Summary
När de genetiska varianter som är associerad med mänskliga sjukdomar börjar bli avslöjade, blir det allt viktigare att utveckla system att snabbt utvärdera den biologiska betydelsen av de identifierade varianterna. Det här protokollet beskriver metoder för att utvärdera mänskliga geners funktion under kvinnliga meios jag använder mus oocyter.
Abstract
Embryonala aneuploidi är den största genetiska orsaken till infertilitet hos människor. De flesta av dessa händelser uppstår under kvinnliga meios, och om än positivt korrelerade med moderns ålder, ålder ensam är inte alltid förutsägande av risken för att generera ett aneuploid embryo. Därför kanske genvarianter står för felaktiga kromosomsegregering under oogenes. Med tanke på att tillgång till mänskliga äggceller är begränsad för forskningsändamål, utvecklades en rad analyser för att studera mänskliga geners funktion under meios jag använder mus oocyter. Först, budbärar-RNA (mRNA) av genen och Genvariant av intresse är microinjected i profas jag-arresterad mus oocyter. Efter att tid för uttryck, oocyter synkront släpps ut i meiotiska mognad att slutföra meios jag. Genom att tagga mRNA med en sekvens av en fluorescerande reporter, såsom grönt fluorescerande protein (Gfp), kan lokalisering av det mänskliga proteinet bedömas utöver de fenotypiska förändringarna. Till exempel vinst eller förlust av funktion kan undersökas genom att fastställa experimentella förhållanden som utmanar den genprodukten fixar meiotiska fel. Även om detta system är fördelaktiga i att undersöka humant proteinfunktion under oogenes, bör adekvat tolkning av resultaten göras eftersom proteinuttryck inte är på endogena nivåer och, om inte kontrollerat för (dvs knackade ut eller ner) förekommer murina homologs också i systemet.
Introduction
Barnlöshet är ett tillstånd som drabbar 10-15% av den mänskliga befolkningen av reproduktiv ålder 1, där nästan hälften söka medicinsk behandling 2. Även om etiologin till infertilitet är varierande och i många fall multifaktoriell, är den vanligaste genetiska defekter hos människa embryonala aneuploidi 3. Aneuploidi definieras som avvikelsen (antingen vinst eller förlust) för rätt antal kromosomer i en cell. Fenomen av aneuploidi i mänskliga embryon är vanligt och ökar med moderns ålder 4,5. Fyra randomiserade kontrollerade studier har belyst fördelen att välja endast kromosomalt normala (euploid) embryon för livmoderns överföring eftersom denna strategi resulterade i ökad implantation priser, lägre missfall priser och kortare tid för att uppnå graviditet 6,7,8,9. Därför kan förstå etiologin av mänskliga aneuploidi få stor betydelse i assisterad befruktning.
Även om preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidies är fördelaktigt i barnlöshetsbehandlingar, saknas fortfarande en grundlig förståelse för hur aneuploidies härstammar. Det är allmänt accepterat att det finns en positiv korrelation meiotiska aneuploidies (sitt ursprung under gamete produktion) och moderns ålder, men vissa kvinnor närvarande embryonala aneuploidi priser som avviker från den genomsnittliga skattesatsen för deras given ålder 4. Dessa fall tyder på att ålder ensam inte är alltid förutsägande av risken för att generera ett aneuploid embryo. Andra faktorer kan spela en roll för att öka risken för embryonala aneuploidi, såsom genvarianter.
En viktig aspekt att undersöka en Genvariant till aneuploidi potentiella bidrag under äggcellen meios är att utforma ett system för att snabbt utvärdera meiotiska geners funktion. På grund av etiska restriktioner och begränsad tillgång är det opraktiskt att utföra dessa experiment med mänskliga ägg. Dessa problem kan kringgås med hjälp av musen oocyter och här en rad analyser att bedöma mänskliga geners funktion under meios I är beskrivna. Av microinjecting den budbärar-RNA (mRNA) som kodar för genvarianten sevärdheter, kan localizationen av det mänskliga proteinet i mus ägget visualiseras och används för att bestämma om ektopisk uttryck för vildtyp och muterade mänskliga proteinet resulterar i någon fenotypiska förändringar som kan leda till aneuploidi. Dessa fenotyper inkluderar en ökning i mikrotubuli som fäster det olämpligt att syster Kinetochor och oförmåga att stödja kromosom anpassning vid metafas av meios I. viktigast, detta protokoll kan användas för att undersöka både vinst och förlust av funktion genetiska varianter genom att inrätta särskilda experimentella villkor att utmana viktiga händelser i äggcellen meios som spindel byggnad och kromosom justering 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. molekylär kloning
- Erhålla fullängds kodande sekvens av genen av intresse och plasmid i vitro transkription (pIVT) vektor11.
Obs: Fullängds cDNA kloner är kommersiellt tillgängliga från olika leverantörer eller kan genereras via omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR). National Center for Biotechnology Information (NCBI) online-resurs ger avskrift sekvenser för gener från nukleotid och uttryckt sekvens taggade (EST) databaser. För att underlätta protein kan visualisering och analys av uttrycksnivåerna, fusion till grönt fluorescerande protein (Gfp) eller en annan lämplig fluorescerande tagg önska i strategin kloning. - Sätt den kodande sekvensen av genen av intresse i regionen för flera kloning i pIVT med en validerad kloning strategi. En detaljerad beskrivning av molekylär kloning och steg som krävs har tidigare varit beskrivs 12.
Obs: Om en gen-fusion produkt ska genereras, vara säker på att kloning är i ramen korrekt tolkning. - Sekvens den konstruktionen med globinzinkinsulin primers för att säkerställa rätt gen införande, rätt i-frame fusion och att ingen polymeras-inducerad punktmutationer skapades.
Obs: Om Sanger DNA sekvensering utrustning inte är tillgängliga, många företag erbjuder låg kostnad alternativ för DNA-sekvensering. - Mutagenize DNA om genererar enda nukleotid polymorfismer (SNP) eller infogningar/strykningar (INDELS). DNA mutagenes beskrivs steg 1.5-1.7 nedan. För vildtyp konstruktioner, Fortsätt med linearisering steg 1,7.
- Utforma mutagenes primers och slutföra mutagenes PCR-reaktionen för att generera mutant konstruera per tillverkarens protokollet. PCR-medierad webbplats riktad mutagenes har funnits tidigare beskrivna 13. Dessutom erbjuder många företag webbplats riktad mutagenes kit som inkluderar protokoll.
- Omvandla mutagenized DNA till bakteriell värd. Isolera och rena plasmid.
Obs: Många företag gör kit som kan användas för att enkelt isolera och rena plasmid DNA. Följ tillverkare protokoll med detta. Om du använder en gramnegativa bakteriella stam såsom E. coli, är det rekommenderat att använda ett kit som tar bort endotoxiner. - Sekvensera isolerad DNA från bakteriell transformants med standard Sanger DNA-sekvensering för att bekräfta önskat SNP eller DITSATTA.
- Linjär slutprodukterna använder enda restriktionsenzym rötning av renade DNA.
Obs: PIVT vektorn innehåller flera singel-enzym skär webbplatserna i plasmiden kartan på Addgene 14. - Se till att produkten är linjär via agaros gelelektrofores. Metoden för agaros gel-elektrofores har tidigare varit definierad 14.
Obs: För alla återstående stegen, använder du barriär (filter) Pipettera tips och RNase-gratis material för att säkerställa produktionen av stabil, hög kvalitet RNA. - Rena smält produkten med ett validerat DNA sanering protokoll eller kit och eluera i 30 µL RNase/DNAS-gratis vatten.
Obs: Kiseldioxid-matrix spin kolumn-baserade kit rekommenderas för hög kvalitet, renade DNA. Följ tillverkare protokoll med detta. - In vitro transkribera DNA med T7 polymeras efter tillverkarens protokollet.
- Rena och eluera RNA i 30 µL RNase/DNAS gratis vatten med en kvarts-matrix spin kolumnbaserade nukleinsyra rening kit efter tillverkarens protokollet.
- Utför denatureringen agaros gel-elektrofores med formaldehyd för att bekräfta den slutliga RNA produkt storleken. Se nedanstående 14steg 1.13-1,22. (Figur 1).
- Förbereda gel genom uppvärmning i 72 mL agaros som 1 g vatten tills upplöst, sedan svalna till 60 ° C.
- Förbereda 10 X moppar kör buffert genom att lägga till 0,4 M moppar (pH 7,0), 0,1 M natriumacetat och 0,01 M EDTA.
- Tillsätt 10 mL 10 X moppar kör buffert och 18 mL 37% formaldehyd (12,3 M) till kyls agaros lösningen.
- Kast gelen genom att hälla agaros lösningen i en gelbildande behållare. Använd en kam som är stor nog att rymma 10 µL. När gelen har ställt och är fast vid beröring, ta försiktigt bort kammen.
- Montera gelen i elektrofores behållaren och tillsätt tillräckligt 1 X moppar kör buffert, säkerställa gelen är helt täckt.
- Förbereda RNA-prov genom att lägga till 1 µg RNA 0,5 X mängder formaldehyd-innehållande lastning färgämne.
- Lägga till etidiumbromid i RNA lösning med en koncentration på 10 µg/mL.
- Denature RNA provlösningen vid 70 ° C i 5 min.
- Använda sterila, 10 µL filter tips, Ladda 5 µL molekylvikt markör och 5 µL RNA provexemplaren i separata brunnar i gelen och electrophorese vid 5 V/cm tills färgen har migrerats minst två tredjedelar av längden av gelen.
- Visualisera RNA i gel på ett UV trans illuminator. Säkerställa RNA är rätt storlek genom att jämföra molekylvikt markören.
- För att mäta koncentrationen och renheten av RNA, överföra 1,2 µL av renat RNA med hjälp av steril 10 µL filter tips på en UV-spektrofotometer.
Observera att hög kvalitet RNA bör ha absorbansen nyckeltal A260/280 (1,8-2,2) och 260/230 (> 1,7) respektive. - Med 10 µL filter tips, alikvotens återstående renat RNA till sterila 0,5 µL centrifugrör (3-5 µL/rör). Förvara rören vid-80 ° C tills redo för Mikroskop.
Obs: En sista injektionen koncentration av 500 ng/µL är en optimal utgångspunkt. Det rekommenderas att späda ut RNA 1:2 i RNase gratis H20 före Mikroskop att minska klibbighet av RNA i Mikroskop pipett.
2. Kinetochor-mikrotubulära bifogad analys
- Dela oocyter i lika grupper för Mikroskop.
Obs: Äggcellen insamling, överföring, Mikroskop och meiotiska mognad har beskrivits i detalj i JoVE tidigare 15. - Microinject en grupp med experimentella mRNA och den andra grupp(er) med WT kontroll och PBS eller Gfp mRNA.
Obs: 500 ng/µL är den rekommendera injektion koncentrationen till att börja med 10. En picoinjector kan användas för att styra injektion belopp. En injektionsvolym om 5-10 pL rekommenderas 15. - Använda en hand eller mun manövrerade pipettering apparater där glaset Pipettera öppning är något omfattas större än diametern på en äggcell (100-150 µm), överföring oocyter in en 100 µL droppe milrinon-fri odlingsmedium i en petriskål i embryo kvalitet mineralolja och inkubera oocyter för 7 h vid 37 ° C i 5% C02 tillåta tillräcklig mognad till metafas av meios jag (träffade jag) 15.
- Efter inkubation, använt samma pipett apparatur som ovan, överföra oocyter i en center-väl orgel kultur maträtt som innehåller 700 µL före kylda minsta nödvändiga media (MEM) samling medium i stadens väl och 500 µL H20 i utanför ringen och Placera skålen på is för 7 min.
Obs: Det rekommenderas att före chill MEM media och centrera väl orgel kultur rätter vid-20 ° C i minst 20 min innan behandling av oocyter. - Fixa oocyterna genom att överföra dem med pipett apparaten i en bra klarglas spot platta innehållande 400 µL av 2% PARAFORMALDEHYD i 1 X PBS i 20 min i rumstemperatur.
- Använder samma Pipettera apparater, överföra oocyterna till en annan brunn på en plats tallrik innehållande 400 µL blockerande lösning (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3) och butik vid 4 ° C tills det att bearbeta för immunfärgning.
Obs: för att lagra oocyter vid 4 ° C, spot cover glasplatta med parafilm att förhindra avdunstning. - Använder samma pipett apparatur, överföring oocyter till en ny brunn på en plats tallrik innehållande 400 µL permeabilisering lösning (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3) och inkubera i rumstemperatur i 20 min. Transfer oocyter snabbt genom tre droppar av 400 µL blockerande lösning för att ta bort eventuella kvarvarande tvättmedel.
Obs: En 9-väl klarglas spot plattan fungerar bra för rörliga grupper genom flera behandlingar på en enda maträtt (steg 2,4-2,5). - Utför resterande immuncytokemi procedurer i en fuktig kammare, skyddade från ljus vid rumstemperatur. Använd en medelstora plastbehållare fodrad med fuktiga och täck med aluminiumfolie.
- Använda pipetten apparaten, överföra oocyter till 30 µL blockerande lösning på locket till en plattan med 96 brunnar och plats inom den befuktade kammaren i 10 min.
Obs: Droppar är placerade i de runda fördjupningar på plattan. - Etikett centromerer och spindel, med hjälp av pipett apparaten, överföra oocyter till 30 µL blockerande lösning innehållande anti centromeric antigen (ACA, Crest) (1:30) och anti-acetylerade tubulin (1: 1000) och inkubera i minst 1 h.
- Skölj oocyter genom att överföra genom tre 30 µL droppar blockerar lösning för 10 min varje.
- Med hjälp av pipett apparat, överföring oocyter till en 30 µL släpp av blockerande lösning innehållande sekundära antikroppar avgiftsfritt till de antikroppar som används ovan (anti-humant IgG 1: 200, antimus IgG 1: 200) och inkubera i 1 h.
- Upprepa 3, 10-min skölja stegen i 30 µL blockerande lösning som beskrivs i steg 2.11.
- Överföra oocyterna, med hjälp av pipett apparat, in 3-5 µL montering medium innehållande DAPI (5,9 µg/µL) på ett glas objektglas.
- Placera 4 små droppar (storleken på en pin huvud) vaselin på hörnen av cover slip förhindra krossning av oocyterna.
- Placera försiktigt täckglas vaselin sidan ner in i bilden.
- Försegla täckglas kanterna med Rensa nagellack och låt torka i 5 min.
- Lagra bilder vid 4 ° C, skyddas från ljus, tills behandling via konfokalmikroskopi.
Observera: Kontrollera brytningsindex för monteringsmedium och täckglas, matcher Mikroskop målen tas tillvara. Rekommenderas montering material tidigare har beskrivit 15. - Bild oocyter med ett 40-63 x-objektiv på en confocal Mikroskop, att fånga små steg (≤ 1 µm) i z-planet, optimerad för arbetande mål och bild hela regionen av metafas spindeln.
Obs: Se till att bilden alla 3 kanaler baserat på specifika sekundära antikroppar används i steg 2.11. Bild i genomsnitt ≥ 4 och en zoom på 3 är idealiska för tillräcklig upplösning. En 1 µm stegstorlek ger tydlig visualisering av mikrotubuli och kinetochores i mus oocyter. Förfarandet för Bildinsamling varierar från Mikroskop till Mikroskop. Hänvisas till tillverkare confocal användarhandboken för specifika anvisningar om hur du konfigurerar inställningar för Mikroskop. - Identifiera Kinetochor-mikrotubulära fastsättning status med hjälp av avbildningsprogrammet efter steg 2.21-2,23 nedan.
Obs: Följande steg beskriver proceduren med bild J (NIH) gratis nedladdningsbar programvara, dock alternativa bildhanteringsprogram kan användas. Bifogad fil status typer tidigare har definierat 16 . - Öppna bild genom att dra filen till bild J verktyg bar.
- I den öppna z-serien, göra alla kanaler synliga (DNA, Kinetochor och spindeln) genom att klicka på ”Lägg samman kanaler”, i ”bild” drop-down menyn, under fliken ”färg” sub.
- Använda växlingsknappen längst ned på bilden, flytta genom varje z-skiva och avgöra Kinetochor mikrotubulära fastsättning. Detaljerade fastsättning beskrivningar har varit tidigare beskrivs 16
3. kromosom justering utmaning Assay
- Med pipett apparaten enligt beskrivningen i steg 2,3, överföra oocyter in en 100 µL droppe milrinon-fri odlingsmedium under olja och inkubera oocyter för 7 h att tillåta tillräcklig mognad till metafas av meios jag (träffade jag) som tidigare beskrivs i steg 2,3 17 .
Obs: Äggcellen insamling, Mikroskop och mognad förfaranden skisserades tidigare 15. Se bifogad fil assay protokollet i steg 2.1-2.2 för kontroller och för RNA Mikroskop koncentrationer. - Använder samma pipett apparatur, överföring oocyter till en center-väl orgelkultur maträtt innehållande 700 µL odlingsmedium som innehåller monastrol [100 µM] i center väl och 400 µL H20 i omgivande ringen och inkubera vid 37 ° C i 2 h.
- Skölj ur monastrol genom att överföra oocyter, med hjälp av pipett apparaten som ovan, genom tre droppar 100 µL CZB odlingsmedium, och sedan överföra oocyterna till en ny center-väl orgel kultur maträtt som innehåller 700 µL odlingsmedium + MG132 [5 µM] för 3 h i mitten Ring. Lägga till 400 µL H20 utanför ringen.
- Fixa oocyterna genom att överföra dem, med hjälp av pipett apparaten, i en bra klarglas spot platta innehållande 400 µL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 min i rumstemperatur.
- Efter fixering, överföra oocyterna, använder pipetten apparaten, in i en ny brunn klarglas spot platta innehållande 400 µL blockerande lösning och förvaras vid 4 ° C tills bearbetas för immunfärgning.
Obs: för att lagra oocyter vid 4 ° C, spot cover glasplatta med parafilm att förhindra avdunstning. - Permeabilize och etiketten oocyter via immuncytokemi enligt beskrivningen i steg 2,6-2,16.
- Bild oocyter använder en 40-63 x-objektiv på en confocal Mikroskop, fånga < 1 µm steg i z-planet att göra säker på att bilden metafas spindeln hela regionen.
- För att identifiera kromosom justering status öppna bildfiler med programvara för bildåtergivning.
Obs: Följande steg beskriver proceduren med bild J (NIH) gratis nedladdningsbar programvara, dock alternativa bildhanteringsprogram kan användas. - Dra bilden till bild J Kontrollpanelen.
- I öppnade z-serien, Använd verktyget punkt (tillgänglig genom att klicka på ikonen punkt verktyget på bild J reglagelisten) att markera punkter i slutet av varje spindel pole i deras respektive z-segment genom att placera verktyget över spindeln staven i bilden och klicka på bilden. Lägga till dessa punkter i regionen av intresse (ROI) manager genom att trycka på kommando + t på tangentbordet.
- Fastställa specifika koordinater för var och en av de positioner som angetts i steg 3.10 genom att markera den specifika punkten i ROI manager och klicka på knappen åtgärd. Detta kommer att ge ett resultat som innehåller tabell x- och y-koordinaterna för varje punkt. Dessa kommer att vara punkterna som X1, Y1, och X1, Y2, respektive.
- Nästa, bestämma den sant Z-koordinaten. Detta görs genom att multiplicera antalet segment för den specifika z-slice i z-stacken där spindeln pole identifierades (dvs skiva #2 av 6) som varje enskild punkt i av stack tjocklek (dvs. 1 µm) (exempel: skiva 2 x 1 µm = 2). Dessa kommer att vara de Z1 och Z2 punkterna respektive.
- Bestämma spindeln längd med hjälp av Pythagoras sats ekvation (en2 + b2 = c2) använder den tidigare definierade x, y och z koordinater från trappan 3.11-3.13. För varje spindel är slutliga längd lika med:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Bestämma den spindeln midzone. Det beräknas som hälften längden på spindeln. Linjeverktyget i bild J genom att klicka på ikonen i verktygsfältet Bild J, rita en linje som är från en spindel pol till den spindeln midzone. Längden kommer att visas på verktygsfältet Bild J.
- Bestämma kromosom Justeringsstatus genom att bedöma kromosom avstånd från den spindeln midzone använder verktyget linje mätning. Med linjeverktyget tillgängliga genom att klicka på ikon i verktygsfältet Bild J, rita en linje från den spindeln midzone kromosomen. Längden kommer att visas på verktygsfältet Bild J. Kromosomer som är större än 4 µm från den spindeln midzone anses oordnad (unaligned) 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter in vitro- har transkription högkvalitativa RNA ett A260/A280-förhållande på (1,8-2,2) och ett A260/A230 baserat ≥1.7 mätt med en spektrofotometer. Bilden i figur 1 visar migreringen av in vitro-producerade RNA på en denatureringen agarosgel efter elektrofores. Ett band som är insmorda i mönster eller ett prov som har flera stora band kan indikera kontaminering eller nedbrytning av provet. Alternativt, flera band kan indikera att mRNA inte är fullständigt denaturerat eller start plasmiden var inte helt linearized. MRNA kommer köra större än förväntat på grund av poly-adenylated svansen inbyggd i pIVT, som tillåter stabil uttryck av mRNA in vitro. Efter Mikroskop rekommenderas att säkerställa enhetlig injektionsvolymer och uttrycksnivåerna via fluorescerande mikroskopi. Bilden i figur 2 visar profas jag-arresterad oocyter enhetligt injiceras med Gfp. Konsekvent Mikroskop teknik är avgörande för detta protokoll. Bild analys programvara, till exempel bild J, kan användas för att validera uttrycksnivåerna för att säkerställa enhetlighet och behärskning av tekniken. Observera att subcellulär lokaliseringsinformation kan erhållas medan du gör av imaging för båda analyser. För alla Mikroskop försök att bedöma effekterna av en Genvariant, ska vildtyps-genen injiceras i en delmängd av oocyter att fungera som en kontroll. Detta tillåter en till kontroll för potentiella överuttryck fenotyper av den mänskliga genen i en mus äggcellen. PBS, eller Gfp för fluorophore-märkt konstruktioner, bör också injiceras i en undergrupp av oocyter för Mikroskop-inducerad fenotyper. För konstruktioner utan en fluorescerande tagg kan Gfp mRNA Co injicerade att säkerställa tillräcklig Mikroskop. Om samtidig injicera två eller flera konstruktioner samtidigt vara säker på att öka mRNA koncentrationen så att den slutliga lösningen innehåller 500 ng/µL av varje mRNA.
Kalla-stabil mikrotubulära analysen ger ett värdefullt verktyg för bedömning av fastsättning av kinetochores till mikrotubuli. Figur 3 är en z-projektion av en confocal Mikroskop bild av en metafas I äggcellen. Detta äggcellen utsattes för kallt media behandling till depolymerize alla mikrotubuli som inte hade kopplade till kinetochores. Oocyter som har behandlats för en otillräcklig tid kommer att innehålla mikrotubulära fibrer inte kopplade till kromosomerna (för kort resulterar i alltför många fibrer) eller brist på fibrer tillsammans (för lång resulterar i ingen spindel struktur) och det är rekommenderat att dessa oocyter inte användas i analysen. Vid metafas av meios jag det är vanligt för oocyter innehålla okopplade eller sido monterad kinetochores, det rekommenderas därför att en kontrollgrupp användas i någon bifogad fil studie. I genomsnitt vildtyp oocyterna kommer innehålla 5-10% av kinetochores på MI kommer inte ännu vara stabilt bifogade 19. Det är viktigt att alla oocyter i samma skede för analys av Kinetochor-mikrotubulära fastsättning status. För att säkerställa att experimentell och kontrollerar grupper mogen med liknande tidsskalor det är rekommenderar att bedöma cellcykeln kinetik. För att utföra denna analys, bör en delmängd av kontroll och experimentella oocyter mognat och visualiseras live under time-lapse microcopy. Användning av milrinon tillåter oocyter som ska synkroniseras i profas av meios, sådan att utsättning i media saknar milrinon med tillåta återupptagandet av meios vid samma tid 20. Oocyter från både kontroll och experimentella grupper bör pressa en polar kropp, vägledande nå metafas av meios II (träffade II), liknande tidpunkter. Om live-cell mikroskopi inte är tillgänglig, oocyter kan vara mognat till Met jag (7 h) och träffade II (16 h), fixeras och färgas att upptäcka DNA och mikrotubuli som tidigare beskrivits. På Met I och träffade II en tunnformad, bipolär spindel bör vara synlig. I kontroll oocyter anpassas kromosomer vid metafas plattan. Anpassningen av kromosomer kommer att variera i experimentella grupper beroende på variant påverkar, dock kromosomerna ska kondenseras och bifogas mikrotubuli med majoriteten av kromosomer centralt på spindeln. Ett liknande antal äggceller bör ha nått meios II i kontroll och experimentella grupper. För att minska svårigheterna att fastställa fastsättning optimerad status rekommenderas imaging oocyter med små steg i z-planet, för det särskilda målet arbetar. Analys kommer att involvera visning z-skivor individuellt och i sammanslagna inställningarna för att avgöra vilken pol som kopplade mikrotubuli härrör från. Figur 3B visar exempel på onormal Kinetochor-mikrotubulära bilagor. Visas är en tvåvärd i vilken endast en syster Kinetochor par är kopplad till en spindel mikrotubuli, definierat som en ingen bifogad fil. Därefter visas en syntelic fastsättning i vilka båda syster Kinetochor par är kopplade till samma spindel Polen. Slutligen en merotelic bifogad fil visas i som en syster Kinetochor är knuten till både spindel polacker medan andra syster Kinetochor i paret är kopplad till en enda spindel stolpe.
Bilderna i figur 4 illustrerar de progressiva förväntade DNA och spindel konfigurationer som ett drag med kromosomen justering utmaning analysen. I denna analys är det viktigt att olika experimentella grupper framsteg genom meios med liknande kinetik. Som beskrivits tidigare är det rekommenderar för att slutföra cellcykeln kinetik analyser innan utmaningen analysen. I denna analys bedöms förmågan för oocyter framgångsrikt korrigera onormal Kinetochor-mikrotubulära bilagor. För att testa detta, oocyter är först mognat till Met I till tillåta Kinetochor-mikrotubulära bilagor upprättas. Nästa, oocyter inkuberas i monastrol och Kinesin 5 (EG5)-hämmare, som kollapsar bipolär spindeln i en monopolär spindeln 21. Generering av en monopolär spindel inducerar 100% Felaktiga mikrotubulära-Kinetochor bilagor. Den monastrol-hämmaren sedan tvättas ut för att tillåta återhämtning. Under återhämtningsperioden oocyterna regenerera en bipolär spindel och försöka rätta till mikrotubuli bilagor. Tillägg av proteasomhämmare MG132 förhindrar Anaphasen debut. Som en kontroll, en liten delmängd av oocyter från varje experimentella gruppen kan fastställas i varje skede i protokollet (träffade jag, monastrol behandlas, bokför återhämtning) att säkerställa att alla grupper svarar på behandlingar, och i samma utsträckning. Metafas jag oocyter bör innehålla en tunnformad bipolär spindel med kromosomer justerade vid metafas plattan. Oocyter som behandlats med monastrol bör innehålla en monopolär spindel med kromosomer orienterade kring enpoliga. Återvunna oocyter bör återigen innehålla en tunnformad bipolär spindel. Kromosom justering definieras som alla kromosomer fler än 4 μM av spindeln midzone 22. Det är bra att färga oocyter för att upptäcka DNA och kinetochores för att fastställa om båda kinetochores är utanför denna centrala zonen eftersom detta kan vara svårt att avgöra använder endast DNA-detektering.
Figur 1. Denaturingagarose gel-elektrofores av RNA. RNA kvalitet och storlek kan bedömas genom elektrofores på en denatureringen agarosgel. En denatureringen gel rekommenderas att förhindra sekundära strukturerabildandet. Lane 1 innehåller RNA molekylvikt markör. Lane 2 är ett RNA-prov. Observera att RNA kommer köra större än beräknat på grund av den inbyggda polyA svansen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Validera äggcellen Mikroskop. Fluorescerande mikroskopi kan användas för att validera framgångsrika äggcellen Mikroskop och uttryck. Profas jag-arresterad oocyter microinjected med Gfp visas efter övernattning uttryck för konstruktionen. Denna bild erhölls med Invitrogen EVOS FL Auto imaging system utrustade med GFP ljus kub. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Att bedöma Kinetochor-mikrotubulära bilagor. (A) A representativa z-projektion av en kall-behandlade träffade jag äggcellen. Spindeln (grön), kinetochores (röd) och DNA (blå) visas. Rutan anger regionen av optisk zoom. Pilspetsar betecknar slutet-på bilagor av kinetochores till mikrotubuli av en enda tvåvärd. Skalstapeln är 10 µm för spindel, Kinetochor, DNA och Lägg samman kanaler. Skalstapeln för optisk zoom är 5 µm. (B) exempel på onormal Kinetochor-mikrotubulära filtyper i mus oocyter. Pilarna anger Kinetochor-mikrotubulära fastsättning platser. Skalstapeln är 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Kromosom justering utmaning assay. Översikten av förfarandet med representativa z-projektionerna av oocyter vid varje steg. Oocyter är först mognat till metafas av meios jag (träffade jag), överförs sedan till en ny maträtt som innehåller monastrol för 2 h att framkalla monopolär spindeln bildas. Nästa oocyter får återhämta sig i mognad medium kompletteras med en proteasom-hämmare (MG132) att förhindra Anaphasen debut för 3 h. En gång återvunna oocyter är fast, märkt för spindeln (grön), kinetochores (röd) och DNA (blå) och avbildas via konfokalmikroskopi att fastställa Justeringsstatus. Linjerna anger längden på spindeln (40 µm) och spindel midzone (20 µm) fastställs med hjälp av Pythagoras sats ekvation. Pilarna anger punkt verktygspositioner på varje stolpe. Någon kinetochores > 4 µm från den spindeln midzone anses oordnad (unaligned). Asterisken anger rundbordsvridning kromosom (5,6 µm från midzone). Skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av den snabba och ökande identifieringen av mänskliga genetiska varianter som är associerade med sjukdomen, är det viktigt att system inrättas för att utvärdera deras biologiska betydelse. Förståelse proteinfunktion i mänskliga meios utgör särskilda utmaningar eftersom mänskliga äggceller är dyrbara inte och sällsynta och mänskliga spermier kan bli föremål för genetisk manipulation. Mus oocyter är ett däggdjur modellsystem som är värdefull för att bedöma mänskliga meiotiska gener funktion 10,23. Denna modell kringgår impracticalities med att använda mänskliga ägg samtidigt som en lättillgänglig källa av låg kostnad, bökbart oocyter som genomgår meios liknar mänskliga könsceller medan att vara användbara för att förstå hur genetiska varianter kan påverka kvinna fertilitet.
Eftersom dessa metoder anställer ektopisk uttryck för det mänskliga proteinet i mus oocyter via Mikroskop, är det viktigt att först upprätta en koncentration av kontroll, vildtyps-RNA som inte ändrar meiotiska mognad. Det rekommenderas att meiotiska mognad kinetik är övervakas (nuclear envelope nedbrytning, polar kroppen extrudering) i kontroll oocyter att upprätta baslinjen parametrar och bedömningen av spindeln och kromosom morfologi. Dessutom att säkerställa enhetlig Mikroskop volymer är kritisk till jämförelsen mellan grupperna. Inklusive en fluorescerande tagg på genen av intresse kan förenkla denna tekniska utmaning. Tekniker för mastering äggcellen Mikroskop har tidigare visats 15. Visualisering av injicerade oocyter under fluorescens Mikroskop eller bestämma proteinuttryck via western blot är också värdefulla verktyg för att bekräfta förenlig injektion koncentrationer.
Eftersom fel i kromosomsegregering i däggdjur oocyter är en ledande orsak till embryonala aneuploidi och graviditet förlust5, analys av Kinetochor-mikrotubulära bilagor ger ett värdefullt verktyg för att bedöma en gen av intresse påverkar kromosomsegregering (dvs felaktig bilagor kommer att orsaka felaktig segregation). En 10 min exponering för kylda media räcker att depolymerize mikrotubuli som inte gjort en Kinetochor-mikrotubulära fastsättning, möjliggör visualisering av stabil bilagor via konfokalmikroskopi 24. För denna analys är det viktigt att inte alltför chill oocyterna eftersom detta kommer att leda till depolymerization av stabil mikrotubuli. Optimering av färgning förfaranden är dessutom nyckel för visualisering av Kinetochor och mikrotubuli strukturer. Att säkerställa tillräcklig upplösning för analys, små steg (≤ 1 μm) i z-planet med en 40 x-63 x mål bör fångas och inhämta bilder genom hela spindeln strukturen att säkerställa alla bilagor är synliga. Observera att det är vanligt att ha lös kinetochores under metafasen av meios jag 25.
Kromosom justering utmaning analysen är användbart för utvärdering av vinst eller förlust-av-funktion varianter. Gain-of-function varianter kan vara svårt att bedöma eftersom musen oocyter från unga kvinnor har låga nivåer av aneuploidi. Denna analys övervinner detta hinder genom att skapa en situation där äggcellen måste korrigera experimentellt inducerad Felaktiga Kinetochor-mikrotubulära bilagor. Att fastställa en tidpunkt där kontroll oocyter innehåller 1-2 feljusterade kromosomer efter recovery erbjuder en kvantifierbar scenario för att fastställa huruvida en mutant ger ökad anpassning effektivitet (dvs bättre anpassning funktioner kommer skydda euploidy). För kvantifiering av kromosom feljustering, en tidigare etablerat protokoll i vilka kromosomer som är större än 4 μm från spindeln midzone karaktäriseras som oordnad (unaligned) kan vara begagnade 18.
För att studera förlust-av-funktion varianter, är ytterligare experimentella villkor nödvändiga på grund av den endogena homolog inom studie-systemet. Ett sätt att lindra detta problem är att använda eller generera en knockout musmodell av varianten av intresse. Tillkomsten av det skarpare/Cas9-systemet kan ge ett snabbt sätt att generera sådana knockouts 26. Alternativt om en knockout modell inte är ett alternativ, kunde klassisk knockdown tekniker såsom Co injicera morpholino antisense oligonukleotider eller små störande RNAs användas. Dock krävs uppmärksamhet sekvens design eventuella störningar med den microinjected varianten under studien. Exempelvis kunde den morpholino oligonukleotiden utformas att binda till 5' oöversatta regionen (5' UTR) av mus genen som inte ingår i den mänskliga mRNA-variant som förs in via Mikroskop. Om du använder små störande kunde RNAs en rikta en icke-homologa sekvensen region eller införa tyst punktmutationer i den mänskliga genen som skulle undgå inriktning. Dock kan har det kroppsegna protein exemplaret fortfarande närvarande vid uttryck av variant vara informativ som många varianter finns i tillståndet heterozygot i det mänskliga genomet.
Slutligen, även om inte beskrivs i detta protokoll, kromosom aneuploidi bedömning kan lätt bedömas i träffade II ägg som slutliga analysen i pipeline för analys av det mänskliga variant. En detaljerad beskrivning av detta i situ kromosom sprida protokoll har tidigare beskrivit 15. Sammanfattningsvis är microinjected oocyter mognat i vitro tills de når träffade II scenen, efter behandling med en meiotiska spindel-depolymerizing agent före fixering. Kinetochor och kromosom färgning som beskrivs här ger bedömningen av kromosom innehåll.
Medan musen oocyter ger ett värdefullt verktyg för studier av proteiner avgörande till kvinnliga meios vissa begränsningar för den modellen finns. Överuttryck av proteiner kan störa meiotiska mognad och därför en RNA-koncentrationen inte kan existera som inte inducerar en fenotyp. Endogena mus homolog kan dessutom störa lokalisering av exogena humant protein. Generationen av knockout musmodeller ger en lösning på problemet; Detta kan dock inte vara genomförbart i alla situationer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att bryter ned proteinet mus genom samtidig injektion av RNAi eller morpholino oligonukleotider avsedd att inte målet den exogena RNA och protein. Slutligen är det viktigt att notera att medan många proteiner är homologa mellan människa och mus, det kan förekomma skillnader, vilket leder till skillnader i lokalisering och funktion som kunde hindra denna typ av cross-arter analys. Som genetisk manipulation verktyg som Cas9-genomet redigering27 blivit billigare och mer alldaglig, kan detta protokoll utvecklas till att göra inpressning, humaniserad mus linjer i stället för att förlita sig på Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett forskningsanslag från American Society for Reproductive Medicine och från Charles och Johanna Busch Minnesfond på Rutgers, The State University NJ till K.S. A.L.N. stöddes av ett bidrag från N.I.H. (F31 HD0989597).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
