Summary
人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。
Abstract
異数性胚は人間の不妊の主要な遺伝的原因です。これらのイベントのほとんどが女性の減数分裂の間としています、時代だけでが常に異数性胚の生成の危険性の予測ではないとはいえ、母親の年齢との相関します。したがって、遺伝子変異は卵形成中に不適切な染色体分配を考慮可能性があります。人間の卵子へのアクセスが研究目的に限られていることを考える私マウス卵母細胞減数分裂の間人間遺伝子の働きを研究するアッセイのシリーズが開発されました。まず、興味の遺伝子の変異と遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA)、前期私逮捕マウス卵母細胞に microinjected します。式のための時間を許可すると後、卵子は同期的に成熟減数分裂を完了するために放出される私。緑色蛍光タンパク質 (Gfp) などの蛍光レポーターのシーケンスを持つ mRNA をタグによって表現型の変化に加えて人間蛋白質のローカリゼーションを評価できます。たとえば、ゲインまたは機能の損失は、減数分裂エラーを修正する遺伝子プロダクトを挑戦実験の条件を確立することによって調べることができます。蛋白質の表現は内因性のレベルでないことを考えると、(すなわちノック制御しない限り、結果の適切な解釈を行わなければならないこのシステムはとりこませた人間蛋白質機能の調査に有利であるが、うち上下)、マウスのホモログがシステムに存在も。
Introduction
不妊症は、生殖年齢の1、そこからほぼ半分を求める医療2人の人口の 10-15% に影響を与える条件です。不妊症の病因は多様であるが、多因子の多くの場合、人間の最も一般的な遺伝的異常は異数性胚3です。異数性は、細胞内の染色体の正しい数の偏差 (ゲインまたはロス) として定義されます。ヒト胎芽における異数性の現象は、一般的な高齢出産4、5と増加します。この戦略の結果、増加注入率、流産率の低下と時間の短縮のため子宮の転送の唯一の染色体正常 (欠) 胚の選択の利点を強調している 4 つのランダム化比較試験妊娠6,7,8,9を達成します。したがって、人間の異数性の病因を理解すること、生殖補助医療に重要な意味を持つことができます。
染色体異常で着床前遺伝子検査は不妊治療に有益であるが、染色体異常の発生の理解はまだ欠けています。減数分裂期の染色体異常 (配偶子生産の間に由来) と母親の年齢、しかし、いくつか女性存在異数性胚率の恵まれた時代4の平均レートを逸脱した正の相関関係があることを広く受け入れられています。これらのケースは、年齢だけが常に異数性胚を生成するリスクの予測ではないことをお勧めします。他の要因は遺伝子変異など胎児の異数性のリスクを増加させる役割を果たす可能性があります。
卵母細胞の減数分裂の間に異数性の遺伝子の変形の潜在的な貢献の調査の重要な側面は、減数分裂遺伝子機能を迅速に評価するシステムを設計することです。倫理的な制約と制限付きアクセスのため、卵子を使用してこれらのテストを実行する実用的ではありません。マウス卵母細胞を使用して、これらの問題を回避ことができます、ここで減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために試金のシリーズ私は説明しました。マウス卵人間蛋白質の局在化の可視化し、野生型および変異人間蛋白質の異所性発現結果いずれかのかどうかを判断するために使用によって興味の遺伝子の変形のためメッセンジャー RNA (mRNA) のコーディングを microinjecting、異数性につながることができる表現型の変化。これらの表現型は、動原体と重要な減数分裂 i 中期の染色体の整列をサポートすることができない妹に不適切に接続する微小管の増加、利得と機能の損失を調査するこのプロトコルを使用することができます。よう卵母細胞の減数分裂のキー イベントに挑戦する実験的条件を確立することによって遺伝的変異は、建物と染色体の整列10 をスピンドルします。
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Protocol
1. 分子クローニング
- 興味の遺伝子のフルレングスのコード配列を取得およびプラスミッドの in vitro転写 (pIVT) ベクトル11。
注: 完全長 cDNA クローンは、さまざまなベンダーから市販されているまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を生成することができます。国立生物工学情報 (NCBI) オンライン リソース センターがヌクレオチドから遺伝子のトラン スクリプトのシーケンスを提供し、タグ付きの発現順序 (EST) データベース。蛋白質の容易にするため、可視化と表現のレベル、緑色蛍光タンパク質 (Gfp) の融合または別の適切な蛍光タグの解析クローニング法で必要があります。 - 検証済みのクローニング法を使用して、pIVT の複数のクローン作成領域に興味の遺伝子のコーディングのシーケンスを挿入します。分子クローニングの詳細な説明と必要な手順は以前説明した12をされています。
注: 遺伝子融合製品を生成する場合は、クローニングが適切なリーディング ・ フレームであることを確認します。 - グロビンのプライマーを使用して正しい遺伝子挿入、適切なフレームの融合およびポリメラーゼ誘導点突然変異が作成されなかったことを確保するため、構成をシーケンスします。
注: サンガー DNA シークエンス装置が利用できない場合、多くの企業は、低コストの DNA シーケンス オプションを提供します。 - 単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) または挿入/削除 (オクターリピート) を生成する場合は、DNA を mutagenize します。DNA の変異は、以下手順 1.5 1.7 で説明されます。野生型のコンス トラクターに 1.7 の線形化手順に進みます。
- 突然変異誘発のプライマーを設計し、製造元のプロトコルごとの変異の構造を生成する突然変異誘発 PCR の反作用を完了します。Pcr のサイト指示された突然変異誘発は前述の13をされています。さらに、多くの企業は、プロトコルを含むサイト指示された突然変異誘発キットを提供しています。
- 人為の DNA を細菌のホストに変換します。分離し、プラスミドを浄化します。
注: 多くの企業は、簡単に分離し、プラスミド DNA を浄化するために使用できるキットを作る。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。大腸菌などのグラム陰性細菌株を使用している場合は、エンドトキシンを除去するキットを使用することをお勧めします。 - 目的の SNP または塩基の導入を確認する標準のサンガー DNA シーケンスを用いた細菌の形質転換体からの DNA の分離をシーケンスします。
- 精製の DNA の単一の制限の酵素の消化力を使用して最終製品をリニア化します。
注: pIVT ベクトルには複数単一酵素プラスミド Addgene 14地図に記載されているサイトをカットが含まれています。 - 製品は agarose のゲルの電気泳動による線形であることを確認します。Agarose のゲルの電気泳動の方法論は、定義された14を以前されて。
メモ: すべての残りの手順使用してバリア (フィルター) ピペット ヒントと RNase フリー材料安定かつ高品質な RNA の生産を確保するため。 - 検証済みの DNA クリーンアップ プロトコルまたはキットを使用して消化製品を浄化し、30 μ L RNase/DNase 自由な水に溶出します。
注: シリカ マトリックス スピン列ベースのキットは高品質でお勧めは、DNA を精製しました。に応じてメーカー プロトコルに従ってください。 - 体外製造元のプロトコルに続く T7 ポリメラーゼを用いた DNA を転写します。
- 浄化し、RNase/DNase 自由水製造元のプロトコルに続くシリカ マトリックス スピン列に基づく核酸精製キットを使用しての 30 μ L の RNA を溶出します。
- 変性アガロース電気泳動ホルムアルデヒドを使用して最終的な RNA 製品サイズを確認するを実行します。1.13 1.22 手順14を参照してください。(図 1)。
- 水、溶解するまで 72 mL に 1 g アガロースを加熱してゲルを準備し、60 ° C に冷却
- 10 X モップ 0.4 M モップ (pH 7.0)、0.1 M 酢酸ナトリウム、0.01 M EDTA を追加して連続したバッファーを準備します。
- 10 X モップ冷却アガロース溶液をバッファー、および 37% ホルムアルデヒド (12.3 M) の 18 mL を実行しての 10 mL を追加します。
- カースト ゲル ゲル化コンテナーにアガロース溶液を注ぐことによって。10 μ L を収容できる大きさのくしを使用します。後ゲルを設定している、触れること会社、櫛を慎重に取り外します。
- ゲル電気泳動槽をアセンブルし、十分な 1 X モップ連続したバッファー、ゲルが完全に覆われていることを確認を追加します。
- RNA のサンプルを準備するには、ホルムアルデヒドを含むローディングの染料の 0.5 X ボリュームに RNA の 1 μ g を追加します。
- エチジウム ブロマイドを 10 μ G/ml の濃度で RNA ソリューションに追加します。
- 70 ° C、5 分の RNA 試料溶液を変化させなさい。
- 滅菌を使用して、10 の μ L フィルターのヒントについては、ロードの分子量マーカー 5 μ L、5 μ L の RNA のゲルの別の井戸に試料や、色素がゲルの長さの少なくとも 3 分の 2 を移行まで 5 V/cm で electrophorese。
- UV トランス照明のゲルで RNA を視覚化します。RNA は、分子量マーカーを比較することによって適切なサイズを確認します。
- 濃度と RNA の純度を測定するには、紫外線分光光度計の上で滅菌 10 μ L フィルター チップを使用して浄化された RNA の 1.2 μ L を転送します。
高品質の RNA には A260/280 (1.8 2.2) ・ 260/230 の吸光度比は (> 1.7) それぞれ。 - 滅菌 0.5 μ L 遠沈管 (3-5 μ L/チューブ) に 10 μ L フィルター ヒント、因数の残りの浄化された RNA を使用してください。マイクロインジェクションの準備ができるまで-80 ° c チューブを格納します。
注: 500 ng/μ L の最終注入濃度は最適な出発点です。1:2 で RNase フリー H20 マイクロインジェクション マイクロインジェクション ピペットで RNA の粘着性を減らすために前に RNA を希釈することをお勧めします。
2 動原体微小管添付ファイルの分析
- 卵母細胞をマイクロインジェクションの等しいグループに分割します。
注: 採卵、転送、マイクロインジェクション、成熟の詳細に説明されてゼウスで以前15。 - 実験的 mRNA に 1 つのグループと WT コントロールと PBS またはGfpとその他のグループを microinject mRNA。
注: 500 ng/μ L は10で始まるに推奨される注入濃度です。注入量を制御するために picoinjector を使用できます。5-10 pL の注入量は15をお勧め。 - 胚品質鉱物油で卵 (100-150 μ m)、シャーレでの培養液のミルリノン無料 100 μ L ドロップに転送卵子の直径より大きいカバーの手またはガラス ピペットのオープニング式分注装置は少し口を使用して卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可する 5% C02の 37 ° C で 7 時間孵化させなさいと私 (私に会った) 15。
- 上記のように、同じピペット装置を用いた培養後転送中古冷蔵最低限不可欠なメディア (MEM) コレクション中よくセンターの 700 μ L と 500 μ L H20 外リングを含むセンターよく器官培養皿に卵と場所は 7 分間氷の上の皿。
注: 事前 MEM メディアをリラックスして卵子の治療前に少なくとも 20 分-20 ° C で臓器の培養皿でセンターもそれをお勧めします。 - 室温で 20 分間 1x PBS で 2% パラホルムアルデヒドの 400 μ L を含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用してそれらを移すことによって卵子を修正します。
- 同じを使用して装置のピペット、400 μ L ブロッキング液 (PBS + 0.3 %bsa + 0.01% Tween 20 + 0.02% ナン3) とストアを含むスポット プレートに別のウェルに卵子を転送免疫染色を処理する準備ができるまで 4 ° c。
注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。 - 同じピペットなどの器具を使用して、スポットの新しい井戸に転送を卵母細胞含んでいる 400 μ L 透過ソリューション (PBS + 0.3 %bsa + 0.1% TritonX 100 + 0.02% ナン3) をプレートし、3 つを素早く転送卵子で 20 分間室温でインキュベート滴 400 μ L の任意の残留洗剤を削除する解決を妨げます。
注: 9 も透明なガラス スポット プレートは単一の皿 (ステップ 2.4 2.5) 複数の治療を通じてグループを移動に適しています。 - 室温で光から保護加湿チャンバーで残りの各種手順を実行します。中型のプラスチック容器の使用は、湿気があるペーパー タオルとアルミ箔でカバーが並んでいます。
- 卵母細胞を 30 μ L ピペット装置を使用して、転送 96 ウェル プレートと 10 分加湿チャンバ内の場所の蓋の解決を妨げます。
注: 滴板に円形のインデントに配置されます。 - セントロメアとスピンドル、ピペットなどの器具を使用してラベルを付け、卵を 30 μ に転送する (ACA、クレスト) 抗セントロメア抗原を含む溶液をブロック (1:30) と抗アセチル化チューブリン (1: 1000) し、少なくとも 1 時間インキュベートします。
- 10 分解決を妨げる 3 つの 30 μ L 滴を介して転送することによって卵子をすすいでください。
- ピペット装置、転送卵子を用いて 30 μ L にブロッキング溶液で二次抗体抗体 (抗ひと IgG 1: 200、1: 200 抗マウス IgG) 上で使用する無料のドロップし、1 時間孵化させなさい。
- 3、30 μ L の 10 分洗浄手順を繰り返します手順 2.11 で説明したソリューションをブロックします。
- 3-5 μ L 中含む DAPI をマウントにピペットの装置を使用して、卵を転送 (5.9 μ g/μ L) ガラス顕微鏡スライドの上。
- 卵母細胞の破砕を防ぐためカバー スリップのコーナーにワセリンの 4 小滴 (ピンの頭のサイズ) を配置します。
- ダウン スライドにカバー スリップ石油ゼリー側をそっと置きます。
- シールの coverslip のエッジ マニキュアをオフにし 5 分間乾かします。
- 共焦点顕微鏡による処理まで、光から保護されて、4 ° C でスライドを保存します。
注: は、取り付け中、coverslip、マッチの屈折を利用されている顕微鏡の対物レンズを確認します。材料は以前されている推奨の取り付けは、 15をについて説明します。 - 画像の小さなステップをキャプチャ、共焦点顕微鏡による 40 63 × 対物卵母細胞 (≤ 1 μ m) 作業目的とイメージ中期スピンドルの地域全体の最適化された z 平面で。
注: 2.11 のステップで使用される特定の二次抗体に基づくすべての 3 チャンネルのイメージを確認します。≥ 4 と 3 のズーム画像は十分な解像度に最適です。1 μ m のステップ サイズは、微小管と体マウス卵母細胞で明確に可視化を提供します。イメージをキャプチャするための手順は、顕微鏡から異なります。顕微鏡設定の構成方法の手順については特定メーカー共焦点のユーザーズ ガイドを参照してください。 - 次の以下の手順による 2.21 2.23 イメージング ソフトウェアを使用して動原体微小管の添付の状態を識別します。
注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。されていた種類の添付の状態は、 16を定義されています。 - 画像 J ツール バーにファイルをドラッグすると、画像を開く。
- 開設の z シリーズを全チャンネル表示 (DNA、動原体、及びスピンドル) [サブ] タブで「色」「チャンネル統合を」、「イメージ」のドロップ ダウン メニューで利用可能なをクリックして。
- 切り替えを使用すると、画像の下部に、各 z スライスを移動し、動原体微小管添付ファイルを決定します。以前の説明はされている詳細な添付ファイル説明16
3. 染色体配置の課題分析
- 2.3 の手順で説明されているようにピペットの装置を使用して、ミルリノン無料文化中油滴 100 μ L に卵子を転送し、卵母細胞の減数分裂中期に十分な成熟を許可するように 7 時間孵化させなさい私 (私に会った) 2.3 17 の手順で前述のよう.
注: 卵母細胞成熟、マイクロインジェクション、コレクションの手順を概説した15。手順 2.1 2.2 コントロール、および RNA マイクロインジェクション濃度で添付ファイルの試金のプロトコルを参照してください。 - 同じピペットなどの器具を使用して、転送センターよく器官培養卵母細胞でセンターも、400 μ L H20 周囲のリングである [100 μ M] を含む含む 700 μ L 培養液中の料理し、37 ° C 2 時間インキュベートします。
- モナス トロール 100 μ CZB 培地の 3 つの滴を上記としてピペット装置を用いて卵を移すことによって洗い落として、700 μ L 培養培地 + MG132 を含む新しいセンターも器官培養皿に卵を転送 [5 μ M] 中心の 3 時間リング。外リングに 400 μ L H20 を追加します。
- 室温で 20 分間 PBS で 400 μ L 2% パラホルムアルデヒドを含む透明なガラス スポット プレートのウェルにピペットの装置を使用して、それらを転送することによって卵子を修正します。
- 転送の卵母細胞を固定後、400 μ L を含む、透明なガラスのスポット プレートの新しい井戸にピペットの装置を使用してブロッキング液およびストアまで 4 ° C での免疫染色の処理します。
注: の 4 ° C、カバーガラス スポット板パラフィルム蒸発を防ぐために、卵を保存します。 - Permeabilize し、免疫細胞化学を介して卵母細胞 2.6 2.16 の手順で説明するようにラベルを付けます。
- 卵母細胞を共焦点顕微鏡 40 63 x 目的を使用して、キャプチャを画像 < 中期紡錘体の全体の地域をイメージを確かめて z 平面の 1 μ m のステップします。
- 染色体の整列を識別するためには、状態は、イメージング ソフトウェアを使用してイメージ ファイルを開きます。
注: 次の手順説明画像 J (NIH) 無料ダウンロード可能なソフトウェアを使用してこの手順は、ただし、代替のイメージング ソフトウェアを使用できます。 - イメージをイメージ J コントロール パネルにドラッグします。
- 開設の z シリーズ (コントロール バーで画像 J ポイント ツール アイコンをクリックして利用可能な) ポイント ツールを使用してイメージをクリックすると画像でスピンドル極上にツールを置く彼らのそれぞれの z スライスで各スピンドル極端ポイントをマークします。キーボードのコマンド + t を押すことによって利益 (率 ROI) マネージャーの地域にこれらのポイントを追加します。
- 各 ROI マネージャーの特定のポイントを強調表示し、測定ボタンをクリックすると手順 3.10 で設定位置の特定の座標を決定します。これは、結果を提供するテーブルを含む x と各ポイントの y 座標。これらそれぞれ X1、Y1、および Y2、X1 のポイントになります。
- 次に、true Z 座標を決定します。これはスピンドル極が識別された z スタックで特定の z スライスのスライス数を乗算することによって (すなわち6 スライス #2) 個々 の各ポイントは、スタックの厚さ (すなわち1 μ m) を (例: スライス 2 x 1 μ m = 2)。これらそれぞれ Z1 と Z2 のポイントになります。
- ピタゴラスの定理の式を使ってスピンドル長さを決定 (2 + b2 = c の2) 以前に定義したを使用して x、y、および z 座標を 3.11 3.13 の手順から。最終的な長さは、各スピンドルに等しい。
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - スピンドル midzone を決定します。これはスピンドルの長さの 1 つの半分として計算されます。画像 J ツール バーの線アイコンをクリックして画像 J で [線] ツールを使用して、主軸 midzone は、1 つのスピンドル極から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。
- ライン計測ツールを使用スピンドル midzone から染色体の距離を評価することによって染色体位置揃えの状態を決定します。画像 J ツール ・ バーの線アイコンをクリックして利用できる [線] ツールを使用して、染色体にスピンドル midzone から線を引きます。長さは、イメージ J ツール バーに表示されます。スピンドル midzone から 4 μ m より大きい染色体は、不整列18と見なされます。
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Representative Results
培養後、A260/A280 率 (1.8 2.2) と分光光度計を使用して測定したとき A260/A230 比 ≥1.7 高品質 RNA があります。図1 図の試験管内での移行-変化の agarose のゲルの電気泳動後 RNA を生産します。パターンやサイズの複数のバンドを持つサンプルで塗られるバンドが汚染またはサンプルの劣化のことを示します。また、複数のバンドは、mRNA を完全に変性していないか、開始のプラスミッドは完全に線形補間されるのではないを示す可能性があります。MRNA は、mRNA体外の安定した表現を可能にする pIVT に組み込まれているポリ adenylated テールのため予想より大きな実行されます。マイクロインジェクションの後は、均一な注入量と蛍光発現レベルを確保することをお勧めします。図 2の写真は、前期Gfpを均一に注入した私逮捕卵母細胞を示しています。一貫性のあるマイクロインジェクション技術はこのプロトコルにとって重要です。画像 J などの画像解析ソフトウェアは、均一性と法の支配を確保するための表現のレベルを検証する使用できます。両方の試金のためのイメージングをしながら細胞レベル下のローカリゼーションの情報を得られることに注意してください。遺伝子の変形の効果を評価するすべてのマイクロインジェクション実験のコントロールとして機能する卵母細胞のサブセットに野生型遺伝子を注入する必要があります。これはマウス卵母細胞における人間の遺伝子の潜在的な過剰発現形質を制御する 1 つことができます。PBS、またはGfp蛍光ラベルのコンス トラクターにする必要がありますまたマイクロインジェクションによる表現型のコントロールに卵母細胞のサブグループに注入されます。蛍光タグなしのコンス トラクターにGfp mRNA は co 注入した十分なマイクロインジェクションを確保するためすることができます。同時に 2 つ以上の構成要素を注入する共同 500 ng/μ L 各 mRNA の最終的な解決を含むような mRNA 濃度を高めるさい。
冷たい安定微小管アッセイは、微小管体の添付の状態を評価するための貴重なツールを提供します。図 3は、中期の共焦点顕微鏡画像の z 投影私卵。この卵は、体にはついていなかったすべての微小管を外界に冷たいメディア処理にさらされました。時間不足、微小繊維染色体 (あまりにも多くの繊維の短すぎる結果) または欠如繊維をすべて一緒に接続されていない (スピンドル構造の長すぎる結果) にはが含まれて、それはのために扱われてきた卵子推奨されるこれらの卵分析で使用されません。減数分裂中期で私それは未接続または横方向に取り付けられている体を含む卵母細胞のために共通、したがって任意の添付ファイルの研究でコントロール グループを使用することお勧め。平均では、野生型卵ない MI で体の 5-10% が含まれますまだ安定して接続されている19。すべての卵母細胞が動原体微小管の添付の状態の分析のための同じ段階であることが欠かせません。その実験を確認し、, 対照群と同様の時間スケールを持つ成熟しただ細胞周期の動態を評価することをお勧め。この分析を実行するには、制御と実験卵母細胞のサブセットを成熟し、ライブ タイムラプス顕微鏡の下で視覚化する必要があります。ミルリノンの使用とミルリノンを欠けているメディアへのリリースが同じ時間20で減数分裂の再開を許可するようの卵母細胞は減数分裂前期で同期されることができます。両方対照群と実験群から卵母細胞減数分裂減数分裂 II (会った)、同じような時間ポイントに到達を示す極体を押し出す必要があります。卵母細胞は Met に熟成可能生細胞顕微鏡が利用できない場合 (7 h) 私と会った II (16 h)、固定、染色前述のように、DNA と微小管を検出します。Met で I および II の会ったバレル形、バイポーラ軸が表示されます。コントロール卵母細胞の染色体は、中期板で揃えます。バリアントの影響によって実験群における染色体の配置は異なります、しかし、染色体を凝縮、スピンドルの中心部に位置する染色体の大半と微小管に接続されている必要があります。卵母細胞数が対照群と実験群における減数分裂 II に達しました。添付ファイルを決定する上での難しさを減らすためにお勧めします状態 z 平面の小さなステップを使用して卵をイメージング特定作業の目的のために最適化されています。解析は z スライスを個別に確認する必要がから発する微小管を接続するポールを決定する差し込み印刷の設定で。図 3 bは、異常な動原体微小管の添付ファイルの例を示しています。どの妹に 1 つだけの動原体ペアがない添付ファイルとして定義されている、スピンドル微小管に接続されている 2価を示します。次に、どの両方の妹で動原体のペアが同じスピンドル極に接続されている syntelic の添付ファイルが表示されます。最後に、merotelic 添付ファイルを示すどの妹に 1 つの動原体は他の妹ながら両方の紡錘体極に接続されているペアの動原体は単一のスピンドル極に接続されています。
図 4の画像は、染色体の配置課題分析の手順を 1 つの動きとして進歩的な期待される DNA と主軸構成を示しています。この試金でさまざまな実験的グループが似たような反応速度で減数分裂を通じて進行するが重要です。記載されている、以前の課題分析を行う前に細胞周期速度の解析を完了するをお勧めしますです。この分析では、卵母細胞異常動原体微小管添付ファイルを正常に修正するための能力が評価されます。これをテストする卵は最初に Met に成熟して確立する動原体微小管の添付ファイルを許可します。次に、卵母細胞にあるとキネシン 5 (EG5) 阻害剤は、モノポーラ スピンドル21にバイポーラのスピンドルが折りたたまれることで孵化します。モノポーラ スピンドルの世代は、100% 動原体微小管-不正な添付ファイルを誘導します。モナス トロール阻害剤は、回復を許可するを洗っています。回復期間中に卵母細胞はバイポーラのスピンドルを再生成する微小管添付ファイルを修正しようとします。プロテアソーム阻害剤 MG132 の追加は、後期発症を防止できます。プロトコルの各段階で、コントロールとして各実験群から卵母細胞の小さなサブセットを修正できます (会った私は、モナス トロール治療、回復の記事) 治療と同じ程度に、すべてのグループが応答していることを確認します。中期私卵母細胞は染色体が中期板に配置バレル形バイポーラ スピンドルを含める必要があります。ある卵母細胞では、染色体単磁極を中心にモノポーラ スピンドルを含める必要があります。回復した卵母細胞はもう一度樽型バイポーラ スピンドルを含める必要があります。任意の染色体と染色体の整列を定義からスピンドル中間22以上 4 μ M。これは DNA 検出のみを使用して特定することは困難することができます両方の体いるこの中央ゾーンを確立する DNA と体を検出する卵母細胞を染色すると便利です。
図 1。RNA の電気泳動 Denaturingagarose.RNA の品質とサイズは、変化の agarose のゲルの電気泳動によって評価できます。変化のゲルは二次構造形成を防ぐためにお勧めします。1 レーンには、RNA 分子量マーカーが含まれています。レーン 2 は RNA のサンプルです。RNA を組み込み polyA 尾のため算出より大きい実行されることに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。卵母細胞のインジェクションを検証します。蛍光顕微鏡は、成功した卵母細胞インジェクションと式を検証する使用できます。Gfpと microinjected 前期私逮捕卵子は、コンストラクトの一晩の式の後表示されます。この写真は、インビトロジェン EVOS フロリダ自動 GFP ライト キューブを搭載したシステムをイメージングを使用して得られました。スケール バーは 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。動原体微小管添付ファイルを評価します。(A) A 代表 z 投影風邪治療の会った私卵。スピンドル (緑)、体 (赤) と DNA (青) が表示されます。ボックスは、光学ズームの領域を示します。矢印は、最後に添付ファイル体の単一の 2価の微小管を示します。スケール バーは、スピンドル、動原体、DNA、チャンネルを統合に 10 μ m です。光学ズームのスケール バーは 5 μ m。 (B) マウス卵母細胞異常動原体微小管の添付ファイルの種類の例です。矢印は、動原体微小管付着部位を示します。スケール バーは 5 μ m ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4。染色体配置課題アッセイ。手順の各ステップで卵母細胞の代表的な z 投影でのフロー チャート卵母細胞は減数分裂中期に成熟最初私 (私に会った)、単極の紡錘体形成を誘導するために 2 h のモナス トロールを含んでいる新しい皿に転送されます。次卵母細胞はプロテアソーム阻害剤 (MG132) 3 h の後期発症を防ぐために成熟培で回復できるとしています。一度回収された卵母細胞は固定、スピンドル (緑)、体 (赤) と DNA (青) の貼付し、配置状態を確認する共焦点顕微鏡によるイメージングします。行はスピンドル (40 μ m) の長さを示す、スピンドル midzone (20 μ m) ピタゴラスの定理の式を使用して決定されます。矢印は、各極でポイント ツールの位置を示します。任意の体 > スピンドル midzone から 4 μ m であるアライメントされていません。アスタリスクは、アライメントされていない染色体 (midzone から 5.6 μ m) を示します。スケール バーは、10 μ mこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
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Discussion
病気に関連付けられている人間の遺伝的変異の迅速かつ増加の識別のための生物学的意義を評価するシステムが確立されているが不可欠です。人間の卵子は貴重なまれな、人間の精子で遺伝子操作を受けやすいので人間減数分裂ポーズ特定課題におけるタンパク質の機能を理解します。マウス卵母細胞は減数分裂遺伝子機能10,23を評価する貴重な哺乳類モデル システムです。このモデルは、女性に影響を与える可能性がありますどのように遺伝的変異を理解するために有用である一方、減数分裂ひと生殖細胞に類似したを受ける低コストで操作可能の卵子の容易に利用可能なソースを提供しながら人間の卵を使用しての impracticalities をバイパスします。不妊です。
これらのメソッドは、マイクロインジェクションを介してマウス卵母細胞の人間蛋白質の異所性発現を採用して、ので、最初コントロール、成熟は変わりません野生型 RNA 濃度を確立する重要です。成熟速度があることをお勧めしますがベースライン パラメーター、および評価の主軸と染色体の形態を確立するコントロールを卵母細胞 (核膜崩壊、極体押出) を監視します。さらに、均一なマイクロインジェクション ボリュームを確保するグループを比較するのに重要です。興味の遺伝子の蛍光タグなどは、この技術的課題を簡素化できます。卵母細胞のインジェクションを習得するためのテクニックは、以前示した15をされています。蛍光顕微鏡またはウェスタンブロットによるタンパク質発現の決定の下で注入した卵母細胞の可視化一貫した注入濃度を確認するための貴重なツールがあります。
動原体微小管添付ファイルの分析を提供する興味の遺伝子かどうかを評価するための貴重なツールに影響を与える哺乳類卵母細胞における染色体分配のエラーは異数性胚の妊娠の損失の5主要な原因なので染色体分配 (すなわち不適切な添付ファイル誤偏析が発生します)。チルド メディアへの 10 分露出で動原体微小管の添付ファイル、共焦点顕微鏡24を介して安定した添付ファイルの可視化をできるように行っていない微小管を外界に十分です。この試金ない安定した微小管の脱重合につながる過剰卵母細胞を冷やすに重要です。さらに、染色法の最適化は、動原体と微小管構造の可視化のためのキーです。小さなステップ、分析に適切な画像の解像度を確保するため (≤ 1 μ m) 40 x-63 x を使用して z 平面の目的をキャプチャするか、およびすべての添付ファイルを確保するため全体の主軸構造を介して取得画像が表示されます。一般的である未接続の体中に減数分裂の prometaphase 私25です。
染色体配置の課題分析、利得または損失の機能変形の評価に役立ちます。機能獲得の亜種は、若い女性からマウス卵母細胞は異数性の低レベルを持っているので評価することは困難することができます。この試金は、卵母細胞が実験的不適切な動原体微小管添付ファイルを修正する必要があります状況を生成することによって、このハードルを克服します。リカバリに変異が増加配置効率 (すなわちよりよい配置の機能を提供して かどうかを決定するため定量化可能なシナリオは、後に、コントロール卵母細胞が 1-2 ずれている染色体を含む時間ポイントを確立します。保護する euploidy)。染色体のずれ、染色体がスピンドルから 4 μ m より大きい midzone は不整列として特徴付けられる以前に確立されたプロトコルの定量化のために使用される18。
機能喪失のバリエーションを勉強するには、追加実験条件は研究システム内の内因性の相同物のため必要であります。この問題を軽減する 1 つの方法は、使用、または関心のバリアントのノックアウト マウス モデルを生成することです。鮮明/Cas9 システムの出現は、このようなノックアウト26を生成する簡単な方法を提供できます。また、ノックアウト モデルはオプションではありません、共同 morpholino アンチセンス オリゴヌクレオチドまたは小さい干渉の RNAs を注射するといった古典的なノックダウン技術が用いることが。ただし、シーケンス設計に注意は研究の下で microinjected のバリアントとの潜在的な干渉を避けるために必要です。たとえば、マイクロインジェクションを介して導入された人間の mRNA バリアントに含まれていないマウス遺伝子の 5' 非翻訳領域 (5' UTR) にバインドする morpholino オリゴヌクレオチドを設計する可能性があります。小さな干渉を使用して Rna の 1 つは非相同領域をターゲットか、ターゲットが回避する人間の遺伝子の点突然変異はサイレントを紹介できます。しかし、内因性のタンパク質のコピーをバリアントの式の時にまだ存在することが有益であろう多くの亜種が人間のゲノムでヘテロ接合の状態で発見されています。
最後に、このプロトコルで記述されていないが染色体異数性評価容易に評価できます会った II 卵人間バリアント解析パイプラインの最後の試金として。この場で広がる染色体のプロトコルの詳細な説明には、 15は前述します。簡潔に、microinjected 卵母細胞成熟までが体外固定する前に減数分裂紡錘脱重合剤による治療を次に会った II の段階に達する。動原体と染色は前述のように染色体の内容の評価を可能にします。
マウス卵母細胞は、モデルの存在するいくつかの制限女性減数分裂に重要なタンパク質の研究のための貴重なツールを提供します。蛋白質の過剰発現は成熟を混乱させることができます、したがって RNA 濃度によっては、表現型を誘発しないことが存在しないことがあります。さらに、内因性マウスの相同物は、外因性の人間蛋白質のローカリゼーションを妨げる可能性があります。ノックアウト マウス モデルの生成は、この問題のソリューションを提供します。しかし、これは、すべての状況で実行可能なできない場合があります。共同 RNAi を注入することによりマウスの蛋白質を破壊する代替的アプローチか morpholino オリゴヌクレオチドが外因性 RNA および蛋白質ないターゲットに設計されています。最後に、それは多くの蛋白質ある間相同性に注意することが重要人間とマウスの違いはありませんが、ローカリゼーションとクロス種分析のこのタイプを排除できる機能の違いに 。Cas9 ゲノム編集27のような遺伝子操作ツールより安くより一般的な場所になると、このプロトコルがインジェクションではなくノックで、ヒト化マウス ラインを作ることに進化します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、アメリカ生殖医学会およびチャールズとラトガーズ大学でヨハンナ ブッシュ記念基金研究助成金によって支えられた、k. s. A.L.N. に NJ の州立大学は、N.I.H. (F31 HD0989597) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
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