-80 ° C bis bereit für die Mikroinjektion zu speichern.
Hinweis: Eine Konzentration der letzten Injektion von 500 ng/µL ist ein optimaler Ausgangspunkt. Es wird empfohlen, die RNA verdünnen 1:2 in RNase H20 vor der Mikroinjektion zu verringern Klebrigkeit der RNA in Mikroinjektion Pipette frei.
(2) Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Assay
- Unterteilen Sie Eizellen in gleich große Gruppen für die Mikroinjektion.
Hinweis: Eizellenentnahme, Transfer, Mikroinjektion und meiotischen Reifung hat in Jupiter ausführlich beschrieben wurden bisher 15. - Microinject, eine Gruppe mit experimentellen mRNA und die anderen Gruppen mit dem WT-Kontrolle und PBS oder Gfp mRNA.
Hinweis: 500 ng/µL ist die empfohlene Injektion Konzentration mit 10beginnen. Ein Picoinjector kann zur Injektion Beträge zu kontrollieren. Ein Injektionsvolumen von 5-10 pL wird 15empfohlen. - Mit einer Hand oder Mund betriebenen pipettieren Apparat, wo das Glas pipette Öffnung, leicht ist im Embryo Qualität Mineralöl größer als der Durchmesser einer Eizelle (100-150 µm), Transfer Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium in einer Petrischale abgedeckt und inkubieren Sie Eizellen für 7 h bei 37 ° C in 5 % C02 ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) 15.
- Nach der Inkubation mit derselben Pipette Apparatur wie oben beschrieben, Eizellen in der Mitte gut Orgel Kulturschale mit 700 µL vorgekühlt minimale wesentlichen Medien (MEM) Sammlung Medium in der Mitte gut und 500 µL H20 in den äußeren Ring zu übertragen und Legen Sie Gericht für 7 min auf Eis.
Hinweis: Es wird empfohlen, vorab chill MEM Media und Mitte gut Orgel Kultur Gerichte bei-20 ° C für mindestens 20 Minuten vor der Behandlung der Eizellen. - Befestigen Sie die Eizellen übertragen sie mit Hilfe der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
- Mit gleichen pipette Apparat, übertragen die Eizellen in einem anderen Brunnen auf einem Fleck Teller mit 400 µL blocking Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3) und Store bei 4 ° C bis bereit für Immunostaining verarbeiten.
Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern. - Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einem neuen Brunnen an einem Ort Platte mit 400 µL Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Transfer Eizellen schnell durch drei 400 µL Tropfen blockiert Lösung um jede verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen.
Hinweis: Eine 9-gut klare Glasplatte vor Ort eignet sich gut für Gruppen durch mehrere Behandlungen auf ein einziges Gericht (Schritte 2,4-2,5) verschoben. - Führen Sie die verbleibenden Immunocytochemistry Verfahren in eine Feuchte Kammer, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Verwendung einer mittelständischen Kunststoff-Behälter gefüttert mit feuchten Papiertüchern und mit Alufolie abdecken.
- Mit der Pipette Apparat übertragen Eizellen zu 30 µL Lösung auf dem Deckel einer 96-Well-Platte und Ort innerhalb der Feuchte Kammer für 10 Minuten blockiert.
Hinweis: In den runden Einkerbungen auf der Platte befinden sich Tropfen. - Beschriften Sie Zentromere und Spindel, mit Hilfe der Pipette Apparat, transfer Eizellen zu 30 µL blockiert Lösung mit Anti-Zentromer Antigen (ACA, Crest) (01:30) und Anti-acetyliert Tubulin (1: 1000) und inkubieren Sie für mindestens 1 h.
- Spülen Sie Eizellen durch die Übertragung durch drei 30 µL Tropfen Lösung für 10 min zu blockieren.
- Mit Hilfe der Pipette Apparat, Transfer Eizellen zu 30 µL drop von blockierenden Lösung, komplementär zu den Antikörpern verwendet oben (Anti-Human IgG 1: 200, Anti-Maus IgG 1: 200) sekundäre Antikörper enthält und 1 h inkubieren.
- Wiederholen Sie die 3, 10 min spülen Schritte in 30 µL Lösung blockiert, wie in Schritt 2.11 beschrieben.
- Transfer die Eizellen, die mit der Pipette Apparat in 3-5 µL Montage mittlerer mit DAPI (5,9 µg/µL) auf einen Glas-Objektträger.
- Legen Sie 4 kleine Tropfen (groß wie ein Stecknadelkopf) Vaseline an den Ecken des Deckglases, Zerkleinerung von Eizellen zu verhindern.
- Legen Sie sanft die Deckglas Vaseline Seite nach unten auf die Folie.
- Versiegeln Sie Deckglas Kanten mit klaren Nagellack und 5 Minuten trocknen lassen.
- Bewahren Sie Folien bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt auf.
Hinweis: Sicherstellen der Brechungsindex des Eindeckmittel und Deckglas, Spiele die Mikroskop-Ziele genutzt. Empfohlene Montage, die Materialien bisher beschriebenen 15. - Bild von Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, kleine Schritte zu erfassen (≤ 1 µm) in der Z-Ebene, für die Arbeiten Ziel, und das Image der gesamten Region der Metaphase Spindel optimiert.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle 3 Kanäle, basierend auf spezifischen Sekundärantikörper verwendet im Schritt 2.11 Bild. Bild von durchschnittlich ≥ 4 und ein Zoom von 3 sind ideal für ausreichende Auflösung. Eine 1 µm Schrittgröße bietet übersichtliche Visualisierung von Mikrotubuli und Kinetochore in Maus Eizellen. Das Verfahren für die Bilderfassung variiert von Mikroskop, Mikroskop. Entnehmen Sie bitte der Hersteller konfokale Benutzerhandbuch für konkrete Schritte zum Mikroskop-Einstellungen konfigurieren. - Identifizieren Sie Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Status mithilfe von imaging-Software folgende Schritte 2.21-2.23.
Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden. Anlage-Status, die Arten bisher definiert 16 . - Bild öffnen, indem Sie die Datei in Bild J-Tool-Leiste ziehen.
- Machen Sie in der geöffneten Z-Serie alle Kanäle sichtbar (DNA, Kinetochor und Spindel) durch Klicken auf "Kanäle zusammenfügen", erhältlich im Dropdown-Menü "Bild" unter der Registerkarte "Farbe" Sub.
- Verwenden den Schalter am unteren Rand des Bildes, bewegen Sie sich durch jede Z-Scheibe und bestimmen Sie Kinetochor-Mikrotubuli-Anlage zu. Detaillierte Anlage, die Beschreibungen bisher beschriebenen 16
(3) Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay
- Verwenden die Pipette-Apparat, wie unter Punkt 2.3 beschrieben, Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium unter Öl zu übertragen und inkubieren Sie Eizellen für 7 h ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) wie oben beschrieben im Schritt 2.3 17 .
Hinweis: Verfahren zur Eizelle Sammlung, Mikroinjektion und Reifung umrissen wurden bisher 15. Beziehen sich auf die Anlage Assay Protokoll in Schritte 2.1-2.2 für Steuerelemente und RNA Mikroinjektion Konzentrationen. - Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einer Kultur Zentrum gut Orgel Schale mit 700 µL Kulturmedium mit Monastrol [100 µM] im Zentrum gut und 400 µL H20 in das umgebende Ring und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.
- Monastrol durch die Übertragung von Eizellen, mit Hilfe der Pipette Apparat als oben durch drei Tropfen 100 µL CZB Kulturmedium, ausspülen und übertragen dann die Eizellen für eine neue Mitte-gut Orgel Kulturschale mit 700 µL Kulturmedium + MG132 [5 µM] für 3 h in der Mitte Ring. Den äußeren Ring 400 µL H20 hinzufügen.
- Befestigen Sie die Eizellen durch Übertragung, mit der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
- Nach der Fixierung, die Eizellen zu übertragen, mit Hilfe der Pipette Apparat in einen neuen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL blockierende Lösung und Store bei 4 ° C bis für Immunostaining verarbeitet.
Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern. - Permeabilize und Eizellen über Immunocytochemistry zu kennzeichnen, wie 2,6-2.16 beschrieben.
- Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, Erfassung Bild < 1 µm Schritte in der Z-Ebene und achten Sie auf die gesamte Region der Metaphase Spindel Bild.
- Ermittlung von Chromosom Ausrichtung Status offen über imaging-Software-Image-Dateien.
Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden. - Ziehen Sie Bild in Bild J Bedienfeld.
- In der geöffneten Z-Serie, verwenden Sie das punktwerkzeug (verfügbar durch Klicken auf das Werkzeugsymbol Punkt auf der Bedienleiste Bild J), Punkte am Ende jeder Spindel Stange in ihre jeweiligen Z-Scheibe zu markieren, indem das Tool über die Spindel Pol im Bild und Klick auf das Bild. Fügen Sie diese Punkte auf die Region of Interest (ROI) Manager Command + t auf der Tastatur drücken.
- Bestimmen Sie die spezifischen Koordinaten für jede der Positionen durch Hervorhebung des spezifischen Punktes im ROI-Manager und klicken Sie auf die Schaltfläche Measure in Schritt 3.10 gesetzt. Dies wird ein Ergebnis liefern Tisch-haltigen x- und y-Koordinaten für jeden Punkt. Diese werden die Punkte X1, Y1, und X1, Y2, beziehungsweise.
- Bestimmen Sie als nächstes die wahre Z-Koordinate. Dies geschieht durch Multiplikation der Slice-Nummer des bestimmten Z-Segments im Z-Stapel in der Spindel Pol identifiziert wurde (d. h. Scheibe #2 von 6), die jeder einzelner Punkt ist durch die Dicke Stapel (d. h. 1 µm) (Beispiel: Schneiden Sie 2 x 1 µm = 2). Diese werden jeweils die Z1 und Z2 Punkte.
- Spindellänge unter Verwendung der Satz des Pythagoras-Gleichung zu bestimmen (eine2 + b2 = C2) unter Verwendung der zuvor definierten x-, y- und Z-Koordinaten von Schritten 3.11-3.13. Für jede Spindel ist die endgültige Länge gleich:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Bestimmen Sie die Spindel Midzone. Dies errechnet sich die Hälfte der Länge der Spindel. Mit dem Linienwerkzeug in Bild J, indem Sie auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J zeichnen Sie eine Linie, die von einem Pol der Spindel zu Spindel Midzone ist. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt.
- Bestimmen Sie Chromosom Ausrichtung Status durch die Bewertung Chromosom Abstand von der Spindel Midzone mit dem Linienwerkzeug Messung. Verwenden das Linien-Werkzeug durch Klicken auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J, zeichnen Sie eine Linie von der Spindel Midzone auf dem Chromosom. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt. Chromosomen, die größer als 4 µm aus der Spindel Midzone gelten nicht ausgerichtete 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach in-vitro- haben Transkription hochwertige RNA eine A260/A280 Verhältnis (1,8-2,2) eine A260/A230 Verhältnis ≥1.7, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Das Bild in Abbildung 1 zeigt die Migration von in-Vitro-RNA auf einem denaturierenden Agarosegel nach Elektrophorese hergestellt. Eine Band, die verschmiert ist, Muster oder ein Beispiel, das hat mehrere große Bänder kann Verunreinigung oder Zerstörung der Probe angeben. Alternativ können mehrere Bänder zeigen, dass die mRNA ist nicht völlig denaturiert, oder das Start Plasmid wurde nicht völlig linearisiert. Die mRNA wird größer als prognostiziert aufgrund der Poly-Adenylated-Tail pIVT, wodurch stabile Expression der mRNA in Vitrointegriert ausgeführt. Nach Mikroinjektion empfiehlt es sich, einheitliche Einspritzmengen und Ausdruck per Fluoreszenz-Mikroskopie gewährleisten. Das Bild in Abbildung 2 zeigt Prophase-verhaftet Eizellen gleichmäßig mit Gfpinjiziert. Konsequente Mikroinjektion Technik ist entscheidend für dieses Protokoll. Bildanalyse-Software, wie z. B. Bild J lässt sich Ausdruck Ebenen, um Einheitlichkeit und Beherrschung der Technik gewährleisten zu validieren. Beachten Sie, dass die subzelluläre Lokalisation Informationen abgerufen werden können, während die Bildgebung für beide Assays zu tun. Für alle Mikroinjektion Experimente Beurteilung der Auswirkungen einer Genvariante sollte der Wildtyp Gens in eine Teilmenge der Eizellen als Kontrolle dienen injiziert werden. Dies ermöglicht einem Steuerelement für potenzielle Überexpression Phänotypen des menschlichen Gens in eine Maus Eizelle. PBS oder GLP für Fluorophore beschriftet Konstrukte, sollte auch in einer Untergruppe von Eizellen zu steuern für die Mikroinjektion-induzierte Phänotypen injiziert werden. Für Konstrukte fluoreszierende das Etikett fehlt kann Gfp mRNA Co injiziert, um ausreichende Mikroinjektion zu gewährleisten. Wenn zwei oder mehrere Konstrukte gleichzeitig Co Injektion achten Sie darauf, die mRNA-Konzentration zu erhöhen, so dass die endgültige Lösung 500 ng/µL jedes mRNA enthält.
Der kalten Stall Mikrotubuli-Test bietet ein wertvolles Instrument für die Beurteilung des Zustands der Anlage des Kinetochore, Mikrotubuli. Abbildung 3 ist eine Z-Projektion eines Bildes confocal Mikroskop von einem Metaphase ich Eizelle. Diese Eizelle unterlag kalte Medien Behandlung aller Mikrotubuli depolymerisieren, die kinetochoren nicht beigefügt hatte. Eizellen, die behandelt worden sind, für eine nicht genügend Zeit Mikrotubuli Fasern nicht an Chromosomen (zu kurz ergibt zu viele Fasern) oder fehlende Fasern zusammen gebunden (zu lang bewirkt keine Spindel-Struktur enthält) und es ist empfohlen, dass diese Eizellen nicht in der Analyse verwendet werden. In Metaphase der Meiose I ist es üblich, dass Eizellen ungebunden oder seitlich angehängten Kinetochore enthalten, es wird daher empfohlen, eine Kontrollgruppe in jeder Anlage-Studie verwendet werden. Im Durchschnitt Wildtyp Eizellen enthält 5-10 % des Kinetochore MI wird nicht noch stabil angefügten 19sein. Es ist wichtig, dass alle Eizellen auf der gleichen Stufe für die Analyse der Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Stand werden. Um sicherzustellen, dass experimentelle und Steuern Gruppen mit ähnlichen Zeitskalen Reifen ist es empfohlen Zellzykluskinetik-bewerten. Um diesen Test durchzuführen, sollte eine Teilmenge der Kontroll- und experimentelle Eizellen gereift und Leben unter Zeitraffer Microcopy visualisiert. Die Verwendung von Milrinone ermöglicht Eizellen in Prophase der Meiose I, synchronisiert werden, so dass Medien fehlen Milrinone mit Freisetzung ermöglichen Wiederaufnahme der Meiose in der gleichen Zeit 20. Eizellen aus Kontrolle und experimentellen Gruppen sollte ein Polkörperchen, indikative Metaphase der Meiose II (traf II) zu ähnlichen Zeitpunkten erreichen Extrudieren. Wenn live-Cell-Mikroskopie nicht verfügbar ist, können Eizellen an Met gereift sein ich (7 h) und traf II (16 h), fixiert und gefärbt, DNA und Mikrotubuli zu erkennen, wie oben beschrieben. An Met sollte I und II erfüllt eine tonnenförmig, bipolare Spindel sichtbar sein. In der Steuerung Eizellen sollte Chromosomen in der Metaphase-Platte ausgerichtet werden. Die Ausrichtung der Chromosomen wird in experimentellen Gruppen je nach Variante betrifft unterscheiden, jedoch die Chromosomen verdichtet und an Mikrotubuli mit der Mehrheit der Chromosomen, die zentral an der Spindel befestigt. Eine ähnliche Anzahl von Eizellen sollten Meiose II in Kontrolle und experimentellen Gruppen erreicht haben. Um Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Anlage reduzieren optimiert Status ist es empfehlenswert imaging Eizellen mit kleinen Schritten in der Z-Ebene, für das spezifische Ziel arbeiten. Analyse wird beinhalten, die Z-Scheiben einzeln betrachten und in zusammengeführten Einstellungen, um die Pole zu bestimmen, die Mikrotubuli befestigt von ausgehen. Abbildung 3 b zeigt Beispiele von abnormen Kinetochor-Mikrotubuli anhängen. Dargestellt ist ein Bivalent, in denen nur eine Schwester Kinetochor Paar eine Spindel Mikrotubuli, definiert als keine Anlage zugeordnet ist. Als nächstes ist eine Syntelic-Anlage gezeigt, in welche beiden Schwester Kinetochor-Paare auf dem gleichen Pol der Spindel befestigt sind. Schließlich ist eine Merotelic-Anlage gezeigt, in welche eine Schwester beide Pole Spindel, während die andere Schwester Kinetochor beigemessen wird Kinetochor des Paares wird zu einem einzigen Spindel Pfosten befestigt.
Die Bilder in Abbildung 4 illustrieren die progressive erwarteten DNA und Spindel-Konfigurationen als eine bewegt sich durch die einzelnen Schritte des Chromosoms Ausrichtung Herausforderung Assays. In diesem Test ist es wichtig, dass die verschiedenen Versuchsgruppen Fortschritte durch Meiose mit ähnlichen Kinetik. Wie beschrieben ist es zuvor empfehlen, Zellzyklus Kinetik Analysen vor Durchführung des Herausforderung Tests abzuschließen. In diesem Test bemisst sich die Fähigkeit der Eizellen, abnorme Kinetochor-Mikrotubuli Anlagen erfolgreich zu korrigieren. Um dies zu testen, sind Eizellen zuerst Met reifte ich Kinetochor-Mikrotubuli Anlagen festgelegt werden können. Als nächstes werden Eizellen inkubiert, in Monastrol und Kinesin 5 (EG5)-Hemmer, das bipolare Spindel in eine monopolare Spindel 21bricht zusammen. Die Generation der monopolaren Spindel induziert 100 % falsch Mikrotubuli-Kinetochor Anhänge. Die Monastrol-Inhibitor wird dann gewaschen um Wiederherstellung ermöglichen. Während der Erholungsphase die Eizellen eine bipolare Spindel zu regenerieren und Mikrotubuli-Anlagen zu korrigieren versucht. Hinzufügen des Proteasom-Inhibitors MG132 verhindert Anaphase auftreten. Als Kontrolle, eine kleine Teilmenge der Eizellen aus jeder experimentellen Gruppe fixierbar in jeder Phase des Protokolls (traf ich, Monastrol behandelt, post Erholung) zu allen Gruppen reagieren zu Behandlungen und in gleichem Maße zu gewährleisten. Metaphase ich Eizellen sollte eine Fassförmiger bipolare Spindel mit Chromosomen in der Metaphase Platte ausgerichtet. Eizellen mit Monastrol behandelt sollte eine monopolare Spindel mit Chromosomen an die einpolige orientiert. Wiederhergestellte Eizellen sollte noch einmal eine Fassförmiger bipolare Spindel enthalten. Chromosom Ausrichtung ist definiert als alle Chromosomen mehr als 4 μm aus der Spindel midzone 22. Es ist hilfreich zu beflecken Eizellen um DNA und Kinetochore, um festzustellen, ob beide Kinetochore außerhalb dieser zentralen Zone sind, wie dies festzustellen, verwenden nur DNA-Nachweis kann schwierig sein, zu erkennen.
Abbildung 1: Denaturingagarose-Gel-Elektrophorese von RNS. RNS-Qualität und Größe können durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel beurteilt werden. Denaturierenden Gel wird empfohlen, um Sekundärstruktur Bildung zu verhindern. Bahn 1 enthält einen RNA Molekulargewicht Marker. Bahn 2 ist ein RNS-Probe. Beachten Sie, dass die RNA größer als durch die integrierte PolyA Rute berechnet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Validierung von Oozyten Mikroinjektion. Fluoreszenz-Mikroskopie kann verwendet werden, um erfolgreich Eizelle Mikroinjektion und Ausdruck zu überprüfen. Prophase-verhaftet Eizellen mikroinjiziert mit Gfp werden nach Übernachtung Ausdruck des Konstrukts gezeigt. Dieses Bild wurde mit der Invitrogen EVOS FL Auto imaging-System ausgestattet mit GFP Lichtwürfel erhalten. Maßstabsleiste ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Bewertung der Kinetochor-Mikrotubuli Anhänge. (A) A repräsentative Z-Projektion von einem kalten behandelt traf ich Eizelle. Spindel (grün), kinetochoren (rot) und DNA (blau) werden angezeigt. Das Feld gibt die Region des optischen Zooms. Pfeilspitzen zu Ende-auf Anhänge der Kinetochore Mikrotubuli von einem einzigen Bivalent bezeichnen. Maßstabsleiste ist 10 µm für Spindel, Kinetochor, DNA und Kanäle zusammenfügen. Maßstabsleiste für optische Zoom ist 5 µm. (B) Beispiele für abnorme Kinetochor-Mikrotubuli Anlagetypen in der Maus Eizellen. Pfeile zeigen Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Websites. Maßstabsleiste ist 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay. Flussdiagramm des Verfahrens mit repräsentativen Z-Projektionen der Eizellen bei jedem Schritt. Eizellen sind zunächst zur Metaphase der Meiose gereift ich (traf ich), dann in eine neue Schale mit Monastrol für 2 h induzieren monopolare Spindel Bildung übertragen. Nächsten Eizellen dürfen in Reifung Medium ergänzt mit einem Proteasom-Inhibitor (MG132) zu verhindern Anaphase auftreten für 3 h zu erholen. Einmal wiederhergestellte Eizellen sind fixiert, für Spindel (grün), kinetochoren (rot) und DNA (blau) beschriftet und abgebildet über konfokalen Mikroskopie, Ausrichtung Status zu bestimmen. Linien geben die Länge der Spindel (40 µm) und Spindel Midzone (20 µm) über Pythagoras Gleichung ermittelt. Pfeile zeigen Punkt Werkzeugpositionen an jedem Pol. Jede Kinetochore > 4 µm aus der Spindel Midzone gelten nicht ausgerichtet. Sternchen bedeutet nicht ausgerichtete Chromosom (5,6 µm aus Midzone). Maßstabsleiste ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wegen der raschen und zunehmende Identifizierung des menschlichen genetischen Varianten mit Krankheit verbunden ist es unerlässlich, dass Systeme entstehen, um deren biologische Bedeutung zu bewerten. Funktion des Proteins in menschlichen Meiose stellt besondere Herausforderungen zu verstehen, weil menschliche Eizellen kostbar sind und seltene und menschliche Spermien nicht zugänglich, Genmanipulation sind. Maus Eizellen sind Säugetiere Modellsystem wertvoll für die Bewertung der menschlichen meiotische Gene Funktion 10,23. Dieses Modell umgeht die 3D-lingual der Verwendung von menschlicher Eizellen und bietet gleichzeitig eine leicht verfügbare Quelle der Low-Cost-, manipulierbaren Eizellen, die Meiose ähnlich wie menschliche Keimzellen zu unterziehen, während seiend nützlich für das Verständnis wie genetischer Varianten weiblich auswirken können Fruchtbarkeit.
Da diese Methoden ektopische Expression des menschlichen Proteins in der Maus Eizellen per Mikroinjektion beschäftigen, ist es wichtig, zunächst eine Konzentration von Kontrolle, Wildtyp RNA zu etablieren, die meiotische Reifung nicht ändert. Es wird empfohlen, dass meiotische Reifung Kinetik sind überwacht (Kernhülle Aufschlüsselung, Polkörper Extrusion) in Kontrolle Eizellen, grundlegende Parameter und Beurteilung der Spindel und Chromosom Morphologie zu etablieren. Darüber hinaus ist die Gewährleistung einheitlicher Mikroinjektion Bände für Vergleich von Gruppen von entscheidender Bedeutung. Einschließlich eines fluoreszierenden Tags auf das Gen des Interesses kann diese technische Herausforderung vereinfachen. Techniken für das mastering Eizelle Mikroinjektion wurden bisher nachgewiesene 15. Visualisierung der injizierten Eizellen unter dem Fluoreszenzmikroskop oder Bestimmung der Proteinexpression über western-Blot sind auch wertvolle Werkzeuge für die Bestätigung der konsequenten Injektion Konzentrationen.
Da Fehler im Chromosom Abtrennung im Säugetier-Eizellen sind eine der Hauptursachen für embryonale Aneuploidie und Schwangerschaft Verlust5, Analyse der Kinetochor-Mikrotubuli-Anlagen bieten ein wertvolles Instrument für die Beurteilung, ob ein Gen des Interesses betrifft Chromosom Abtrennung (d. h. unzulässige Anlagen bewirkt MIS Segregation). Eine 10 min. Belichtung, gekühlte Medien reicht, Mikrotubuli depolymerisieren, die keine Kinetochor-Mikrotubuli-Anlage ermöglicht die Visualisierung von stabilen Anhänge über konfokalen Mikroskopie 24gemacht haben. Für diesen Test ist es wichtig, nicht die Eizellen über chill, denn dies führt zu die Depolymerisation von stabilen Mikrotubuli. Darüber hinaus ist die Optimierung der Färbung Verfahren Schlüssel zur Visualisierung der Kinetochor und Mikrotubuli Strukturen. Um ausreichende Bildauflösung für Analyse, kleine Schritte zu gewährleisten (≤ 1 μm) in der Z-Ebene mit einer 40 x-63 X Ziel erfasst werden sollten, und erhalten Bilder durch die gesamte Spindel-Struktur, alle Anlagen zu gewährleisten sind sichtbar. Beachten Sie, dass sie gemeinsam haben ist ungebunden Kinetochore während der Meiose prometaphase ich 25.
Der Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay eignet sich für die Bewertung der Gewinn oder Verlust der Funktion Varianten. Gain-of-Function-Varianten können schwierig sein zu beurteilen, da Maus Eizellen von jungen Frauen niedrige Aneuploidie haben. Dieser Assay überwindet diese Hürde durch die Generierung von einer Situation, in der die Eizelle experimentell induzierter falsche Kinetochor-Mikrotubuli Anhänge korrigieren muss. Zur Gründung eines Zeitpunkt in der Steuerung Eizellen 1-2 falsch ausgerichtete Chromosomen enthalten, nach der Wiederherstellung bietet eine quantifizierbare Szenario zur Feststellung, ob eine Mutante bietet erhöhte Ausrichtung Effizienz (d.h. bessere Ausrichtung Fähigkeiten schützen Sie euploidy). Für die Quantifizierung von Chromosom Fehlstellungen, eines vorher festgelegten Protokolls in die Chromosomen, die größer als 4 µm von der Spindel Midzone zeichnen sich als unaligned können gebrauchte 18sein.
Um Verlustfunktion-Varianten zu untersuchen, sind zusätzliche Versuchsbedingungen nötig wegen der endogenen Homolog innerhalb des Studiensystems. Ein Weg, um dieses Problem zu lindern ist zu verwenden oder eine Knockout-Maus-Modell der Variante des Interesses zu generieren. Das Aufkommen des Systems Gemüsefach/Cas9 könnten eine schnelle Möglichkeit, solche Knockouts 26zu generieren. Wenn ein Ko-Modell nicht möglich ist, könnte Alternativ klassische Knockdown Techniken wie Co injizierende Morpholino antisense Oligonukleotide oder kleinen interferierenden RNAs eingesetzt. Aufmerksamkeit auf das Sequenz-Design ist jedoch erforderlich, um mögliche Störungen bei der microinjected Variante unter Studie zu vermeiden. Beispielsweise könnte Morpholino Oligonukleotid soll an 5' untranslatierten Bereich (5' UTR) Binden des Maus-Gens, die nicht in der menschlichen mRNA-Variante eingeführt durch Mikroinjektion enthalten ist. Wenn kleine Eingriffe verwenden könnte RNAs ein Ziel eine nicht-homologe Sequenz Region oder einführen Stille Punktmutationen im menschlichen Gen, das sich gezielt entziehen würde. Jedoch kann die körpereigene Protein Kopie beim Ausdruck der Variante noch anwesend informativ sein, wie viele Varianten im heterozygoten Zustand im menschlichen Genom gefunden werden.
Zu guter Letzt kann zwar nicht in diesem Protokoll beschrieben, Chromosom Aneuploidie Bewertung leicht erfüllt II Eier als der letzte Test in der Pipeline für menschliche Variante Analyse beurteilt werden. Eine detaillierte Beschreibung des in Situ Chromosom verbreitete Protokoll hat bisher 15beschrieben. Kurz, sind Eizellen mikroinjiziert gereift in-vitro- bis sie die traf II Stufe, nach der Behandlung mit einem meiotische Spindel-depolymerizing Agenten vor der Fixierung zu erreichen. Kinetochor und Chromosom Färbung, wie hier beschrieben ermöglichen Chromosom inhaltlichen Bewertung.
Während Maus Eizellen einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung von Proteinen entscheidend für weibliche Meiose einige Einschränkungen für das Modell gibt es zur Verfügung stellen. Überexpression von Proteinen meiotische Reifung durcheinanderbringen kann und daher eine RNA-Konzentration nicht vorhanden, die keinen Phänotyp führen wird. Darüber hinaus kann die endogenen Maus Homolog Lokalisierung von exogenen menschlichen Proteins stören. Generation von Knockout-Maus-Modellen bietet eine Lösung für dieses Problem; jedoch kann dies nicht in allen Situationen möglich sein. Ein alternativer Ansatz wäre, das Maus-Protein zum Abbau durch die Injektion von Co RNAi oder Morpholino Oligonucleotides entwickelt, um nicht Ziel der exogenen RNA und Protein. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass zwar viele Proteine Homolog zwischen menschlichen und Maus, Unterschiede bestehen können, führt zu Unterschieden in Lokalisierung und Funktion, die diese Art von Cross-Arten Analyse ausschließen könnte. Genetische Manipulation Tools wie Cas9-Genom Bearbeitung27 billiger und häufiger-Platz werden, könnte dieses Protokolls Knock-in, humanisierter Mauslinien Standardvorrang Mikroinjektion zu entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium von der American Society for Reproductive Medicine und von der Karl und Johanna Busch Memorial Fund an der Rutgers, The State University von NJ, k.s. A.L.N. wurde durch einen Zuschuss aus dem N.I.H. (F31 HD0989597) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
