Summary

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Published: April 10, 2018
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Summary

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Abstract

Aneuploidía embrionaria es la principal causa genética de la infertilidad en los seres humanos. La mayoría de estos eventos se origina durante la meiosis femenina, y aunque se correlacionó positivamente con la edad materna, edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Por lo tanto, variantes genéticas podrían explicar la segregación incorrecta de cromosomas durante la ovogénesis. Dado que el acceso a ovocitos humanos es limitado para fines de investigación, se desarrollaron una serie de ensayos para estudiar la función del gen humano durante meiosis utilizando ovocitos de ratón. En primer lugar, el ARN mensajero (ARNm) del gen y la variante del gen de interés son microinyectados en ovocitos de ratón arresté a profase. Después de permitir tiempo para la expresión, ovocitos son liberados sincrónicamente en maduración meiótica para completar la meiosis I. Por marcado el ARNm con una secuencia de un reportero fluorescente, como la proteína verde fluorescente (Gfp), la localización de la proteína humana puede ser evaluada además de las alteraciones fenotípicas. Por ejemplo, ganancia o pérdida de función puede investigarse mediante el establecimiento de las condiciones experimentales que el producto génico para corregir errores meiotic. Aunque este sistema es ventajoso en la investigación de la función de la proteína humana durante la Oogénesis, adecuada interpretación de los resultados debe realizarse teniendo en cuenta que no es expresión de la proteína en los niveles endógenos y, a menos que controla (es decir, golpeado hacia fuera o hacia abajo), murinos homólogos también están presentes en el sistema.

Introduction

La infertilidad es una condición que afecta a 10-15% de la población humana de la edad reproductiva 1, de los cuales casi la mitad busca tratamiento médico 2. Aunque la etiología de la infertilidad es diversa y en muchos casos multifactoriales, la anormalidad genética más común en los seres humanos es aneuploidía embrionaria 3. Aneuploidía se define como la desviación (ganancia o pérdida) del número correcto de cromosomas en una célula. El fenómeno de la aneuploidía de los embriones humanos es común y aumenta con la edad maternal avanzada 4,5. Cuatro ensayos controlados aleatorios han destacado el beneficio de seleccionar embriones sólo cromosómicamente normales (euploides) para la transferencia uterina porque esta estrategia dio lugar a la creciente implantación de tarifas, tasas de aborto espontáneo y un tiempo más corto para lograr embarazo 6,7,8,9. Por lo tanto, entender la etiología de la aneuploidía humana puede tener implicaciones importantes en la reproducción asistida.

Aunque las pruebas genéticas preimplantacional de aneuploidías están beneficiosa en tratamientos de la infertilidad, todavía carece de una comprensión profunda de cómo originan aneuploidías. Es ampliamente aceptado que existe una correlación positiva de aneuploidías meióticas (originados durante la producción de gametos) y la edad materna, sin embargo, algunas tasas de aneuploidía embrionaria presente las mujeres que se desvían de la tasa media para su edad determinada 4. Estos casos sugieren que la edad sola no siempre es predictivo del riesgo de generar un embrión aneuploide. Otros factores pueden jugar un papel en el aumento del riesgo de aneuploidía embrionaria, como variantes genéticas.

Un aspecto clave de investigar la posible contribución de una variante del gen a aneuploidía durante la meiosis del ovocito es diseñar un sistema para evaluar rápidamente la función del gen meiótica. Debido a las limitaciones éticas y acceso limitado, no es práctico para llevar a cabo estos experimentos con óvulos humanos. Estas cuestiones pueden eludirse mediante el uso de ovocitos de ratón, y aquí una serie de ensayos para evaluar la función humana del gene durante la meiosis se describen. Por microinjecting el ARN mensajero (ARNm) que codifica para la variante del gen de interés, la localización de la proteína humana en el óvulo de ratón puede ser visualizada y utilizada para determinar si los resultados de la expresión ectópica de la proteína humana de tipo salvaje y mutada en cualquier alteraciones fenotípicas que podrían conducir a aneuploide. Estos fenotipos incluyen el aumento de microtúbulos que se adhieren a la incorrecta a hermana cinetocoro y la incapacidad para apoyar la alineación del cromosoma en metafase de la meiosis I. importante, este protocolo puede utilizarse para investigar tanto ganancia como pérdida de la función variantes genéticas mediante el establecimiento de condiciones experimentales específicas a eventos clave en la meiosis del ovocito como eje de alineación de edificio y el cromosoma 10.

Protocol

1. molecular clonación Obtener completa secuencia de codificación del gen de interés y el plásmido en vitro transcripción (pIVT) vector11.Nota: Clones de cDNA de larga duración están comercialmente disponibles de distintos proveedores o pueden generarse mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR). El Centro Nacional de recursos en línea de información de biotecnología (NCBI) proporciona secuencias de genes de transcripción de los …

Representative Results

Después en vitro transcripción RNA de alta calidad tendrá una relación A260/A280 de (1.8-2.2) y un ≥1.7 de relación A260/A230 medido usando un espectrofotómetro. La imagen en la figura 1 muestra la migración de in vitro-produce el RNA en un gel de agarosa desnaturalización después de electroforesis. Una banda que es manchada en patrón o muestra que tiene múltiples bandas de tamaño puede indicar contaminación o degradación de …

Discussion

Debido a la rápida y creciente identificación de variantes genéticas humanas asociadas con la enfermedad, es esencial que se establezcan sistemas para evaluar su significado biológico. Comprender la función de la proteína en meiosis humana plantea desafíos particulares porque son preciosos ovocitos humanos y espermatozoides humanos y raros no son susceptibles de manipulación genética. Ovocitos de ratón son un sistema mamífero modelo valioso para la evaluación de genes humanos meiótica función <sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la sociedad americana de medicina reproductiva y de la Charles y Johanna Busch Memorial Fund en Rutgers, Universidad Estatal de NJ a K.S. A.L.N. fue apoyado por una subvención de la I.N.S. (F31 HD0989597).

Materials

0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

References

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Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

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