Summary
Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.
Abstract
Embryonale aneuploïdie is de voornaamste genetische oorzaak van onvruchtbaarheid bij de mens. De meeste van deze evenementen zijn afkomstig tijdens vrouwelijke meiose, en zij positief gecorreleerd met de maternale leeftijd, leeftijd alleen is niet altijd voorspellende van het risico van het genereren van een aneuploid embryo. Varianten van de gen kunnen daarom goed voor onjuiste chromosoom segregatie tijdens de oögenese. Gezien het feit dat toegang tot menselijke eicellen is beperkt voor onderzoeksdoeleinden, een serie van tests werden ontwikkeld om de studie van menselijke genfunctie tijdens meiose ik met behulp van de muis eicellen. Ten eerste zijn boodschapper-RNA (mRNA) van het gen en gen variant van belang microinjected in de profase ik-gearresteerd muis eicellen. Na die tijd voor expressie, eicellen synchroon vrijkomen Meiotische rijping te voltooien meiose ik. Door tagging de mRNA met een opeenvolging van een fluorescerende verslaggever, zoals groen fluorescente proteïne (Gfp), kan de lokalisatie van het menselijke eiwit naast de fenotypische wijzigingen worden beoordeeld. Bijvoorbeeld, winst of verlies van functie kan worden onderzocht door middel van experimentele omstandigheden die uitdaging van het gen product Meiotische fouten te herstellen. Hoewel dit systeem gunstig is in het onderzoek naar menselijke eiwitfunctie tijdens de oögenese, moet voldoende interpretatie van de resultaten worden verricht, gezien het feit dat eiwit expressie niet op endogene niveaus is en, tenzij gecontroleerd voor (dat wil zeggen klopte uit of naar beneden) zijn lymfkliertest homologen ook aanwezig in het systeem.
Introduction
Onvruchtbaarheid is een aandoening die 10-15% van de menselijke bevolking van reproductieve leeftijd 1, waaruit bijna de helft medische behandeling 2 zoekenbeïnvloedt. Hoewel de etiologie van onvruchtbaarheid divers is en in veel gevallen multifactoriële, de meest voorkomende genetische afwijking bij de mens embryonale aneuploïdie 3 is. Aneuploïdie wordt gedefinieerd als de afwijking (winst of verlies) van het juiste aantal chromosomen in een cel. Het fenomeen van aneuploïdie in menselijke embryo's is gemeenschappelijk en verhoogt met geavanceerde maternale leeftijd 4,5. Vier gerandomiseerde gecontroleerde onderzoeken gebleken dat het voordeel van de selectie van embryo's voor alleen inplanten normale-(euploïde) voor de overdracht van de baarmoeder, omdat deze strategie resulteerde in toegenomen implantatie tarieven, lagere tarieven van de miskraam en een kortere tijd voor bereiken van zwangerschap 6,,7,,8,9. Begrip van de etiologie van menselijke aneuploïdie kan dus grote gevolgen hebben in geassisteerde reproductie.
Hoewel de pre-implantatie genetische tests voor aneuploidies is gunstig in behandelingen van onvruchtbaarheid, een grondige kennis van hoe aneuploidies afkomstig zijn ontbreekt nog. Het is algemeen aanvaard dat er een positieve correlatie van Meiotische aneuploidies (ontstaan tijdens gameet productie) en maternale leeftijd, echter sommige vrouwen aanwezig embryonale aneuploïdie tarieven die van het gemiddelde tarief voor hun bepaalde leeftijd 4 afwijkenis. Deze gevallen suggereren dat leeftijd alleen niet altijd voorspellende van het risico van het genereren van een aneuploid embryo. Andere factoren kunnen een rol spelen bij waardoor het risico van embryonale aneuploïdie, zoals gene varianten.
Een belangrijk aspect van het onderzoek naar de potentiële bijdrage van een gen variant aneuploïdie tijdens oöcyt meiose is het ontwerpen van een systeem voor het snel evalueren Meiotische genfunctie. Als gevolg van de ethische beperkingen en een beperkte toegang is het onpraktisch voor het uitvoeren van deze experimenten met behulp van menselijke eicellen. Deze kwesties kunnen worden omzeild door het gebruik van de muis eicellen, en hier een serie van tests te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I zijn beschreven. Door microinjecting de boodschapper-RNA (mRNA) codering voor de gen variant van belang, kan de lokalisatie van de menselijke eiwitten in het ei van de muis worden gevisualiseerd en gebruikt om te bepalen als de ectopische expressie van het wild-type en gemuteerde menselijke eiwit in een resulteert fenotypische veranderingen die tot aneuploïdie leiden kunnen. Deze fenotypen omvatten een verhoging in microtubuli die aan het ongepast om zuster hechten kinetochoor en het onvermogen om ondersteuning van chromosoom uitlijning op de metafase van meiose I. belangrijker, dit protocol kan worden gebruikt voor het onderzoeken van zowel winst en verlies van functie genetische varianten door de oprichting van specifieke experimentele omstandigheden aan te vechten van belangrijke gebeurtenissen in oöcyt meiose zoals spindel gebouw en chromosoom uitlijning 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. moleculaire klonen
- Verkrijgen van full-length codering sequentie van het gen van belang en de plasmide in vitro transcriptie (pIVT)11vector.
Opmerking: Full-length cDNA klonen zijn commercieel verkrijgbaar bij verschillende leveranciers of via omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR) kunnen worden gegenereerd. Het nationaal centrum voor biotechnologische informatie (NCBI) onlinebron biedt transcript sequenties van genen van de Nucleotide en Expressed sequence gecodeerde (EST) databases. Voor het gemak van eiwit kunnen visualisatie en analyse van expressie niveaus, fusie aan de groen fluorescente proteïne (Gfp) of een andere geschikte fluorescerende tag worden gewenst in de strategie van klonen. - Voeg met behulp van een gevalideerde klonen strategie de codering sequentie van het gen van belang in de regio meerdere klonen van pIVT. Een gedetailleerde beschrijving van het moleculaire klonen en de vereiste stappen zijn eerder beschreven 12.
Opmerking: Wanneer een gen-fusion product moeten worden gegenereerd, worden ervoor dat het klonen in het juiste leesraam. - Het volgnummer van de constructie die met behulp van globine inleidingen om juiste gene inbrengen, juiste in-frame fusion, en dat geen punt polymerase-geïnduceerde mutaties zijn gemaakt.
Opmerking: Als Sanger DNA sequencing apparatuur niet beschikbaar is, veel bedrijven bieden goedkope DNA sequencing opties. - Mutagenize DNA als het genereren van één nucleotidepolymorfisme (SNPs) of ingevoegde/verwijderde (MICRODELETIES). DNA mutagenese wordt in stappen 1.5-1.7 hieronder beschreven. Voor wild-type constructies, gaat u verder met de linearisatie stap 1.7.
- Mutagenese inleidingen ontwerpen en voltooi de mutagenese PCR reactie voor het genereren van mutant construct per fabrikant protocol. PCR-gemedieerde plaats-geleide mutagenese geweest eerder beschreven 13. Veel bedrijven bieden bovendien plaats-geleide mutagenese kits, waaronder protocollen.
- Transformatie mutagenized DNA in bacteriële gastheer. Isoleren en zuiveren van de plasmide.
Opmerking: Veel bedrijven maken kits die kunnen worden gebruikt om gemakkelijk te isoleren en zuiveren van de plasmide DNA. Volg fabrikanten protocol dienovereenkomstig. Als met behulp van een gram-negatieve bacteriële stam zoals E. coli, is het aanbevolen gebruik van een kit die endotoxines verwijdert. - Het volgnummer van de geïsoleerde DNA van bacteriële transformants met behulp van standaard Sanger DNA rangschikkend om te bevestigen van de invoering van de gewenste SNP of INDEL.
- Linearize eindproducten met behulp van één restrictie-enzym vertering van het gezuiverde DNA.
Opmerking: De pIVT-vector bevat meerdere single-enzym gesneden sites vermeld in de plasmide-kaart op Addgene 14. - Zorg ervoor dat het product lineaire via agarose gelelektroforese. De methodologie voor de Elektroforese van het gel van de agarose geweest eerder gedefinieerde 14.
Opmerking: Voor alle overige stappen, gebruik barrière (filter) Pipetteer tips en RNase-vrije materialen om de productie van stabiele, hoge kwaliteit RNA. - Zuiveren het verteerd product met behulp van een gevalideerde DNA opschonen protocol of kit, en elueer in 30 µL RNase/DNase-gratis water.
Opmerking: Silica-matrix spin kolom-gebaseerde kits worden aanbevolen voor hoge kwaliteit, gezuiverd DNA. Volg fabrikanten protocol dienovereenkomstig. - Transcribe in vitro DNA met behulp van T7 polymerase volgens protocol van de fabrikant.
- Zuiveren en elueer RNA in 30 µL van RNase/DNase gratis water met behulp van een silica-matrix spin nucleïnezuur kolom gebaseerde zuivering kit volgens protocol van de fabrikant.
- Denatureren agarose gelelektroforese met behulp van formaldehyde te bevestigen van de uiteindelijke grootte van de RNA-product uitvoeren. Zie onderstaande 14stappen 1.13-1.22. (Figuur 1).
- Voorbereiding gel door verwarming van 1 g agarose in 72 mL water tot het is opgelost en vervolgens afkoelen tot 60 ° C.
- Bereiden 10 X WIPES buffer uitgevoerd door toevoeging van 0,4 M MOPS (pH 7.0), 0,1 M natriumacetaat en 0,01 M EDTA.
- Voeg 10 mL van de 10 X WIPES met buffer en 18 mL van 37% formaldehyde (12,3 M) aan de afgekoelde agarose oplossing.
- Kaste de gel door de oplossing van het agarose gel-vormende verpakkingsgasssen gieten. Gebruik een kam groot genoeg is voor 10 µL. Nadat gel heeft ingesteld en is stevig aan, zachtjes de kam te verwijderen.
- Monteren van de gel in de elektroforese tank en voeg voldoende 1 X WIPES uitvoeren buffer, zorgen voor dat de gel is volledig bedekt.
- Bereiden RNA monster door toevoeging van 1 microgram van RNA aan 0,5 X hoeveelheid formaldehyde-bevattende laden kleurstof.
- Ethidiumbromide toevoegen aan RNA oplossing bij een concentratie van 10 µg/mL.
- Het denatureren van RNA monsteroplossing bij 70 ° C gedurende 5 minuten.
- Met behulp van steriele, 10 µL filter tips, 5 µL van moleculair gewicht markering laden en 5 µL van RNA elk exemplaar in aparte putjes van de gel en electrophorese 5 V/cm totdat de kleurstof is gemigreerd ten minste tweederde van de lengte van de gel.
- Visualiseer de RNA in de gel op een UV trans illuminator. Zorg ervoor dat de RNA is het juiste formaat door te vergelijken naar de markering van het molecuulgewicht.
- Breng voor het meten van de concentratie en zuiverheid van het RNA, 1.2 µL van gezuiverde RNA met behulp van steriele 10 µL filter tips op een UV-spectrofotometer.
Opmerking dat hoge kwaliteit RNA absorptie ratio's van A260/280 (1.8-2.2) en 260/230 moeten (> 1.7) respectievelijk. - Met behulp van 10 µL filter tips, aliquoot de resterende gezuiverde RNA in steriele 0.5 µL centrifuge buizen (3-5 µL/buis). Bewaren buizen bij-80 ° C tot klaar voor microinjection.
Opmerking: De concentratie van een laatste injectie van 500 ng/µL is een optimale startpunt. Het is aanbevolen om RNA verdunnen 1:2 in RNase gratis H20 vóór microinjection om kleverigheid van RNA in microinjection pipet.
2. kinetochoor-microtubulus bijlage Assay
- Eicellen in gelijke groepen voor microinjection verdelen.
Opmerking: Oöcyt verzameling, overdracht en microinjection Meiotische rijping heeft zijn uitvoerig beschreven in JoVE eerder 15. - Microinject van één groep met experimentele mRNA en de andere groep(en) met de WT-controle en PBS of Gfp mRNA.
Opmerking: 500 ng/µL is de concentratie van de aanbevolen injectie om te beginnen met 10. Een picoinjector kan worden gebruikt om controle injectie bedragen. Een geïnjecteerde volume voor 5-10 pL wordt aanbevolen 15. - Met behulp van een hand of de mond bediende pipetting apparatus waar het glas Pipetteer opening iets is bedekt groter dan de diameter van een oöcyt (100-150 µm), overdracht eicellen in een daling van de 100 µL van milrinone-vrije voedingsbodem in een petrischaal met embryo kwaliteit minerale olie en incubeer eicellen gedurende 7 uur bij 37 ° C in 5% C02 om voldoende rijping te metafase van meiose ik (ontmoette ik) 15.
- Na incubatie, met behulp van de dezelfde Pipetteer apparatuur zoals hierboven, overdracht van eicellen in een centrum-well orgel cultuur schotel met 700 µL van vooraf gekoeld minimale essentiële media (MEM) collectie medium in het midden goed en 500 µL H20 in de buiten ring en Zet de schotel op het ijs gedurende 7 minuten.
Opmerking: Het is aanbevolen om vooraf chill MEM media en centreren goed orgel cultuur gerechten bij-20 ° C gedurende ten minste 20 minuten vóór de behandeling van eicellen. - De eicellen bevestigen door ze met behulp van het pipet-apparaat in een putje van een duidelijke plek glasplaat met 400 µL van 2% paraformaldehyde in 1 X PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Met behulp van hetzelfde apparaat Pipetteer, breng de eicellen in een ander goed op een plek plaat met 400 µL blokkerende oplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) en winkel bij 4 ° C tot klaar om te verwerken voor immunokleuring.
Opmerking: voor het opslaan van eicellen bij 4 ° C, cover plek glasplaat met parafilm ter voorkoming van verdamping. - Met behulp van dezelfde Pipetteer apparatuur, overdracht eicellen bij een nieuwe bron op een plek met 400 µL permeabilization oplossing (PBS + 0,3% BSA 0.1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten overdracht eicellen snel via drie 400 µL druppels blokkeren oplossing als u wilt verwijderen van alle resterende wasmiddel.
Opmerking: Een 9-well helderglazen plek plaat werkt goed voor het verplaatsen van groepen door middel van meerdere behandelingen op een één schotel (stappen 2.4-2.5). - De resterende immunocytochemie-procedures uitvoeren in een bevochtigde kamer, beschermd tegen licht bij kamertemperatuur. Gebruik een plastic container voor kleine en middelgrote bekleed met vochtige papieren handdoeken en bedek met de aluminiumfolie.
- Met behulp van het pipet-apparaat, overbrengen 30 µL eicellen blokkeren oplossing op het deksel van een 96-wells-plaat en plaats binnen de bevochtigde kamer gedurende 10 minuten.
Opmerking: Drops worden geplaatst in de circulaire inspringingen op de plaat. - Label centromeren en spindel, met behulp van het pipet-apparaat, eicellen overbrengen 30 µL blokkeren oplossing met anti-centromeric antigeen (ACA, Crest) (1:30) en anti-geacetyleerd tubuline (1:1000) en incubeer gedurende ten minste 1 uur.
- Spoel eicellen door de overdracht van door drie 30 µL druppels van de oplossing voor elke 10 min te blokkeren.
- Met behulp van het pipet-apparaat, overdracht eicellen een 30 µL neerzetten blokkeren oplossing met secundaire antilichamen gratis naar de antilichamen die gebruikt hierboven (Anti-menselijke IgG 1:200, anti-muis IgG 1:200) en incubeer gedurende 1 uur.
- De stappen 3, 10-min spoeldouche in 30 µL blokkeren oplossing zoals beschreven in stap 2.11.
- Overdracht van de eicellen, met behulp van het pipet-apparaat, in 3-5 µL montage middellange met DAPI (5.9 µg/µL) op een microscoopglaasje van glas.
- Plaats 4 kleine druppels (grootte van het hoofd van een pin) van vaseline op de hoeken van de cover slip om te voorkomen dat pletten van de eicellen.
- Voorzichtig plaats de cover slip vaseline zijde naar beneden in de dia verschijnt.
- Zegel dekglaasje aan randen met nagellak duidelijk en laten drogen voor 5 min.
- Dia's bij 4 ° C, beschermd tegen licht, tot verwerking via confocale microscopie opslaan.
Opmerking: Zorg ervoor dat de brekingsindex van montage medium, en dekglaasje aan, wedstrijden de doelstellingen van de Microscoop wordt gebruikt. Aanbevolen montage materialen eerder geweest beschreven 15. - Afbeelding van eicellen met behulp van een 40-63 x doelstelling op een confocal microscoop, vastleggen van kleine stapjes (≤ 1 µm) in het z-vlak, geoptimaliseerd voor het doel van de werken, en beeld de hele regio van de metafase-spindel.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle 3 kanalen op basis van specifieke secundaire antilichamen gebruikt in stap 2.11 van het beeld. Afbeelding gemiddeld ≥ 4 en een zoom van 3 zijn ideaal voor voldoende resolutie. Een 1 µm stap-grootte biedt duidelijke visualisatie van microtubuli en kinetochoren in eicellen van de muis. De procedure voor het vastleggen van de afbeelding zal variëren van Microscoop te Microscoop. Raadpleeg de fabrikanten confocal user guide voor specifieke stapsgewijze instructies voor het configureren van instellingen voor Microscoop. - Identificeren kinetochoor-microtubulus bijlage status met behulp van beeldbewerkingssoftware na stappen 2.21-2.23 hieronder.
Opmerking: De volgende stappen beschrijven deze procedure met behulp van Image J (NIH) gratis downloadbare software, alternatieve denkbaar software kan echter worden gebruikt. Bijlage status eerder zijn reeds gedefinieerd 16 . - Afbeelding openen door bestand naar afbeelding J werkbalk te slepen.
- Maak in de geopende z-serie, alle kanalen zichtbaar (DNA, kinetochoor en spindel) door te klikken op "Kanalen verenigen", beschikbaar in het "Image" drop-down menu, onder het tabblad "kleur" sub.
- Met behulp van de knevel aan de onderkant van de afbeelding, doorlopen elke z-segment en bepalen kinetochoor microtubulus bijlage. Gedetailleerde bijlage beschrijvingen eerder geweest beschreven 16
3. chromosoom uitlijning uitdaging Assay
- Met het pipet apparaat zoals beschreven in stap 2.3, overdracht van eicellen in een druppel 100 µL cultuurmedium milrinone-gratis onder olie en incubeer eicellen gedurende 7 uur om voldoende rijping te metafase van meiose ik (ontmoette ik) zoals eerder beschreven in stap 2.3 17 .
Opmerking: Oöcyt collectie, microinjection en rijping procedures werden geschetst eerder 15. Verwijzen naar de bijlage assay protocol in stap 2.1-2.2 voor besturingselementen en voor RNA microinjection concentraties. - Met behulp van dezelfde Pipetteer apparatuur, overdracht eicellen tot een cultuur centrum-well orgel schotel met 700 µL cultuurmedium met monastrol [100 µM] in het centrum goed en 400 µL H20 in de omliggende ring en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Monastrol door de overdracht van oöcyten, met behulp van het apparaat van de pipet als boven, middels drie druppels 100 µL CZB kweekmedium, spoelen en breng de eicellen op een nieuwe center-well orgel cultuur dish met 700 µL cultuurmedium + MG132 [5 µM] gedurende 3 uur in het centrum ring. Voeg toe 400 µL H20 aan de buiten ring.
- Oplossen van de eicellen door het overbrengen van hen, met behulp van het pipet-apparaat, in een putje van een duidelijke plek glasplaat met 400 µL 2% paraformaldehyde in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Na fixatie, overdracht van de eicellen, met behulp van het pipet-apparaat, in een nieuwe putje van een duidelijke plek glasplaat met 400 µL blokkerende oplossing en winkel bij 4 ° C tot verwerkt voor immunokleuring.
Opmerking: voor het opslaan van eicellen bij 4 ° C, cover plek glasplaat met parafilm ter voorkoming van verdamping. - Permeabilize en label van oöcyten via immunocytochemie, zoals beschreven in stappen 2.6-2.16.
- Eicellen met behulp van een 40-63 x doelstelling op een confocal microscoop, vastleggen van het beeld < 1 µm stappen in het z-vlak ervoor om het imago van de hele regio van de metafase-spindel.
- Ter identificatie van chromosoom uitlijning open status afbeeldingsbestanden met behulp van beeldbewerkingssoftware.
Opmerking: De volgende stappen beschrijven deze procedure met behulp van Image J (NIH) gratis downloadbare software, alternatieve denkbaar software kan echter worden gebruikt. - Sleep de afbeelding naar afbeelding J het Configuratiescherm.
- Gebruik het gereedschap Ankerpunt (beschikbaar door te klikken op het pictogram voor het punt op de balk met besturingselementen afbeelding J) in de geopende z-serie, naar aanleiding van punten aan het einde van elke spindel paal in hun respectieve z-segment door te klikken op de afbeelding en plaatsen van het gereedschap over de paal van de spindel in de afbeelding. Deze punten aan de regio van belang (ROI) manager toevoegen door op Command + t op het toetsenbord te drukken.
- De specifieke coördinaten bepalen voor elk van de standpunten die in stap 3.10 highlighting van het specifieke punt in de ROI-manager en te klikken op de knop van de maatregel. Dit zorgt voor een resultaten tabel-bevattende x- en y-coördinaten voor elk punt. Deze zullen respectievelijk de punten X1, Y1, en X1, Y2.
- Vervolgens bepalen de ware Z-coördinaat. Dit wordt gedaan door het aantal segment van het specifieke z-segment in de z-stack waarin de spindel paal werd geïdentificeerd vermenigvuldigen (d.w.z. segment #2 van 6) die elk afzonderlijk punt wordt door de dikte van de stapel (d.w.z. 1 µm) (voorbeeld: Snijd 2 x 1 µm = 2). Deze zullen de Z1 en Z2 punten respectievelijk.
- Bepalen van de lengte van de spindel met behulp van de vergelijking van de stelling van Pythagoras (een2 + b2 = c2) met behulp van de eerder gedefinieerde x-, y- en z-coördinaten van 3.11-3.13 stappen. Voor elke spindel is de uiteindelijke lengte gelijk is aan:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Het bepalen van de spindel-midzone. Dit wordt berekend als de helft van de lengte van de spindel. Met behulp van het hulpmiddel lijn in beeld J, door te klikken op het pictogram van de lijn in de werkbalk Afbeelding J teken een lijn die vanaf een spindel paal tot de spindel-midzone. De lengte wordt weergegeven op de werkbalk Afbeelding J.
- Chromosoom uitlijning status bepalen door chromosoom afstand van de midzone van de spindel met behulp van het hulpmiddel van de meting lijn te bepalen. Met behulp van het hulpmiddel lijn beschikbaar door te klikken op het pictogram van de lijn in de werkbalk Afbeelding J, trek een lijn van de spindel-midzone aan het chromosoom. De lengte wordt weergegeven op de werkbalk Afbeelding J. Chromosomen groter is dan 4 µm van de spindel-midzone worden beschouwd als unaligned 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na in vitro hebben transcriptie hoogwaardige RNA een verhouding van A260/A280 voor (1.8-2.2) en een A260/A230 verhouding ≥1.7 als gemeten met een spectrofotometer. De afbeelding in Figuur 1 ziet u de migratie van in vitro-RNA geproduceerd op een denatureren agarose gel na elektroforese. Een band die is ingesmeerd in patroon of een monster met meerdere formaat banden kunt aangeven verontreiniging of aantasting van het monster. Als alternatief, meerdere banden kunnen aangeven dat het mRNA is niet volledig gedenatureerd, of het begin plasmide was niet volledig gelineariseerde. De mRNA zal lopen groter dan voorspeld door de staart van de poly-adenylated pIVT, waarmee stabiele uitdrukking van mRNA in vitroingebouwd. Als microinjection wordt het aangeraden om uniforme injectie volumes en expressie niveaus via fluorescent microscopie. De afbeelding in Figuur 2 ziet u profase ik-gearresteerd eicellen uniform ingespoten met Gfp. Consistente microinjection techniek is cruciaal voor dit protocol. Afbeelding analysesoftware, zoals afbeelding J, kan worden gebruikt voor het valideren van expressie niveaus om te zorgen voor uniformiteit en beheersing van de techniek. Merk op dat subcellular localisatie-informatie kan worden verkregen, terwijl het doen van de beeldvorming voor beide testen. Voor alle microinjection experimenten beoordelen van de effecten van een gen variant, moet het wild-type gen worden geïnjecteerd in een subset van oöcyten om te dienen als een besturingselement. Hierdoor kan men controle voor potentiële overexpressie fenotypes van het menselijk gen in een muis oöcyt. PBS, of Gfp voor fluorophore-geëtiketteerden constructies, moet ook worden geïnjecteerd in een deelgroep van oöcyten te controleren voor microinjection-geïnduceerde fenotypen. Gfp mRNA kan zijn voor constructies zonder een TL-tag, mede ingespoten om voldoende microinjection. Als mede het injecteren van twee of meer constructies tegelijk moet verhogen de concentratie van mRNA, zodanig dat de definitieve oplossing 500 ng/µL van elke mRNA bevat.
De koude-stable microtubulus-assay biedt een waardevol instrument voor de beoordeling van de status van de bijlage van kinetochoren tot microtubuli. Figuur 3 is een z-projectie van een beeld van de confocal microscoop van een metafase ik oöcyt. Deze oöcyt werd onderworpen aan de behandeling van koude media depolymerize alle microtubuli die niet was gekoppeld aan kinetochoren. Eicellen die zijn behandeld voor een onvoldoende tijd microtubulus vezels niet is gekoppeld aan de chromosomen (te kort resultaten in teveel vezels) of gebrek aan vezels allemaal samen (te lang resultaten in geen spindel structuur bevatten zal) en het is aan te raden deze eicellen niet in de analyse worden gebruikt. In de metafase van meiose ik is het gebruikelijk om eicellen te bevatten van de niet-vastgemaakte of lateraal bijgevoegde kinetochoren, daarom wordt aanbevolen dat een controlegroep worden gebruikt in de studie van alle gehechtheid. Gemiddeld, wild-type eicellen bevat 5-10% van kinetochoren bij MI zal niet nog zijn stabiel bijgevoegde 19. Het is essentieel dat alle eicellen op hetzelfde podium voor analyse van de status van de bijlage van de kinetochoor-microtubulus worden. Om te garanderen dat experimentele en controlegroepen volwassen met soortgelijke tijdschema's het wordt aanbevolen om te beoordelen van de kinetiek van de celcyclus. Voor het uitvoeren van deze test, moet een subset van de controle- en experimentele eicellen worden gerijpt en gevisualiseerd live onder time-lapse microcopy. Het gebruik van milrinone maakt eicellen worden gesynchroniseerd in de profase van meiose I, zodanig dat introductie in media ontbreekt milrinone met hervatting van de meiose toestaan op de dezelfde tijd 20. Eicellen van zowel de controle en de experimentele groepen moeten een polar body, indicatief zijn voor het bereiken van de metafase van meiose II (ontmoette II), op dezelfde tijdstippen extruderen. Als live-cel microscopie niet beschikbaar is, eicellen kunnen worden gerijpt tot BMO ik (7 h) en ontmoette II (16 h), vaste en gekleurd voor het opsporen van DNA en microtubuli, zoals eerder is beschreven. Aan Metropolitan I en II ontmoette een vat-vormige, bipolaire spindel zichtbaar moet zijn. In control eicellen, moeten chromosomen worden uitgelijnd op de metafase-plaat. De uitlijning van chromosomen zal verschillen in experimentele groepen afhankelijk van de variant beïnvloedt, echter chromosomen moeten worden verdicht en aangesloten op de microtubuli met de meerderheid van de chromosomen, centraal gelegen op de spindel. Een vergelijkbaar aantal eicellen moet meiose II in controle en experimentele groepen hebben bereikt. Om problemen bij het bepalen van de bijlage status die wordt aangeraden imaging eicellen met behulp van kleine stapjes in het z-vlak, geoptimaliseerd voor het specifieke doel van de werken. Analyse omvat de z-segmenten afzonderlijk bekijken en in samengevoegde instellingen om te bepalen welke pool die gekoppeld microtubuli afkomstig van bij voorbeeld. Figuur 3B illustreert voorbeelden van abnormale kinetochoor-microtubulus bijlagen. Weergegeven is een tweewaardig in welke slechts één zus kinetochoor paar is aangesloten op een spindel microtubulus, gedefinieerd als een geen bijlage. Vervolgens wordt een syntelic bijlage weergegeven welke beide zuster kinetochoor paren zijn bevestigd aan de dezelfde spindel paal. Tot slot een merotelic bijlage blijkt in welke een zus kinetochoor gekoppeld aan beide Polen van de spindel terwijl de andere zus kinetochoor van het paar is gekoppeld aan een enkele spindel-pool.
De afbeeldingen in Figuur 4 illustreren de progressieve verwachte DNA en spindel configuraties als één beweegt door de stappen van het chromosoom uitlijning uitdaging assay. In deze test is het essentieel dat verschillende experimentele groepen meiose met soortgelijke kinetiek doorlopen. Zoals beschreven is het eerder aanbevelen aan het voltooien van de celcyclus kinetiek analyses vóór het uitvoeren van de bepaling van de uitdaging. In deze test, wordt de mogelijkheid voor eicellen te corrigeren met succes abnormale kinetochoor-microtubulus bijlagen beoordeeld. Om dit te testen, eicellen worden eerst verviel tot BMO ik kinetochoor-microtubulus bijlagen kunnen worden vastgesteld. Eicellen worden vervolgens geïncubeerd in monastrol, en Kinesin 5 (EG5) remmer, dat de bipolaire spindel stort in een monopolaire spindel 21. De generatie van een monopolaire spindel induceert 100% onjuiste microtubulus-kinetochoor bijlagen. De monastrol-remmer wordt dan gewassen uit dat herstel. Tijdens de herstelperiode de eicellen regenereren een bipolaire spindel en proberen te corrigeren microtubulus bijlagen. Toevoeging van het proteasoom-remmers MG132 voorkomt anafase begin. Als een besturingselement, een kleine ondergroep van eicellen uit elke experimentele groep kan worden vastgesteld in elk stadium van het protocol (ontmoette ik, monastrol behandeld, post herstel) om ervoor te zorgen dat alle groepen zijn reageren op behandelingen, en in dezelfde mate. Metafase ik eicellen moeten bevatten een vat-vormige bipolaire spindel met chromosomen uitgelijnd op de metafase-plaat. Eicellen behandeld met monastrol moeten een monopolaire spindel met gerichte rond de enkelpolige chromosomen bevatten. Herstelde eicellen dient nogmaals een vat-vormige bipolaire spindel. Chromosoom uitlijning wordt gedefinieerd als alle chromosomen meer dan 4 μM van de spindel midzone 22. Het is nuttig om eicellen te sporen van DNA en kinetochoren in te stellen als beide kinetochoren buiten deze centrale zone zijn als dit kan moeilijk zijn om te bepalen met behulp van alleen DNA detectie vlek.
Figuur 1. De Elektroforese van het gel van de Denaturingagarose van RNA. RNA kwaliteit en grootte kunnen worden geëvalueerd door elektroforese op een denatureren agarose gel. Een denatureren gel is aanbevolen ter voorkoming van secundaire structuur ontstaan. Lane 1 bevat een RNA molecuulgewicht marker. Lane 2 is een RNA-monster. Opmerking dat de RNA groter dan berekend vanwege de ingebouwde polyA staart zal uitvoeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Valideren van de oöcyt microinjection. Fluorescent microscopie kan worden gebruikt voor het valideren van succesvolle oöcyt microinjection en expressie. Profase I-gearresteerd eicellen microinjected met Gfp worden getoond na overnachting expressie van de constructie. Deze foto werd verkregen met behulp van de Invitrogen EVOS FL Auto imaging systeem voorzien van GFP lichte kubus. De bar van de schaal is 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Beoordeling van kinetochoor-microtubulus bijlagen. (A) A representatieve z-projectie van een koude-behandeld ontmoette ik oöcyt. Klosje (groen), kinetochoren (rood) en DNA (blauw) worden weergegeven. Het vak geeft aan de regio van de optische zoom. Pijlpunten duiden eind bijlagen van kinetochoren tot microtubuli van een enkele tweewaardig. De bar van de schaal is 10 µm voor klosje, kinetochoor, DNA en kanalen verenigen. Schaal bar voor optische zoom is 5 µm. (B) voorbeelden van abnormale kinetochoor-microtubulus bijlagentypen in eicellen van de muis. Pijlen geven aan kinetochoor-microtubulus bijlage sites. De bar van de schaal is 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Chromosoom uitlijning uitdaging assay. Stroomschema van de procedure met representatieve z-projecties van eicellen bij elke stap. Eicellen zijn eerste verviel aan de metafase van meiose ik (ontmoette ik), vervolgens overgebracht naar een nieuwe schotel met monastrol voor 2 h ertoe monopolaire spindel vorming. Volgende eicellen zijn toegestaan om te herstellen in rijping medium aangevuld met een proteasoom-remmer (MG132) om te voorkomen dat anafase begin gedurende 3 uur. Eenmaal herstelde eicellen zijn vaste, gelabeld voor klosje (groen), kinetochoren (rood) en DNA (blauw) en beeld via confocale microscopie om uitlijning status te bepalen. Lijnen geven de lengte van de spindel (40 µm) en midzone (20 µm) bepaald met behulp van de vergelijking van de stelling van Pythagoras spindel. Pijlen geven aan dat punt gereedschap posities bij elke paal. Elke kinetochoren > 4 µm van de spindel-midzone worden beschouwd als unaligned. Sterretje geeft aan unaligned chromosoom (5.6 µm van midzone). De bar van de schaal is 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanwege de snelle en toenemende identificatie van menselijke genetische varianten ziekte is gekoppeld, is het noodzakelijk dat systemen voor de evaluatie van hun biologische betekenis worden vastgesteld. Begrip eiwitfunctie in menselijke meiose poses bijzondere uitdagingen omdat menselijke eicellen kostbare zijn en zeldzame en menselijk sperma niet vatbaar voor genetische manipulatie zijn. Muis eicellen zijn een waardevol voor de evaluatie van menselijk Meiotische gen functie 10,23zoogdieren modelsysteem. Dit model omzeilt de impracticalities van het gebruik van menselijke eicellen terwijl het verstrekken van een beschikbaar bron van goedkope, manipuleerbare eicellen die meiose vergelijkbaar met menselijke kiemcellen ondergaan terwijl zijn nuttig voor het begrijpen van hoe genetische varianten mogelijk van invloed op vrouw vruchtbaarheid.
Omdat deze methoden ectopische expressie van het menselijke eiwit in muis eicellen via microinjection dienst, is het cruciaal voor het eerst tot stand brengen van een concentratie van controle, wild-type RNA dat niets aan Meiotische rijping verandert. Het is aanbevolen dat Meiotische rijping kinetiek (nucleaire envelop verdeling, polar lichaam extrusie) gecontroleerd in controle eicellen basislijn parameters, en beoordeling spindel en chromosoom morfologie vast te stellen. Daarnaast zorgen voor uniforme microinjection volumes is cruciaal voor het vergelijken van groepen. Met inbegrip van een fluorescerende tag op het gen van belang kunt vereenvoudigen deze technische uitdaging. Technieken voor het beheersen van de oöcyt microinjection geweest eerder bewezen 15. Visualisatie van geïnjecteerde eicellen onder een fluorescentie Microscoop of bepalen eiwit expressie via westelijke vlek zijn ook waardevolle hulpmiddelen voor het bevestigen van consistente injectie concentraties.
Omdat fouten in chromosoom segregatie in zoogdieren eicellen zijn een belangrijke oorzaak van embryonale aneuploïdie en zwangerschap verlies5, analyse van kinetochoor-microtubulus bijlagen bieden een waardevol instrument voor de beoordeling of een gen van belang beïnvloedt chromosoom segregatie (d.w.z. onjuiste bijlagen zal veroorzaken verkeerde segregatie). Een 10 minuten blootstelling aan gekoeld media is voldoende om de depolymerize van microtubuli die een kinetochoor-microtubulus-bijlage, waardoor de visualisatie van stabiele bijlagen via confocale microscopie 24niet hebben. Voor deze test is het belangrijk niet te veel de eicellen chill, omdat dit tot de depolymerization van stabiele microtubuli leiden zal. Daarnaast is optimalisatie van procedures kleuring sleutel voor visualisatie van kinetochoor en microtubulus structuren. Om voldoende beeldresolutie voor analyse, kleine stapjes (≤ 1 μm) in het z-vlak met behulp van een 40 x-63 x doelstelling moet worden vastgelegd, en dat verkrijgen beelden door de structuur van de gehele spindel om alle bijlagen zijn zichtbaar. Merk op dat het is gemeen hebben niet-vastgemaakte kinetochoren tijdens prometaphase van meiose ik 25.
Het chromosoom uitlijning uitdaging assay is handig voor de evaluatie van de winst of het verlies-van-functie varianten. Winst-van-functie varianten kunnen moeilijk te beoordelen omdat muis eicellen van jonge koeien lage niveaus van aneuploïdie hebben. Deze test overwint deze hindernis door het genereren van een situatie waarin de oöcyt experimenteel geïnduceerde onjuiste kinetochoor-microtubulus bijlagen moet corrigeren. Tot oprichting van een punt van de tijd waarin controle eicellen 1-2 uitgelijnd chromosomen bevatten nadat herstel een kwantificeerbare scenario biedt om te bepalen of een mutant biedt verhoogde uitlijning efficiëntie (dat wil zeggen betere uitlijning mogelijkheden zal Bescherm euploidy). Voor de kwantificering van chromosoom afwijking, een eerder gangbaar protocol in welke chromosomen groter is dan 4 μm van de spindel midzone worden gekenmerkt als unaligned kan worden gebruikte 18.
Studeren verlies-van-functie varianten, zijn extra experimentele omstandigheden nodig vanwege de endogene homolog binnen de studie-systeem. Unidirectioneel om te verlichten van dit probleem is het gebruik of het genereren van een knock-out muismodel van de variant van belang. De komst van het frisser/Cas9 systeem kon bieden een snelle manier voor het genereren van dergelijke uitsparingen 26. Als alternatief, indien een knock-out-model geen optie is, klassieke vechtpartij technieken zoals mede via injectie morfolino antisense oligonucleotides of kleine storende RNAs kon worden toegepast. Aandacht aan het ontwerp van de reeks is echter vereist om te voorkomen dat elke mogelijke storing van de microinjected variant bestudeerde. Bijvoorbeeld, zou de morfolino oligonucleotide worden ontworpen om te binden aan het 5' niet-vertaalde regio (5' UTR) van de muis-gen dat niet is opgenomen in de menselijke variant van mRNA ingevoerd via microinjection. Als kleine inmenging kon RNAs één richten op een niet-homologe reeks regio of in te voeren stille puntmutaties in het menselijke gen dat targeting onttrekken zou. De endogene eiwit kopie nog steeds aanwezig op de expressie van de variant kan echter informatieve zoals vele varianten te in de heterozygoot staat in het menselijk genoom vinden zijn.
Ten slotte, hoewel niet beschreven in dit protocol, chromosoom aneuploïdie beoordeling kan worden gemakkelijk beoordeeld in ontmoette II eieren als de laatste bepaling in de pijplijn voor de menselijke variant analyse. Een gedetailleerde beschrijving van deze in situ chromosoom verspreid protocol heeft 15eerder beschreven. Kort, microinjected eicellen zijn gerijpt in vitro totdat zij de fase II voldaan, na behandeling met een Meiotische spindel-depolymerizing agent voorafgaand aan de fixatie. Kinetochoor en chromosoom kleuring zoals hier beschreven beoordeling van chromosoom inhoud mogelijk.
Hoewel de muis eicellen bieden een waardevol instrument voor de studie van eiwitten essentieel voor vrouwelijke meiose enkele beperkingen aan het model bestaan. Overexpressie van eiwitten kan erover Meiotische rijping en daarom een RNA-concentratie kan niet bestaan die niet toe een fenotype brengt er. De homolog van de endogene muis storen bovendien lokalisatie van exogene menselijke eiwitten. Generatie van knock-out Muismodellen biedt een oplossing voor dit probleem; echter, dit kan niet haalbaar in alle situaties. Een alternatieve aanpak zou zijn om de muis eiwitten afbreken door het injecteren van mede RNAi of morfolino oligonucleotides ontworpen om niet doel de exogene RNA en eiwitten. Tenslotte is het belangrijk op te merken dat terwijl veel eiwitten homologe tussen zijn menselijke en muis, kan verschillen, wat leidt tot verschillen in lokalisatie en functie die dit soort Kruis-soorten analyse kan uitsluiten. Naarmate genetische manipulatie tools zoals Cas9-genoom bewerken27 goedkoper en meer gemeenschappelijk markt, kan dit protocol evolueren naar knock-in, gehumaniseerd muis lijnen in plaats van te vertrouwen op microinjection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van de American Society for Reproductive Medicine en van de Charles en Johanna Busch Memorial Fund bij Rutgers, The State University van NJ aan K.S. A.L.N. werd gesteund door een subsidie van de N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
