Summary

Ved hjælp af musen oocyter at vurdere menneskelige genfunktion under meiose jeg

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

Som de genetiske varianter forbundet med menneskelig sygdom begynder at blive afdækket, det stadig vigtigere at udvikle systemer, som hurtigt vurdere den biologiske betydning af de identificerede varianter. Denne protokol beskriver metoder til evaluering menneskeligt genfunktion under kvindelige meiose jeg bruger musen oocyter.

Abstract

Embryonale aneuploidi er den største genetiske årsag til infertilitet hos mennesker. De fleste af disse begivenheder stammer under kvindelige meiose, og omend positivt korreleret med moderens alder, alder alene er ikke altid intelligent af risikoen for at generere et aneuploid Foster. Derfor kan gen-varianter tegner sig for forkert kromosom segregation under oogenesen. Adgang til menneskelige oocyter er begrænset til forskningsformål, en række assays blev udviklet for at studere menneskelige genfunktion under meiose jeg bruger musen oocyter. Først, messenger RNA (mRNA) genet og genet variant af interesse er microinjected til prophase jeg-anholdt mus oocyter. Efter giver tid til udtryk, oocyter udgives synkront i meiotiske modning at fuldføre meiose jeg. Ved tagging mRNA med en sekvens af en fluorescerende reporter, såsom grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), kan lokalisering af det menneskelige protein vurderes ud over de fænotypiske forandringer. For eksempel, vinde eller tab af funktion kan undersøges ved at etablere forsøgsbetingelser, der udfordrer gen produktet til fix meiotiske fejl. Selv om dette system er en fordel i at undersøge menneskelige protein funktion under oogenesen, bør passende fortolkning af resultater foretages, da protein udtryk ikke er på endogene niveauer og, medmindre kontrolleret for (dvs. bankede ud eller ned) er murine homologs også til stede i systemet.

Introduction

Barnløshed er en sygdom, der rammer 10-15% af den menneskelige befolkning af fødedygtige alder 1, hvorfra næsten halvdelen søge lægebehandling 2. Selv om årsagen til barnløshed er mangfoldigt og i mange tilfælde multifaktoriel, er den mest almindelige genetiske abnormitet i mennesker embryonale aneuploidi 3. Aneuploidi er defineret som afvigelse (gevinst eller tab) af det rigtige antal kromosomer i en celle. Fænomenet med aneuploidi i menneskelige embryoner er fælles og øger med avanceret moderens alder 4,5. Fire randomiserede kontrollerede forsøg har fremhævet fordelen af at vælge kun chromosomally normal (euploid) embryoner til uterin overførsel, fordi denne strategi resulterede i øget implantation satser, lavere abort priser og en kortere tid for at opnå graviditet 6,7,8,9. Derfor kan forståelse ætiologien af menneskelige aneuploidi have stor betydning i assisteret reproduktion.

Selv om præ-implantation genetisk testning for aneuploidies er gavnligt i barnløshed behandlinger, mangler stadig en grundig forståelse af hvordan aneuploidies stammer. Det er almindeligt accepteret, at der er en positiv korrelation af meiotiske aneuploidies (opstod i gamet produktion) og moderens alder, men nogle kvinder nuværende embryonale aneuploidi priser, der afviger fra den gennemsnitlige sats for deres given alder 4. Disse tilfælde foreslå, at alder alene ikke er altid intelligent af risikoen for at generere et aneuploid Foster. Andre faktorer kan spille en rolle i at øge risikoen for embryonale aneuploidi, som gen-varianter.

Et centralt aspekt af efterforske det potentielle bidrag fra et gen variant til aneuploidi under oocyt meiose er at designe et system hurtigt vurdere meiotiske genfunktion. På grund af etiske begrænsninger og begrænset adgang er det upraktisk at udføre disse eksperimenter ved hjælp af menneskelige æg. Disse spørgsmål kan omgås ved hjælp af musen oocytter, og her en serie af assays til at vurdere menneskeligt genfunktion under meiose jeg er beskrevet. Af microinjecting messenger RNA (mRNA) kodning for genet variant af interesse, kan lokalisering af det menneskelige protein i mus æg visualiseres og bruges til at bestemme, hvis den Ektopisk udtryk for den wild-type og muteret humant protein resulterer i nogen fænotypiske forandringer, der kan føre til aneuploidi. Disse fænotyper omfatter en stigning i mikrotubuli, der tillægger den forkert at søster kinetochore og manglende evne til at støtte kromosom justering på metafase meiose i. vigtigere, denne protokol kan bruges til at undersøge både gevinst og tab af funktion genetiske varianter ved at etablere særlige eksperimentelle betingelser at udfordre nøglebegivenheder i oocyt meiose såsom spindel bygning og kromosom justering 10.

Protocol

1. molekylære kloning Opnå fuld længde kodende sekvens af gen interesse og plasmid in vitro- transskription (pIVT) vektor11.Bemærk: Fuld længde cDNA kloner er kommercielt tilgængelige fra forskellige leverandører eller kan genereres via reverse transkription polymerase kæde reaktion (RT-PCR). National Center for bioteknologi oplysninger (NCBI) online ressource giver udskrift sekvenser af gener fra nukleotid og udtrykt sekvensen markeret (EST) databaser. For at lette …

Representative Results

Efter in vitro vil transskription høj kvalitet RNA have en A260/A280 ratio (1,8-2.2) og en A260/A230 forholdet ≥1.7 målt ved hjælp af et spektrofotometer. Billedet i figur 1 viser migrationen af in vitro-producerede RNA på en denaturering agarosegel efter elektroforese. Et band, der er smurt i mønster eller en stikprøve, der har flere mellemstore bands kan angive forurening eller forringelse af prøven. Alternativt, flere bands kan i…

Discussion

På grund af den hurtige og stigende identifikation af menneskers genetiske varianter forbundet med sygdom, er det vigtigt, at systemerne er etableret for at evaluere deres biologiske betydning. Forstå protein funktion i menneskelige meiose skaber særlige udfordringer, fordi menneskelige oocyter er dyrebare og sjældne og menneskelige sædceller er ikke indstillet til genmanipulation. Musen oocyter er et pattedyr modelsystem værdifulde for evaluering meiotiske menneskegener funktion 10,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af forskning tilskud fra American Society for Reproductive Medicine og Charles og Johanna Busch Memorial Fund på Rutgers, The State University i NJ til K.S. A.L.N. blev støttet af en bevilling fra N.I.H. (F31 HD0989597).

Materials

0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

References

  1. Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
  2. Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
  3. Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
  4. Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
  5. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  6. Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
  8. Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
  9. Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
  10. Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
  11. Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
  12. Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
  13. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
  14. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
  15. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
  16. Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
  17. Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
  18. Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
  19. Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
  22. Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  23. Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
  24. Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
  25. Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
  26. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  27. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).

Play Video

Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

View Video